Développement d’un bio-capteur par imagerie SPR

Les progrès enregistrés dans la connaissance du génome humain au cours des deux décennies écoulées ont rendu possible, parmi de nombreuses autres retombées, l’analyse d’un nombre toujours croissant de gènes responsables de maladies. Parallèlement, depuis que le génome humain a été décodé, le domaine de la protéomique, qui est l’étude de l’ensemble des protéines fabriquées par les gènes, a émergé. Les protéines sont les acteurs  essentiels des mécanismes cellulaires, et leur dysfonctionnement entraîne de nombreuses maladies. Compte tenu du grand nombre de fonctionnalités qui vont devoir être criblées, le défi technologique à relever est considérable, puisqu’il s’agit de substituer à des techniques manuelles telles les analyses ELISA, et donc coûteuses, des méthodes efficaces permettant le criblage à grande échelle des variations individuelles. Le développement de systèmes ad hoc automatisés à forte capacité et haut débit, tels que les puces immunologiques, constituées par une multitude de protéines ancrées sur un support approprié, les puces à ADN ou même les puces à oligosaccharides s’impose comme une priorité.

De par l’aspect multiparamétrique de ces biopuces, ces techniques constituent un apport important à la biologie moléculaire. En revanche, souvent, il reste nécessaire de marquer les molécules cibles par fluorescence ou radioactivité afin de pouvoir les détecter, ce qui ajoute une étape au procédé et ne permet pas, de manière immédiate, le suivi de la réaction en temps réel. Le système optique que nous développons apporte des améliorations très sensibles par rapport aux systèmes classiques. En effet, il permet d’acquérir, en parallèle, sur chaque plot, la réponse cinétique des interactions biologiques mesurées et, de surcroît, sans avoir recours à des marqueurs. En d’autres termes, l’évolution des multiples interactions peut être suivie en temps réel et permet donc de mesurer les constantes d’association, de dissociation et d’affinité des espèces biomoléculaires et donc de caractériser leur fonctionnalité. Bien sûr, la réalisation de tels biocapteurs, de plus en plus perfectionnés et possédant des fonctionnalités multiples, nécessite la contribution d’acteurs d’origines différentes, conférant au projet un caractère pluridisciplinaire à travers les nombreuses collaborations développées avec d’autres équipes de recherche. Les différentes disciplines complémentaires mises en jeu sont, entre autres : chimie, biochimie, biologie, informatique, électronique, mécanique et optique.

ETAT DE L’ART 

Les biocapteurs sont des dispositifs permettant d’analyser des interactions biomoléculaires et dans lesquels les réactions d’intérêt sont couplées à un transducteur, transformant un signal biologique en un signal mesurable. La base fondamentale de l’analyse biomoléculaire est la spécificité de la reconnaissance moléculaire entre les deux espèces en présence permettant la formation d’un complexe stable, que ce soit pour les analyses en solution ou pour celles où l’une des espèces est fixée à une interface solide. Un biocapteur est donc un dispositif analytique qui intègre un élément biologique sur une surface fonctionnalisée (sonde), rendant possible une interaction biospécifique réversible avec un analyte (cible), mesurée via un transducteur de signal. Cette interaction est caractérisée par la mesure de la quantité de matière ayant interagi par unité de surface, grandeur appelée taux de recouvrement. L’élément biologique d’un tel dispositif est une couche de molécules choisies pour la bioreconnaissance : enzymes, récepteurs, peptides, simple brins d’ADN ou même cellules vivantes peuvent par exemple être utilisés. Lorsque des anticorps sont immobilisés, nous parlons alors d’immunocapteur. Comparés aux instruments d’analyse conventionnels, les biocapteurs sont caractérisés par une structure intégrée de tous ces composants. De plus, très souvent, les biocapteurs intègrent aussi un système fluidique pour l’injection des analytes. Sachant qu’une analyse basée sur la technologie usuelle ELISA, très courante en laboratoire, nécessite 3 à 5 heures de travail, le développement d’autres moyens d’analyse suscite beaucoup d’intérêt.

Les biocapteurs peuvent être utilisés de manière indirecte, c’est-à-dire qu’une ou les deux espèces impliquées dans l’interaction étudiée sont couplées à des molécules révélatrices de leur présence par leurs propriétés de transduction connues (fluorophores, marqueurs radioactifs,…), ou de manière directe, c’est-à-dire sans marqueurs. Les principaux groupes de biocapteurs sont les capteurs électrochimiques : potentiométriques (potentiel transmembrane, potentiel d’électrode, transistor à effet de champ [ 1 ]), ampérométriques [ 2 ] ou conductimétriques/capacimétriques [3], les capteurs optiques (spectroscopie de réflexion interne totale (TIRS) [4], ellipsométrie [5], guide d’onde diélectrique [6], interféromètre intégré de Mach-Zehnder [7], résonance des plasmons de surface (SPR) [8], miroir résonant [9]), les capteurs microgravimétriques (microbalance à quartz en mode de cisaillement en épaisseur (QCM-TSM) [10], ondes de surface acoustiques sur des cristaux (SAW) [11]) et les capteurs thermométriques (calorimétrie par titrage isotherme [12]).

Malgré un nombre toujours plus important de publications dans le domaine des biocapteurs en général et des immunocapteurs en particulier, il y a peu d’applications commerciales de ces capteurs pour les diagnostiques cliniques. Les raisons sont, la plupart du temps, liées à une question fondamentale non résolue sur l’immobilisation, l’orientation et les propriétés spécifiques des biomolécules fixées sur la surface du transducteur. Pour qu’un nouveau type de biocapteur soit viable, il faut que ses qualités soient nombreuses : une bonne précision, une grande reproductibilité d’un échantillon à l’autre, une grande sensibilité analytique, une spécificité optimale et une bonne stabilité de la calibration, tout cela sans dérive temporelle [ 13 ]. Il doit aussi pouvoir enregistrer l’interaction de manière quasicontinue, utiliser de faibles volumes d’échantillon et permettre la réversibilité de l’interaction étudiée, tout en ménageant sa taille, son prix de revient et sa facilité d’utilisation en vue d’une éventuelle commercialisation [https://www.rapport-gratuit.com/].

PRINCIPALES METHODES DE MESURE 

Le nombre important de techniques utilisées dans le contexte des analyses biomoléculaires nous contraint à ne décrire que les méthodes les plus couramment utilisées : guides d’ondes, interféromètres Mach-Zehnder intégrés, miroirs résonants, microbalances à quartz, tests ELISA et microscopie de fluorescence. Premièrement, nous allons décrire les dispositifs basés sur les ondes évanescentes dont font partie les biocapteurs SPR qui seront décrits par la suite.

Méthodes optiques évanescentes directes 

Une onde évanescente est obtenue lorsque l’onde incidente, issue du milieu le plus réfringent (prisme, réseau ou structure guidante), arrive sur l’interface sous un angle d’incidence supérieur à l’angle de réfraction limite (voir Annexe 2). L’amplitude de l’onde évanescente décroît exponentiellement en fonction de sa distance à l’interface et a donc la propriété intéressante d’être confinée au voisinage de l’interface (sur une profondeur ∆Zc, définie comme la distance à laquelle l’intensité tombe à 1/e du maximum, dans la Figure 2), siège des interactions biomoléculaires et donc de ne pas être sensible aux perturbations situées hors de cette limite. L’utilisation des champs évanescents permet donc de sonder en temps réel les changements d’indice de réfraction, d’épaisseur de couche, d’adsorption et de fluorescence causés par des réactions se produisant à une distance d’au plus quelques centaines de nanomètres de la surface. L’adsorption de molécules sur l’interface va perturber la propagation de l’onde évanescente, entraînant des variations de phase et d’amplitude du faisceau réfléchi. Aucun marqueur n’est nécessaire pour effectuer ces mesures, ce qui classe ces capteurs dans la catégorie des biocapteurs directs. De plus, ces mesures ne perturbent pas l’interaction et ne nécessitent pas d’étape supplémentaire : les interactions peuvent donc être suivies en temps réel.

Les guides d’ondes, les interféromètres intégrés Mach-Zehnder, les miroirs résonants et la SPR sont les techniques optiques évanescentes les plus courantes dans le domaine des biocapteurs.

Guide d’onde 

Un guide d’onde diélectrique est composé d’un film mince d’indice de réfraction élevé nf (structure guidante) encadré de deux milieux diélectriques d’indices de réfraction plus faibles (pour une description plus précise, voir l’Annexe 2). Lorsqu’un guide d’onde est utilisé en tant que biocapteur, les deux milieux encadrant la structure guidante sont les suivants : le premier, d’indice ns, est le substrat sur lequel est déposé le film mince tandis que le second, d’indice nc, constitue le milieu couvrant dans lequel vont se produire les interactions biomoléculaires (Figure 3). Lorsqu’un faisceau lumineux est injecté dans ce guide d’onde sous forme d’un mode guidé, une onde évanescente se propage aux deux interfaces de la structure guidante.

Autres méthodes 

Les biocapteurs ne sont pas tous basés sur les ondes évanescentes. D’autres procédés sont aussi très développés comme les microbalances à quartz, mais surtout, les tests immunologiques basés sur les enzymes (ELISA), très populaires depuis les années 80 et la microscopie de fluorescence qui reste le biocapteur de référence.

Microbalance à quartz (QCM) 

La microbalance utilise une lame de quartz extrêmement fine sur laquelle est fixée une électrode de platine ou d’or de chaque coté. Le quartz est un cristal piézoélectrique, c’est-àdire qu’une pression appliquée sur ce cristal induit une différence de potentiel électrique entre ses faces.

En appliquant une différence de potentiel sinusoïdale à une certaine fréquence, nous allons créer une onde acoustique qui se propage à l’intérieur du cristal avec une amplitude parallèle à la surface du cristal. Nous allons donc induire un mouvement des 2 faces portant les électrodes à cette même fréquence, dite fréquence de résonance. Or, cette fréquence de résonance dépend de l’épaisseur du support, de sa structure chimique, de sa forme ainsi que de sa masse. C’est pourquoi le cristal doit être coupé selon une direction précise par rapport aux axes cristallographiques.

Microscopie de fluorescence 

Les biocapteurs basés sur la fluorescence sont non seulement très répandus mais aussi très divers. Nous ne prétendrons pas en faire une description exhaustive dans cette sous-partie mais nous contenterons de détailler de manière générale les dispositifs en champ lointain, commerciaux, en omettant ceux en champ proche (spectroscopie de corrélation de fluorescence [30], fluorescence excitée par plasmons de surface [31],…). La microscopie de fluorescence en champ lointain est basée sur l’utilisation d’une biopuce, c’est-à-dire un substrat fonctionnalisé avec de nombreuses sondes différentes. Comme pour les tests ELISA, la procédure d’utilisations comprend deux principales étapes : l’interaction puis la lecture. L’interaction consiste en l’injection sur la biopuce de la solution test contenant les cibles marquées par un fluorophore, suivie de l’élimination des cibles non liées par une solution de rinçage. Le nombre de molécules ayant réagi est ensuite déduit de la mesure de l’intensité de fluorescence. Ce principe de base connaît de nombreuses variantes. Par exemple, le marquage peut se faire sur une molécule secondaire (voir Figure 9) qui va reconnaître les cibles qui se sont fixées ou alors, plusieurs fluorophores différents peuvent être utilisés. Cette méthode, dont le principe est très simple, permet une automatisation et une mise en parallèle des mesures très poussées : Affymetrix [32], leader dans le domaine des biopuces, propose des matrices de 500 000 plots inclus dans une surface de 1,28cm2 , soit un plot tous les 16 µm. De nos jours, la fluorescence reste la méthode de référence pour la mesure d’interactions biomoléculaires, de par sa sensibilité ainsi que sa capacité d’analyses simultanées d’un très grand nombre de données, malgré la nécessité du marquage des cibles.

RESONANCE DES PLASMONS DE SURFACE (SPR)

Comme les biocapteurs basés sur les guides d’ondes, les interféromètres MachZehnder et les miroirs résonants, les biocapteurs basés sur la résonance des plasmons de surface sont sensibles à la variation d’indice de réfraction induite à la surface du capteur dans les limites de la profondeur de pénétration d’une onde évanescente. Cette méthode est donc classée parmi les méthodes de détection directe (sans marqueurs) en milieu hétérogène (un des deux réactifs est fixé sur une surface). Comme toutes les méthodes directes, la résonance des plasmons de surface permet un suivi en temps réel des interactions étudiées. Après une brève introduction historique, nous allons décrire dans cette partie les principes théoriques gouvernant ce type de capteur, ainsi que les différentes configurations de mesures en monocapteur et en multicapteur. Nous présenterons aussi des calculs de la sensibilité de ces configurations dans les cas du couplage par prisme et du couplage par réseau ainsi que différentes possibilités d’améliorer cette sensibilité. Enfin, pour finir cette partie, nous détaillerons les avantages et inconvénients des capteurs SPR.

Le rapport de stage ou le pfe est un document d’analyse, de synthèse et d’évaluation de votre apprentissage, c’est pour cela rapport-gratuit.com propose le téléchargement des modèles complet de projet de fin d’étude, rapport de stage, mémoire, pfe, thèse, pour connaître la méthodologie à avoir et savoir comment construire les parties d’un projet de fin d’étude.

Table des matières

INTRODUCTION
I. ETAT DE L’ART
I.1. PRINCIPALES METHODES DE MESURE
I.1.1. Méthodes optiques évanescentes directes
I.1.1.1. Guide d’onde
I.1.1.2. Interféromètre Mach-Zehnder intégré
I.1.1.3. Miroir résonant
I.1.2. Autres méthodes
I.1.2.1. Microbalance à quartz (QCM)
I.1.2.2. ELISA
I.1.2.3. Microscopie de fluorescence
I.2. RESONANCE DES PLASMONS DE SURFACE (SPR)
I.2.1. Historique
I.2.2. Théorie
I.2.2.1. Interface métal/diélectrique
I.2.2.2. Couplage de l’onde incidente
I.2.2.3. Description qualitative de la résonance des plasmons de surface
I.2.2.4. Amplification des variations de réflectivité
I.2.3. Monocapteurs
I.2.3.1. Interrogation angulaire
I.2.3.2. Interrogation spectrale
I.2.4. Imagerie et multicapteurs
I.2.4.1. Protocole expérimental type
I.2.5. Sensibilité théorique
I.2.5.1. Couplage par prisme
I.2.5.2. Couplage par réseau
I.2.6. Amélioration de la sensibilité de détection
I.2.6.1. Evolution de la phase de l’onde réfléchie
I.2.6.2. Méthode sandwich
I.2.6.3. Spectrométrie de masse
I.3. COMPARAISON DES DIFFERENTES METHODES
I.3.1. Avantages et inconvénients des méthodes optiques directes
I.3.1.1. Absence de marquage
I.3.1.2. Mesure en temps réel
I.3.1.3. Détection en parallèle
I.3.1.4. Sensibilité
I.3.2. Performances des différents biocapteurs
II. DEVELOPPEMENT D’UN BIOCAPTEUR PAR IMAGERIE SPR
II.1. PREPARATION DE L’INTERFACE
II.1.1. Composition du transducteur
II.1.1.1. Critères de sélection du métal
II.1.1.2. Résonance des plasmons de surface sur Ag, Au, Cu et Al
II.1.2. Fonctionnalisation du capteur
II.1.2.1. Auto-assemblage moléculaire
II.1.2.2. Pyrrole
II.1.2.2.1. Electrocopolymérisation
II.1.2.2.2. Couplage
II.1.2.2.3. Structuration en plots
II.1.2.2.4. Avantages
II.2. OPTIMISATION ET CHOIX DES ELEMENTS DU BANC
II.2.1. Source de lumière
II.2.1.1. Longueur d’onde
II.2.1.2. Largeur spectrale, cohérence temporelle et divergence
II.2.2. Balayage angulaire
II.2.3. Fluidique
II.2.3.1. Pompe
II.2.3.2. Injection des échantillons
II.2.3.3. Cellule d’interactions
II.2.4. Prisme
II.2.4.1. Critères de sélection
II.2.4.1.1. Simplicité du système optique
II.2.4.1.2. Minimalisation des aberrations
II.2.4.2. Simulation des différentes configurations
II.2.4.2.1. Limitations technologiques
II.2.4.2.2. Choix de la configuration
II.2.5. Imagerie et caméra
II.2.6. Récapitulatif
II.3. AUTOMATISATION ET TRAITEMENT DES DONNEES
II.3.1. Caractérisation des lames
II.3.1.1. Conversion des niveaux de gris en variation de réflectivité
II.3.1.2. Ajustement des courbes de réflectivité en fonction de l’incidence
II.3.2. Quantification des prises
II.3.2.1. Conversion de ∆R en taux de recouvrement surfacique Γ
II.3.3. Etude des cinétiques
II.3.3.1. Modèle théorique monovalent
II.3.3.2. Ajustement des mesures en temps réel
II.3.3.3. Détermination des constantes d’affinité
II.3.3.4. Limitations du modèle
II.3.4. Automatisation
II.3.4.1. Reconnaissance des plots
II.3.4.2. Mesure de la réflectivité en fonction de l’angle d’incidence
II.3.4.3. Mesure des cinétiques
II.3.4.4. Analyse des résultats
II.4. CONCLUSION
III. APPLICATIONS DE L’IMAGERIE SPR
III.1. ACIDES DESOXYRIBONUCLEIQUES
III.1.1. Généralités
III.1.1.1. Structure de l’ADN
III.1.1.2. Hybridation et dénaturation
III.1.1.3. Intérêt biomédical des puces à ADN
III.1.2. Interactions ADN/ADN liées au gène κ-ras
III.1.2.1. Description du matériel utilisé
III.1.2.2. But de l’expérience
III.1.2.3. Résultats
III.1.2.3.1. Spécificité
III.1.2.3.2. Détection de mutations ponctuelles
III.1.2.3.3. Vers un outil de diagnostique
III.1.2.3.4. Dénaturation et réutilisation
III.1.2.4. Récapitulatif
III.2. PROTEINES
III.2.1. Contexte
III.2.1.1. De l’ADN à la protéine : l’expression génétique
III.2.1.2. Le système immunitaire
III.2.1.2.1. Structure des immunoglobulines
III.2.1.2.2. Exemple de reconnaissance immune : les tests de grossesse
III.2.1.3. Cancer et contrôle du cycle cellulaire
III.2.2. Interactions anticorps/antigène liées à l’hormone de grossesse
III.2.2.1. Matériel et méthodes
III.2.2.2. Résultats
III.2.2.2.1. Détection d’antigènes humains et de lapins
III.2.2.2.2. Détection de l’hormone de grossesse
III.2.2.3. Récapitulatif
III.2.3. Activité de liaison à l’ADN double-brin de la p53
III.2.3.1. Description du matériel utilisé
III.2.3.2. Puce à ADN universelle
III.2.3.3. But des expériences
III.2.3.4. Protocole expérimental
III.2.3.5. Résultats
III.2.3.5.1. Hybridation des séquences zip-codes
III.2.3.5.2. Reconnaissance des ADN cibles doubles-brins par la p53
III.2.3.5.3. Calcul des affinités entre la p53 et les ADN cibles
III.2.3.6. Récapitulatif
CONCLUSION

Rapport PFE, mémoire et thèse PDFTélécharger le rapport complet

Télécharger aussi :

Laisser un commentaire

Votre adresse e-mail ne sera pas publiée. Les champs obligatoires sont indiqués avec *