Soutenance mémoire
DÉVÉLOPPEMENT DU SCHÉMA MLVA DU PHYLOTYPE III
APPROCHES MLSA/MLST, MLVA
Les techniques de génotypage appropriées pour des études épidémiologiques ont été développées par des cliniciens. Elles exploitent des marqueurs stables à fort pouvoir discriminant pour différencier les souches au sein de la population. Plus les marqueurs ont une vitesse d’évolution rapide plus ils sont appropriés pour des études épidémiologiques locales sur du court terme et à des échelles fines. Comme pour la phylogénie, les marqueurs qui évoluent lentement sont plus appropriés pour des études épidémiologiques retraçant le passé évolutif ancien, donc sur du long terme et concerne une échelle globale. Aujourd’hui, la méthode de typage et d’analyse par séquençage multi-locus (MLSA/MLST) et la méthode d’analyse du polymorphisme de plusieurs locus de séquences répétées en tandem (MLVA) sont les plus couramment utilisées comme outil épidémiologique. La méthode MLSA/MLST est considérée comme la méthode de référence chez bon nombre de bactéries comme Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza, etc. (Maiden 2006 ; Maiden et al. 1998 ; Pérez-Losada et al. 2013 ; Roumagnac et al. 2006 ; Urwin & Maiden 2003). C’est une technique hautement reproductible basée sur des séquences d’ADN pour une caractérisation non ambiguë des souches bactériennes. La méthode utilise au moins sept gènes (ou fragment de gènes) qui présentent des variations intraspécifïques pour caractériser les souches bactériennes et se base sur l’analyse du polymorphisme nucléotidique des gènes à partir d’un échantillonnage. La méthode MLST diffère de la méthode MLSA dans la façon dont les données sont analysées. Le MLST consiste à analyser les profils alléliques générés après alignement des séquences nucléotidiques. Chaque locus d’intérêt est séquencé puis chaque allèle identifié est associé à un caractère numérique. Une série de nombres ou code numérique correspondant au numéro allélique à chaque locus constitue ainsi le profil allélique de la souche typée (Figure 6A). La méthode MLSA utilise
en outre la concaténation de séquence à la place du profil allélique pour déterminer la séquence-type (Figure 6B). Basés sur la séquence de gènes relativement conservées, ces deux méthodes sont largement utilisées pour déterminer les relations de parenté entre les séquences et permet de réaliser des études d’épidémiologie globale (ou macro-épidémiologie) (Glaeser & Kämpfer 2015 ; Maiden 2006 Maiden et al. 1998 ; Turner & Feil 2007). Dans de nombreuses études, l’approche MLSA a permis une meilleure approche pour la classification phylogénétique et une étude cohérente de l’histoire évolutive d’un individu au sein de l’espèce étudiée (phylogénie) par la reconstruction d’arbres phylogénétiques (Azevedo et al. 2015 ; Castillo & Greenberg 2007 ; Martens et al. 2008 ; Vinuesa 2010 ; Wicker et al. 2012). La méthode MLVA permet de discriminer des souches bactériennes comme Salmonella Enteritidis, Raltsonia solanacearum, etc. et notamment des souches qui présentent de faibles variations génétiques comme Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Yersinia pestis, Xanthomonas citri, etc. (Bertrand et al. 2015 ; Denœud & Vergnaud 2004 ; Eyre et al. 2013 ; Lindstedt et al. 2013 ; Parkinson et al. 2013 ; Poulin et al. 2015 ; Pruvost et al. 2014 ; Ravelomanantsoa et al. 2016 ; SHAN et al. 2015 ; Van Belkum 2007 ; Zaluga et al. 2013). Les VNTRs sont généralement des fragments intergéniques (localisés entre les gènes) mais peuvent aussi se retrouver dans des fragments codants. Ces sont des séquences hypervariables dont la taille des motifs répétés peut varier de quelques bases à plus d’une centaine (Vergnaud & Pourcel 2009). Généralement, ces variations génétiques au niveau des VNTR sont dues à un processus de mésappariement par glissement des brins d’ADN lors de la réplication.
EXPLORATION DE LA DIVERSITE GENETIQUE
Malgré l’existence d’un important fond génétique commun au sein d’une espèce, les individus d’une population peuvent présenter des différences, de même que les populations entre elles. Au cours de l’évolution, les variations qui surviennent sur le matériel génétique sont sources de diversité génétique. Ces changements sont héritables et transmis à la descendance, donnant naissance à des variants (sousclones) qui présentent des caractères nouveaux (nouveaux allèles) différents des cellules parentales d’origine. Les principales modifications observées au niveau des séquences nucléotidiques peuvent être : une substitution qui correspond par un remplacement de plusieurs nucléotides par d’autres (Figure 7A) ; insertion et/ou délétion i.e. addition et/ou perte de quelques paires de bases (Figure 7A) (de Vienne 1998 ; Emerson et al. 2008 ; Rodriguez-Murillo & Salem 2013 ; Schork et al. 2000 ; Väli et al. 2008). Le polymorphisme générée se traduit en :un polymorphisme mononucléotidique (SNP) représenté par une variation d’une seule paire de bases sur un locus donné, entre individu d’une même espèce ; un polymorphisme de nombre de copies (CNV) dans lequel le nombre de copies d’un même locus est variable entre les individus dû à des événement de duplication et de délétion (Brynildsrud et al. 2015 ; Riehle et al. 2001) ; un polymorphisme de répétitions localisé généralement au niveau des séquences répétées en tandem, résultat d’une contraction (délétion) ou expansion (insertion) d’un motif répétée par la suite d’une mutation par glissement (Bichara et al. 2006 Gemayel et al. 2010) ou une recombinaison (Bi & Liu 1996 ; Richard & Pâques 2000) (Figure 7C). Chez les bactéries, des variations génétiques peuvent également se produire par transfert horizontal de
matériel génétique d’une cellule à l’autre. C’est un processus dans lequel une bactérie intègre du matériel génétique provenant d’une autre bactérie (différent genre ou espèce) sans en être le descendant (échange de gènes ou recombinaison génétique). Trois évènements de transfert sont possibles :la transformation : incorporation d’ADN libre de l’environnement directement dans la bactérie ; la transduction : transfert de matériel génétique d’une bactérie à une autre par l’intermédiaire d’un phage ou d’un virus ; la conjugaison : transfert d’ADN d’une bactérie à une autre par contact direct (Figure 7B) (Mazodier & Davies 1991). Le transfert horizontal de gènes joue un rôle majeur dans la diversification rapide, l’adaptation et l’évolution des génomes bactériens (Doolittle et al. 2003).
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Table des matières
AVANT-PROPOS INTRODUCTION GENERALE SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE EPIDEMIOLOGIE MOLECULAIRE GENOTYPAGE BACTERIEN Marqueurs moléculaires comme outil d’investigation . Technique de génotypage Approches MLSA/MLST, MLVA EXPLORATION DE LA DIVERSITE GENETIQUE Variations génétiques Diversité génétique intra-populationStructure des populations et flux de gènes Représentation des relations génétiques Diversité phénotypique ABOUTISSEMENT ET PORTEE DES INVESTIGATIONS MODELE D’ETUDE : LE FLETRISSEMENT BACTERIEN OBJECTIFS ET QUESTIONS DE RECHERCHE DÉVÉLOPPEMENT DU SCHÉMA MLVA DU PHYLOTYPE III INTRODUCTION METHODOLOGIE RESULTATS ET DISCUSSION CONCLUSION PARTIELLE DIVERSITÉ GÉNÉTIQUE DU ceRs ET ÉPIDEMIOLOGIE INTRODUCTION MATERIELS ET METHODES Constitution de la collection de souches du ceRs Traitement des échantillons Collection de souches Caractérisation moléculaire des souches en collection Enquête épidémiologique Analyse des données RESULTATS ET DISCUSSION Ampleur de l'échantillonnage et collection de souches du ceRs Phylotypes, spectre d’hôtes et distribution géographique Identification de l’écotype ‘Brown rot’ IIB-1 et de sept sequevar Populations endémiques diversifiées et complexes de souches malgaches de l’écotype africain phylotype III Synthèse et analyses des données d’enquêtes CONCLUSION PARTIELLE ÉVALUATION PRÉLIMINAIRE DE LA RÉSISTANCE DES VARIÉTÉS CULTIVÉES À MADAGASCAR INTRODUCTION MATERIELS ET METHODES Matériel végétal Ralstonia solanacearum Dispositif expérimental et inoculation Suivi et mesure des symptômes Analyses des données RESULTATS ET DISCUSSION CONCLUSION PARTIELLE CONCLUSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES EPIDEMIOLOGIE MOLECULAIRE : RS3-MLVA16 et RS2-MLVA9, deux puissants outils hautement résolutifs pour caractériser respectivement les souches du phylotype DEUX MODELES EPIDEMIOLOGIQUES CONTRASTES AU SEIN DU ceRs : l’écotype ‘Brown rot’ et l’écotype ‘Africain’ EVALUATION DE LA RESISTANCE GENETIQUE des principales variétés de pomme de terre cultivées à Madagascar : pas de résistance aux souches malgaches ; résistance génétique des variétés 720118 (Jaingy) et 800934 (Miova) aux souches I-31 PRIORITES DANS LA STRATEGIE DE LUTTE contre le fletrissement bactérien dû aux souches de quarantaine IIB-1 APPROFONDIR LES CONNAISSANCES SUR LE PHYLOTYPE III et ériger en modèle d'étude la capacité à développer des infections latentes ET DEMAIN RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ANNEXES
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