Soutenance mémoire
FONCTIONNEMENT TECHNIQUE DU LABORATOIRE POUR LE DIAGNOSTIC DES MALADIES A POTENTIEL EPIDEMIQUE
Diagnostic au laboratoire de la méningite cérébro- Spinale
Recueil et transport des échantillons
Technique de prélèvement du liquide céphalo-rachidien
Le prélèvement se fait par ponction lombaire pratiquée sur un malade assis fortement penché en avant ou placé en décubitus latéral, le dos rond chez le malade confus. Après désinfection soigneuse à l’alcool iodé de la zone de ponction ainsi que des mains de l’opérateur, l’aiguille à ponction munie de son mandrin est introduite entre la 4ème et 5ème vertèbre lombaire puis enfoncée de façon parfaitement médiane et droite mais légèrement vers le haut . L’opérateur ressent une certaine résistance qu’ il force. On retire le mandrin et on laisse couler le liquide dans trois tubes pour étude cytologique, chimique, et bactériologique. L’aiguille est ensuite retirée et l’on demande au malade de rester allongé pendant une heure.
Transport au laboratoire
Le liquide céphalo-rachidien ( LCR ) prélevé est transporté à l’abri des rayons solaires et en évitant les écarts thermiques au laboratoire, pour être examiné le plus tôt possible. Si l’examen doit être retardé de plusieurs heures , le LCR sera incubé à 37°C . Si le transport au laboratoire est impossible le même jour, le LCR sera inoculé aseptiquement à la seringue dans un milieu Trans-Isolate ( T-I ) qui est un milieu de culture, de conservation et de transport .
Traitement du LCR
Etude cytologique
On effectue d’abord une numération leucocytaire avec la cellule de Nageotte. On retrouve le plus souvent 1000 à 2000 leucocytes/mm3 . On établit ensuite une formule leucocytaire après centrifugation du LCR. On réalise alors un frottis coloré au May Grunwald Giemsa. Ce frottis révèle une hyperleucytose avec une forte prédominance de polynucléaires neutrophiles altérés.
Etude chimique
La gamme de Mastrezat est utilisée pour le dosage du taux d’albumine dans le LCR. On retrouve en cas de méningite à méningocoque des valeurs supérieures à 3 g d’albumine/l pour l’enfant et l’adulte et supérieures à 0,8 g/l chez le nourrisson. La glucorachie est fortement abaissée ( 0,2 à 0,3 g/l ), s’accompagnant d’une acidose du LCR .
Etude bactériologique
➤ Examen macroscopique
On note l’aspect du LCR comme suit : clair, trouble, purulent, xanthochromique, hématique. Dans les méningites à méningocoque, le LCR est habituellement trouble.
➤ Examen microscopique
– Examen à l’état frais : Une goutte du LCR est examinée au microscope entre lame et lamelle à la recherche de leucocytes, érythrocytes, bactéries, levures.
– Examen d’un frottis coloré au Gram : Le frottis est examiné au microscope à l’objectif à immersion ( x100 ), ce qui permet d’observer les agents microbiens. Neisseria meningitidis est présent dans les polynucléaires et a l’aspect de diplocoque à Gram négatif en grain de café intra ou extracellulaire de taille régulière d’environ 0,8 microns de diamètre.
➤ Culture
Neisseria meningitidis pousse sur gélose au sang et sur gélose chocolat. Après ensemencement, les boîtes de gélose sont incubées à 37°C sous atmosphère riche en CO2.
➤ Diagnostic de certitude
– Test de l’oxydase de KOVACS
Il permet de mettre en évidence une cytochrome oxydase. Ce test se fait à partir de colonies obtenues sur gélose au sang. Ce test est positif lorsqu’apparaît une coloration violette dans les 10 secondes. N. meningitidis donne une réponse rapidement positive.
– Recherche d’antigènes solubles
Elle fait appel à plusieurs techniques :
• L’agglutination au latex : Les sérogroupes A ,B,C,W135 et Y qui sont les plus fréquemment isolés au cours des méningites à méningocoque peuvent être identifiés grâce à des particules de latex sensibilisées. Ce test s’effectue avec le surnageant de centrifugation du LCR chauffé pendant 5 minutes au bain-marie. Une réaction positive se traduit par une agglutination donnant l’aspect d’amas de poussière dans les 2 minutes qui suivent l’opération.
• La technique de co-agglutination : On utilise un support particulaire à base de staphylocoque porteur de protéine A sur lequel sont fixés les anticorps.
• La contre-immunoélectrophorèse : Elle utilise la diffusion à contre sens des polysaccharides méningococciques et des anticorps dans un gel d’agarose soumis à une différence de potentiel.
• La technique Elisa : Elle est très sensible mais de réalisation lourde (appareillage, temps )
• La technique radio-immunologique ( R I A ) Ces moyens de diagnostic rapide ont un triple intérêt :
* Palier à l’insuffisance du diagnostic direct du fait du caractère paucimicrobien de la méningite à méningocoque.
* Diagnostiquer la méningite même décapitée par une antibiothérapie.
* Effectuer la surveillance épidémiologique dans les zones à risque épidémique dépourvues de laboratoire.
– Utilisation des glucides
L’étude de l’utilisation des glucides sert à compléter l’identification d’une souche de N. meningitidis. Différents sucres sont ajoutés à une base gélosée Cystine-Trypticase Agar(CTA). Pour confirmer l’identification de N. meningitidis, on utilise une série de 4 tubes dont chacun contient un sucre ( glucose, maltose, lactose et saccharose). N. meningitidis oxyde le glucose et le maltose mais pas le lactose ni le saccharose.
➤ Etude de la sensibilité
Les souches épidémiques de N. meningitidis sont habituellement sensibles aux antibiotiques suivants : ampicilline, ceftriaxone, chloramphénicol.
Diagnostic au laboratoire de la dysenterie bacillaire
Recueil et transport des échantillons
Le prélèvement doit être fait de préférence au début ou à la phase aiguë de la maladie avant toute antibiothérapie.
Technique de prélèvement
– Prélèvement de selles : A partir de matières fécales émises dans un récipient propre, on prélève à l’aide d’une spatule quelques grammes de selles que l’on introduit dans un flacon stérile. Dans les diarrhées très liquides, le recueil sur papier filtre est possible.
– Ecouvillonnage rectale : Il est mieux indiqué chez l’enfant et le nourrisson. On humidifie l’écouvillon dans un milieu de transport stérile puis on l’introduit dans le sphincter rectal sur 2 à 3 cm, tourner et retirer ensuite. Vérifier la trace de matière fécale sur l’écouvillon puis l’insérer immédiatement dans le milieu de transport réfrigéré.
Transport au laboratoire
Si le laboratoire est à plus de 2 heures du lieu de prélèvement, il est indispensable d’utiliser un milieu de transport comme le milieu Cary-Blair.
Traitement des échantillons de selles
Examen macroscopique
Les selles dysentériques sont généralement glaireuses, sanguinolentes, parfois muco-purulentes. Elles peuvent cependant être pâteuses ou liquides.
Examen microscopique
– Examen à l’état frais : Il permet de déceler la présence de polynucléaires, d’hématies, ainsi que la prédominance de bacilles immobiles.
– Examen après coloration de Gram : Il met en évidence la présence d’une flore bactérienne monomorphe à Gram négatif.
Culture
On utilise 2 types de milieux d’isolement gélosés :
– Un milieu peu sélectif : Exemple gélose Mac Conkey
– Un milieu plus sélectif : Exemple milieu XLD (Xylose Lysine Desoxycholate ) ou Hektoen. L’utilisation du milieu S.S. ( Salmonelle-Shigelle ) est déconseillée du fait qu’il inhibe la croissance de Shigella dysenteriae 1 qui est la souche épidémique. Les milieux ensemencés sont incubés à 37°C pendant 18 à 24 heures.
Identification préliminaire
Sur gélose Mac Conkey, les colonies de S. dysenteriae 1 apparaissent comme des colonies de petite taille, convexes, incolores. Sur gélose XLD , elles sont lisses et transparentes, de couleur rose ou rouge.
Diagnostic de certitude
– Test biochimiques :
* Gélose Kligler-Hajna : Généralement, shigella produit une pente alcaline (rouge) et un culot acide (jaune) ; il n’y a pas de production de gaz ni de SH2
* Mise en évidence de la mobilité : Shigella est toujours immobile
* Mise en évidence de l’uréase : Shigella est toujours uréase négative.
– Identification immunologique :
Elle est nécessaire pour identifier les souches de shigella. Elle est faite par agglutination sur lame avec des sérums polyvalents anti-antigènes O somatiques suivie dans certains cas de l’agglutination avec un antisérum monovalent pour identifier un sérotype spécifique . Un antisérum monovalent anti S. dysenteriae 1 est nécessaire pour identifier ce sérotype à potentiel épidémique.
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Table des matières
INTRODUCTION
BIBLIOGRAPHIQUES
CHAPITRE 1 : GENERALITES SUR LE LABORATOIRE DE BACTERIOLOGIE
I. ORGANISATION ARCHITECTURALE
I.1. L’installation et la répartition des locaux
I.1.1. La laverie et la stérilisation
I.1.2. Le laboratoire proprement dit
I.1.3. L’accueil et la salle de prélèvement
I.1.4. Le secrétariat
I.2. Organisation du travail
I.2.1. La laverie et la stérilisation
I.2.2. Le secrétariat
II. FONCTIONNEMENT TECHNIQUE DU LABORATOIRE POUR LE DIAGNOSTIC DES MALADIES A POTENTIEL EPIDEMIQUE
II.1. Diagnostic au laboratoire de la méningite cérébrospinale
II.1.1. Recueil et transport des échantillons
II1.2. Traitement du LCR
II.2. Diagnostic au laboratoire de la dysenterie bacillaire
II.2.1. Recueil et transport des échantillons
II.2.2. Traitement des échantillons de selles
II.3. Diagnostic au laboratoire du choléra
II.3.1. Recueil et transport des échantillons
II.3.2. Traitement des échantillons de selles
III. EQUIPEMENT DU LABORATOIRE
III.1. La laverie
III.1.1. Les appareils
III.1.2. Le matériel
III.2. La salle de préparation
III.2.1. Les appareils
III.2.2. Le matériel
III.3. Le laboratoire proprement dit
III.3.1. Les appareils
III.3.2. Matériels
III.4. La salle de prélèvement
III.4.1. Prélèvement vaginal
III.4.2. Autres prélèvements
III.5. Le secrétariat
CHAPITRE 2 : LA SURVEILLANCE EPIDEMIOLOGIQUE
I. DEFINITION
I.1. Epidémie
I.2. Surveillance épidémiologique
II. OBJECTIFS DE LA SURVEILLANCE EPIDEMIOLOGIQUE
III. ORGANISATION DE LA SURVEILLANCE EPIDEMIOLOGIQUE
IV. METHODOLOGIE DE LA SURVEILLANCE EPIDEMIOLOGIQUE
IV.1. Collecte de l’information
IV.1.1. Enregistrement des données
IV.1.2. Déclaration de l’information enregistrée
IV.2. Analyse de l’information
IV.2.1. La validation des données
IV.2.2. Synthèse des données
IV.3. Interprétation des données
IV.3.1. Etude descriptive
IV.3.2. La comparaison
IV.4. Diffusion de l’information
IV.4.1. Information des décideurs
IV.4.2. Rétro information des opérateurs
V. QUALITES DU SYSTEME DE SURVEILLANCE EPIDEMIOLOGIQUE
V.1. Capacité d’identification des cas d’épidémies
V.2. Faisabilité
V.3. Pertinence
V.4. La souplesse
V.5. La représentativité
V.6. La régularité
V.7. La ponctualité
CONCLUSION
