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Les biopiles enzymatiques
Au cours de ce travail, on s’est intéressé aux biopiles enzymatiques. Ces dernières utilisent une enzyme et plus particulièrement une enzyme d’oxydo-réduction pour catalyser la réaction d’oxydation du glucose à l’anode et de réduction du dioxygène en eau à la cathode (Figure I.6). Il s’agit d’une réaction de réduction à quatre électrons. Les enzymes possèdent la particularité d’être spécifiques vis-à-vis de leur substrat.
Les enzymes employées dans les biopiles enzymatiques
Avant de décrire les enzymes employées dans les biopiles enzymatiques et plus particulièrement la laccase B de Trametes versicolor, on va tout d’abord s’attarder sur la structure d’une enzyme et sur son principe de fonctionnement.
Généralités sur les enzymes
A l’exception de quelques enzymes composées d’ARN, les enzymes sont des protéines ayant des propriétés catalytiques. Elles se composent d’une partie protéique appelée apoenzyme (elle forme le corps de l’enzyme) constituée d’un enchainement d’acides aminés (molécule organique composée d’un atome de carbone asymétrique qui porte une fonction acide, amine et une chaine latérale appelée résidu) liés entre eux par des liaisons amides (liaisons peptidiques) (Figure I.7). Une liaison amide résulte de la condensation du groupe α-carboxyle d’un acide aminé avec le groupe α-aminé de l’acide aminé suivant dans la chaine. On l’appelle la chaine peptidique., L’extrémité d’un polypeptide comportant un groupement amine libre s’appelle l’extrémité amino-terminale (N-terminale) et celle comportant un groupement carboxylique libre, l’extrémité carboxy-terminale (C-terminale). Par convention, la numérotation des résidus commence à l’extrémité N-terminale. La liaison peptidique est plane. Une rotation est possible autour du carbone alpha qui porte le résidu de l’acide aminé.
On distingue quatre niveaux structuraux chez les enzymes (protéines). La structure primaire correspond à la séquence en acides aminés de la protéine (Figure I.8).
La structure secondaire est relative au premier niveau de compaction. Elle consiste en un repliement des acides aminés en hélices alpha ou en feuillets béta dont il existe deux formes : les feuillets parallèles et antiparallèles (Figure I.9). L’hélice alpha est constituée par l’enroulement régulier d’une chaine polypeptidique sur elle-même. Elle résulte de la formation d’une liaison hydrogène entre des groupements C=O et N-H proches l’un de l’autre dans la chaine. Dans une hélice alpha, l’atome d’oxygène du carbonyle de chaque résidu (acide aminé) forme une liaison hydrogène (qui va stabiliser la structure) avec l’azote du groupement amide situé quatre résidus plus loin dans la chaine. Le résultat est une structure cylindrique où les résidus sont situés à l’extérieur de l’hélice. Elles détermineront les interactions de l’hélice alpha avec les autres parties de l’enzyme. Dans les feuillets béta (brins béta), deux chaines s’associent entre elles via des liaisons hydrogènes. Ces chaines peuvent être orientées dans le même sens (feuillet béta parallèle) c’est-à-dire par numérotation croissante des résidus des deux chaines ou en sens inverse (feuillet antiparallèle) à savoir par ordre croissant pour l’une des chaines et décroissant pour l’autre. Il existe aussi des feuillets mixtes.
La structure tertiaire correspond à la compaction des structures secondaires entre elles et enfin la structure quaternaire correspond à l’assemblage de plusieurs sous-unités protéiques ayant une structure tertiaire.
La partie protéique (apoenzyme) est parfois présente seule, dans ce cas il s’agit d’une enzyme purement protéique (holoenzyme). Certaines enzymes sont constituées d’une partie non protéique appelée cofacteur lorsque celle-ci n’est pas liée de façon covalente à la chaine peptidique ou groupement prosthétique dans le cas inverse. Ce complexe apoenzyme-cofacteur forme ce que l’on appelle une hétéroenzyme. Cette partie non protéique est primordiale pour l’activité catalytique de l’enzyme. En effet, les hétéroenzymes ne peuvent pas fonctionner en l’absence de leur cofacteur (il constitue une des parties actives de l’enzyme).
Une enzyme n’est pas seulement caractérisée par sa structure primaire ou sa configuration dans l’espace (structure secondaire à tertiaire). Elle a aussi des caractéristiques qui lui sont conférées au cours de son processus de synthèse. On parle de modifications post-traductionnelles. Ces modifications consistent à modifier la nature chimique d’acides aminés, ce qui a pour effet d’en modifier les propriétés physiques et chimiques. La glycosylation constitue une modification post traductionnelle qui joue un rôle important dans le repliement de l’enzyme, sa stabilité ou certains phénomènes de signalisation cellulaires. Elle consiste à lier un sucre (glucide) à une protéine. Les chaines polysaccharides sont souvent ramifiées. Les chaines glucidiques sont liées aux protéines par des liaisons O-glycosidiques ou N-glycosidiques selon leur site d’ancrage. Les chaines liées par des liaisons O-glycosidiques sont plus courtes, ne contiennent que un à trois résidus glucidiques. La liaison est établie entre la N-acétyl galactosamine (GalNAc) et les résidus OH des acides aminées sérines (Ser) et thréonines (Thr). Les chaines N-glycosidiques sont ancrées sur l’azote du groupement amide de l’asparagine. Le sucre qui est lié à l’asparagine est le N-acetylglucosamine (GlcNAc). Ils peuvent former des arborescences. Le site d’attachement des chaines liées en N est situé dans la zone consensus N-X-Ser/Thr de la séquence en acides aminés de la protéine. Ces chaines contiennent toutes une structure constituée de deux GlcNAc et de trois mannoses auxquels viennent se greffer d’autres glucides.
Mécanisme et cinétique des réactions enzymatiques
Les enzymes sont des catalyseurs biologiques spécifiques, c’est-à-dire qu’une enzyme donnée ne peut catalyser qu’un seul type de réaction chimique. On distingue six grandes classes selon le type de réactions catalysées :
-Les oxydoréductases : catalysent les réactions d’oxydoréduction.
-Les transférases : transfert un groupement fonctionnel d’une molécule à une autre.
-Les hydrolases : catalysent la coupure de liaisons par hydrolyse.
-Les lyases : catalysent la coupure de liaisons par élimination.
-Les isomérases : catalysent les réactions de changement dans la configuration du substrat.
-Les ligases : catalysent la condensation de deux molécules.
La vitesse de réaction d’une réaction enzymatique définit l’activité enzymatique. Celle-ci est exprimée en quantité de substrat transformée par unité de temps par quantité d’enzyme. Le mécanisme le plus couramment utilisé pour expliquer le processus catalytique est celui de Michaelis-Menten. Il a proposé que la réaction globale soit composée de deux réactions élémentaires : le substrat forme d’abord un complexe avec l’enzyme, puis ce complexe se décompose en produit. La réaction suivante résume ces différentes étapes :
Où E, S, ES et P symbolisent l’enzyme, le substrat, le complexe enzyme-substrat et le produit respectivement.
Les enzymes employées dans le compartiment anodique
Dans le compartiment anodique, les enzymes utilisées peuvent être classées en trois groupes selon le cofacteur auquel elles sont associées [16]. Le premier groupe est formé par les enzymes utilisant comme cofacteur la pyrroloquinoléine quinone (PQQ) telles que la glucose déshydrogénase (GDH), l’alcool déshydrogénase et la glycérol déshydrogénase, étant signalé que le cofacteur PQQ est lié à l’enzyme. Le deuxième groupe comprend les enzymes utilisant comme cofacteur soit le nicotinamide adénine dinucléotide (NADH/NAD+) ou le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH/NADP+). On peut citer aussi comme enzyme la glucose déshydrogénase et l’alcool déshydrogénase. Dans ce type d’enzyme, le cofacteur, centre redox, n’est que faiblement lié à la structure protéique de l’enzyme. Cette caractéristique permet à l’enzyme de transférer des électrons à l’électrode par diffusion du cofacteur. Les enzymes appartenant à la troisième catégorie ont comme cofacteur la flavine adénine dinucléotide (FAD). Ce cofacteur est étroitement lié à la structure protéique de l’enzyme, de façon covalente ou non. Il est généralement enfouit profondément dans la structure de l’enzyme. L’enzyme à FAD la plus couramment utilisée dans le domaine des biopiles est la glucose oxydase (GOx). Il a été récemment établit que la GOx ne peut établir de transfert électronique direct avec l’électrode, son utilisation dans les biopiles requiert donc un médiateur.
Trois carburants sont principalement utilisés pour le fonctionnement de l’anode: l’hydrogène, les alcools (méthanol, éthanol) et les sucres (glucose, lactose, fructose). La glucose oxydase d’Aspergillus niger est l’enzyme la plus largement utilisée dans les biopiles enzymatiques pour réduire le glucose [2]. Il s’agit d’une enzyme homodimérique, c’est-à-dire qu’elle est formée de deux sous-unités polypeptidiques identiques. A l’intérieur de chacune de ces sous-unités est enfoui le cofacteur responsable de l’oxydation du glucose, à savoir la FAD. Ce biocatalyseur possède une spécificité, une activité et une stabilité très élevées vis-à-vis du beta-d-glucose présent dans les fluides biologiques par comparaison à d’autres enzymes employées pour l’oxydation du glucose. Le glucose s’oxyde en gluconolactone (ce dernier s’hydrolyse ensuite en acide gluconique) par un processus à deux électrons et deux protons. La GOx est ensuite régénérée en réagissant avec l’oxygène. Cette enzyme présente certains inconvénients. En effet, sa grande taille et le fait que son site actif soit enfoui dans sa structure rendent difficile le transfert d’électrons direct en raison de la longue distance (supérieure à l’effet tunnel) et augmentent les contraintes stériques. Par ailleurs, l’oxygène étant un substrat de la GOx, une compétition entre les réactions d’oxydation du substrat et de réduction du dioxygène peuvent entraîner une baisse des performances de la biopile enzymatique [17]. Une autre enzyme pouvant être employée pour l’oxydation du glucose est la cellobiose déshydrogénase (CDH). Cette dernière a suscité une attention croissante durant ces dernières années en tant qu’enzyme utilisée pour effectuer le transfert d’électrons direct dans les biopiles enzymatiques. La CDH se compose de deux domaines distincts : un domaine contenant une FAD et un autre domaine contenant un hème. La FAD est responsable de l’oxydation du substrat. Elle est par la suite régénérée en transférant successivement les deux électrons à l’hème. L’hème facilite le couplage électrique avec le matériau d’électrode. Il faut savoir que le glucose n’est pas le substrat (cible) de la CDH. L’efficacité catalytique de cette enzyme n’est donc pas aussi élevée que celle de la GOx. Le substrat natif de la CDH est la cellobiose, mais l’enzyme est capable d’oxyder aussi le lactose avec un fort rendement. Les glucoses déshydrogénases (GDH) sont aussi ces dernières années très utilisées pour oxyder le même substrat. Le fructose constitue aussi un carburant glucidique pour les biopiles enzymatiques. La fructose déshydrogénase se composant aussi de deux domaines (un domaine contenant un DFC et un autre un hème) est utilisée pour oxyder ce carburant. La GDH et la FDH présentent l’avantage de ne pas réduire l’oxygène contrairement à la GOx. Pour les alcools et l’hydrogène, on peut utiliser comme enzyme l’alcool déshydrogénase et les hydrogénases respectivement.
Les enzymes employées dans le compartiment cathodique
Au cours de ce travail, on s’est intéressé au compartiment cathodique de la biopile enzymatique. Les enzymes les plus largement utilisées appartiennent à la famille des oxydases multi-cuivres (MCOs). Elles constituent une famille d’enzymes capables d’oxyder divers substrats concomitamment avec la réduction de l’oxygène en eau. Elles peuvent être divisées en deux catégories. On distingue les MCOs capables d’oxyder des substrats organiques (oxydases organiques) tels que les phénols. Dans cette catégorie, on retrouve les laccases, les bilirubines oxydases et l’ascorbate oxydase. Le deuxième type de MCOs est capable d’oxyder des ions métalliques (métalloxydases) [18]. Les métalloxydases sont spécifiques vis-à-vis de leur substrat tandis que les oxydases organiques présentent une large variété de substrats. Le bilan de la réaction enzymatique est le suivant : 4 H+ + 4 substrats + O2 2 H2O + 4 produits.
Les MCOs contiennent quatre atomes de cuivre pouvant être classés en trois catégories selon leurs caractéristiques spectroscopiques. On distingue le cuivre T1 caractérisé par une absorption intense à l’origine de la coloration bleue dans le domaine du visible (600 nm) en raison de la liaison covalente entre le cuivre et le ligand histidine. Il possède aussi un signal en résonance magnétique nucléaire (RMN). Ce cuivre constitue le site d’entrée des électrons à partir de divers substrats (il s’agit du site où se déroule la réaction d’oxydation du substrat). Le cuivre T2 ne présente aucune bande d’absorption mais présente des propriétés paramagnétiques. Le centre cuivrique bi-nucléaire T3 présente quant à lui une absorption intense à 330 nm dûe au pont hydroxyde reliant les deux atomes de cuivre. Les sites de cuivre T2 et bi-nucléaire T3 forment ce que l’on appelle un cluster trinucléaire. La réaction de réduction de l’oxygène en eau s’effectue au niveau de ce cluster (Figure I.10) [19].
Caractéristiques physico-chimiques des laccases
La laccase est en fait un mélange de plusieurs isoformes. Pour un champignon donné, la production de laccases dépend de la souche utilisée, de la présence ou non d’inducteur et de la durée de la culture du microorganisme. Le champignon Trametes versicolor, sur lequel on s’est focalisé lors de ce travail, produit principalement la laccase dite A en l’absence d’inducteur alors qu’en présence d’inducteur la laccase B est majoritaire.
En général, les laccases ont une masse molaire moléculaire comprise entre 60 et 100 kDa dont environ 10 à 50 % sont attribués à la glycosylation. Les points isoélectriques (pI) des laccases des champignons sont situés entre 3 et 7 tandis que ceux des laccases produites par les plantes sont environ de 9. Les laccases ont une bonne stabilité thermique entre 5 et 55°C et sont relativement solubles dans l’eau. Le Tableau I.3 donne les caractéristiques de laccases issues de différents organismes.
Applications industrielles de la laccase
La laccase peut être utilisée dans une large gamme d’applications industrielles du fait de sa spécificité relativement faible. Dans l’industrie du papier par exemple, elle peut être utilisée pour remplacer les composés chlorés utilisés dans l’étape de blanchiment de la pâte à papier (délignification). L’utilisation de composés chlorés présente en effet plusieurs inconvénients tels que le rejet d’effluents toxiques pour l’environnement. Bourbonnais et al. ont démontré que la laccase pouvait constituer une alternative à l’utilisation de ces réactifs [30].
Car elle permet de délignifier de manière efficace la pâte à papier. Or, c’est la présence de résidus de lignine qui provoque le jaunissement du papier. La laccase peut être également utilisée dans le domaine de la dépollution environnement. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) constituent des composés toxiques largement présents dans les milieux aquatiques. La laccase est capable de les oxyder en des molécules moins dangereuses. Pour pouvoir les transformer, un médiateur redox est nécessaire. Dans le domaine cosmétique, la teinture des cheveux nécessite l’utilisation d’agents chimiques assez agressifs pouvant endommager les cheveux. Les précurseurs de colorants peuvent être oxydés dans la teinture souhaitée en utilisant la laccase comme solution de remplacement.
La stabilisation du vin est l’une des principales applications de la laccase dans l’industrie alimentaire. Le vin constitue un mélange assez complexe de composés chimiques (il contient de l’éthanol, des acides organiques, des sels et des composés phénoliques). Il est primordial que ses caractéristiques gustatives restent constantes jusqu’à la consommation (suffisamment stables au moins durant la première année de stockage). Dans certaines conditions fortement liées à la présence de polyphénols, le vin s’oxyde et il en résulte un changement de couleur et d’arômes. Différentes méthodes ont été employées afin d’éviter la décoloration et l’altération de la saveur dans les vins tels que l’élimination des groupements phénoliques avec la polyvinylpolyrrolidone (PVPP, polymère organique). Le PVPP possède une forte affinité vis-à-vis des polyphénols. Il faut savoir que l’élimination des polyphénols doit être sélective afin d’éviter toute altération indésirable des caractéristiques du vin. Une alternative aux adsorbants physico-chimiques pourrait être l’utilisation de la laccase qui ciblerait les polyphénols durant le processus de fabrication. Ces substances polyphénoliques seraient ainsi oxydées par l’enzyme, polymérisées puis éliminées par clarification. La laccase n’étant pas considérée comme un additif alimentaire, elle est utilisée sous forme immobilisée ce qui permet son élimination du vin et donc sa réutilisation. Le développement de troubles dans les bières lors du stockage est un problème persistant dans l’industrie brassicole. La formation de troubles dans les bières est le résultat de la précipitation de protéines sous l’effet de polyphénols. Ces derniers sont traditionnellement éliminés comme dans le cas du vin par traitement avec la PVPP. La laccase constitue donc une alternative de choix. Pour les jus de pomme et de raisin, l’oxydation des composés phénoliques a toujours posé un problème quant à la qualité organoleptique du jus.
L’immobilisation des enzymes
L’une des difficultés dans l’élaboration d’une biopile enzymatique repose sur l’immobilisation de l’enzyme avec l’électrode [31]. Les techniques de connexion utilisées pour immobiliser les enzymes entraînent la création d’interactions entre les enzymes et les matériaux d’électrodes. Classiquement, quatre méthodes peuvent être employées pour immobiliser l’enzyme à l’électrode. On distingue l’adsorption, le greffage covalent, la réticulation et l’encapsulation.
Immobilisation par adsorption
L’adsorption (physisorption) constitue la technique d’immobilisation la plus simple. L’enzyme est retenue à la surface grâce à des interactions faibles de type hydrophobe (comme dans le cas de la cavité hydrophobe proche du site T1 de la laccase l’enzyme), électrostatique ou Van der Waals [32]. Les enzymes non adsorbées sont éliminées par lavage (Figure I.16).
Figure I.16: Schéma illustrant l’immobilisation des enzymes par interaction électrostatique à la surface de l’électrode
Immobilisation par liaison covalente
Il est possible d’immobiliser de manière covalente l’enzyme à la surface de l’électrode. La surface de l’électrode doit être fonctionnalisée, ceci afin de pouvoir greffer l’enzyme. La technique consiste à effectuer une réaction chimique entre les groupements fonctionnels libres d’une enzyme et un groupement réactif du support sur lequel l’enzyme pourra être greffée. Les groupements réactifs d’une enzyme peuvent être des groupements aminés, carboxyliques, ou des carbonyles (aldéhydes) (Figure I.17).
Immobilisation par encapsulation
L’encapsulation évite la perte des enzymes tout en laissant aux petites molécules la possibilité de diffuser à travers la matrice. Il s’agit d’une méthode qui lie les enzymes de manière non pas chimique mais physique seulement. Les polymères les plus couramment utilisés pour l’encapsulation enzymatique sont les ionomères. Un ionomère constitue un copolymère thermoplastique réticulé ioniquement. Ces matériaux possèdent de larges pores permettant ainsi la pénétration de la solution environnante. Les interactions électrostatiques entre les groupements chargés des ionomères et ceux des enzymes permettent d’avoir une meilleure stabilité. Parmi les ionomères, les polypyridines d’osmium, ou de ruthénium sont très utilisés pour l’encapsulation de la laccase et de la bilirubine oxydase [32]. Ces polymères constituent des hydrogels redox hydrosolubles avec un degré de réticulation moyen. Un hydrogel redox consiste en un réseau tridimensionnel de chaines polymères hydrophiles renfermant des médiateurs redox. On peut aussi encapsuler l’enzyme dans du Nafion. Ce polymère possède des chaines latérales terminées par une fonction acide sulfonique qui lui confère un caractère acide, ce qui limite son emploi en tant que matrice d’immobilisation enzymatique. L’échange des protons de l’acide sulfonique du Nafion avec du tetraalkylammonium permet de réduire cette acidité et induit un élargissement des pores permettant la diffusion de larges molécules dans la matrice. Le chitosan, un polyaminosaccharide naturel dérivé de la chitine, est aussi employé comme matrice d’encapsulation enzymatique. Il est biocompatible, peu couteux et possède une bonne résistance mécanique. Son caractère hydrophobe peut être modifié par amination ce qui permet d’avoir un environnement favorable à l’enzyme. Le procédé sol-gel est aussi souvent utilisé pour ce type d’immobilisation. Ce type de matrice inorganique à base de silice est avantageux en raison du fait qu’il permet d’avoir des structures et des propriétés variées en fonction des conditions de synthèse. Il est biocompatible mais possède une faible résistance mécanique [33].
Immobilisation par réticulation
Cette technique permet de lier entre elles les enzymes formant ainsi des agrégats par réaction intermoléculaire avec un agent bi- ou multifonctionnel appelé agent de couplage. L’agent de couplage le plus utilisé est le glutaraldéhyde. Les enzymes sont tout d’abord adsorbées sur un support puis traitées par l’agent de couplage. On forme ainsi un réseau enzymatique tridimensionnel. Les enzymes sont par la suite encapsulées dans un gel [34].
Les supports employés dans les biopiles enzymatiques
Le choix du matériau repose principalement sur sa conductivité, sa surface spécifique (grande porosité) et la présence de groupements fonctionnels afin de pouvoir immobiliser l’enzyme [3].
Les matériaux carbonés
Les matériaux carbonés sont les plus utilisés en raison de leur facilité d’élaboration, de leur prix relativement faible par comparaison aux autres matières premières et de leur biocompatibilité. Parmi les matériaux carbonés on distingue le graphite, le graphite pyrolytique similaire au graphite mais avec des liaisons covalentes entre les couches de graphène, le carbone vitreux… Une attention particulière ces dernières années s’est portée sur les matériaux carbonés nanostructurés (nanotubes de carbone, CNTs) (Figure I.18). On peut citer les nanotubes de carbone multi-paroi (MWCNT) ayant un diamètre compris entre 1,4 et plus de 100 nm et les nanotubes de carbone mono-paroi (SWCNT) ayant un diamètre compris entre 0,4 et plus de 3 nm [35]. Ces matériaux carbonés découverts par Iijima et al. [36] au début des années 1990 sont composés de plusieurs feuillets de graphène enroulés sur eux-mêmes. La nanostructuration de la surface induite par le dépôt de ces CNTs permet d’augmenter la surface spécifique de l’électrode et donc la densité d’enzymes immobilisées à la surface. La plupart des biopiles enzymatiques les plus performantes ont été fabriquées en utilisant des CNTs [34]. En plus de leur grande surface spécifique, les CNTs peuvent être facilement modifiés par des groupements fonctionnels permettant ainsi le greffage du biocatalyseur.
Les propriétés des CNTs dépendent majoritairement de leur architecture. L’orientation selon laquelle l’enroulement du feuillet de graphène s’effectue définit les propriétés des nanotubes. En effet, l’angle d’enroulement détermine la chiralité du tube et dicte ses propriétés électriques et mécaniques. Ces dernières dépendent aussi des conditions de synthèse. Les CNTs peuvent être synthétisés directement sur le support par décharge électrique, ablation laser pulsée et par dépôt chimique en phase vapeur (CVD). La CVD reste la méthode la plus utilisée pour la croissance directe des films minces de CNTs sur un support. Cette méthode nécessite l’utilisation de catalyseurs métalliques afin de permettre la croissance des CNTs. Les paramètres clés permettant le contrôle de la cinétique de croissance sont la nature du gaz contenant la source de carbone, le temps de croissance, la température et la composition du catalyseur. Les CNTs formés par CVD sur le support peuvent être répartis de façon aléatoire ou alignés. Ce procédé conduit à la formation de CNTs avec des quantités significatives de catalyseur résiduel (une étape de purification après synthèse est nécessaire), ainsi qu’à un mélange de CNTs et il ne permet pas de travailler sur certains supports (plastique). En outre la CVD requiert de travailler sous vide et à de fortes températures.
L’élaboration de films de CNTs peut être aussi réalisée par le dépôt d’une phase liquide sur le support. Par comparaison à la méthode de croissance directe, ce procédé permet de travailler à basse température, ne nécessite pas d’être sous vide, réduisant ainsi considérablement les couts d’élaboration et permet de travailler avec des supports en plastique. Afin d’obtenir ces films, plusieurs facteurs doivent être pris en considération tels que la dispersion des CNTs (les CNTs ont tendance à former des agglomérats dûs aux interactions de Van der Waals, il est nécessaire d’ajouter un tensio-actif) le choix du support, les conditions de revêtement… Le principe de la méthode de dépôt d’une phase liquide sur un support consiste à fixer la solution de CNTs puis à la sécher. Dans certains cas, une étape supplémentaire d’élimination du surfactant est nécessaire. Il existe de nombreuses méthodes de dépôt de films minces de CNTs telles que la méthode de « Langmuir Blodgett » basée sur le caractère hydrophobe des CNTs, l’auto-assemblage basée sur les interactions entre les CNTs et la surface, le « dip coating » ou encore le « drop coating » [37]. Le graphène constitué d’une monocouche de carbone a attiré aussi une attention particulière et pourrait être considéré comme un matériau prometteur d’électrode. Il présente une bonne conductivité ainsi qu’une résistance mécanique et une surface spécifique assez importantes. Il peut être élaboré suivant différents procédés : exfoliation par voie liquide du graphite, décomposition thermique, dépôt en phase vapeur sur un substrat métallique ou réduction de l’oxyde de graphène (GO). Chacune de ces stratégies permet d’obtenir un graphène avec des caractéristiques différentes. Il peut être fonctionnalisé de la même façon que les autres matériaux carbonés.
L’or
L’or présente des propriétés intéressantes pour l’élaboration d’électrodes [38]. Sa surface peut être fonctionnalisée facilement afin d’avoir les fonctions chimiques d’intérêt. Cette fonctionnalisation est généralement effectuée par des monocouches auto assemblées (Self Assembled Monolayer, SAMs) de thiol ou par des sels de diazonium ayant la terminaison désirée. L’ensemble de ces caractéristiques fait que l’or est utilisé en tant que matériau d’électrode.
Electroréduction de sels de diazonium
La réduction des dérivés de sels de diazonium benzéniques constitue l’une des stratégies de fonctionnalisation des matériaux carbonés pour l’immobilisation enzymatique (Figure I.20). Cette méthode permet d’avoir des noyaux benzéniques avec différents substituants (amines, carboxyliques, hydrocarbures aromatiques polycycliques). En fonction de la nature de ces substituants, différentes méthodes d’immobilisation enzymatique peuvent être envisagées. Armstrong et al. ont proposé une alternative à l’immobilisation de l’enzyme par la formation de liaisons amides et imines [40-42] en tirant avantage de la cavité hydrophobe de la laccase de Trametes versicolor proche du cuivre T1 afin de l’immobiliser. Ils ont modifié pour cela du graphite pyrolytique par des sels de diazonium ayant une terminaison chrysène (2-chrysènediazonium) [43]. Ils ont mesuré un courant de l’ordre de -20 µA. Ils ont aussi greffé sur ce même type de surface [44] du 2-anthracènediazonium. Ils ont mesuré une densité de courant de -550 µA/cm2 (utilisation d’une électrode tournante, 2500 rpm). On aura dans ces cas une interaction -stacking entre la cavité de la laccase et les hydrocarbures aromatiques polycycliques. Cette méthode d’immobilisation a été par la suite transposée sur les nanotubes de carbone (SWCNTs et MWCNTs) qui offrent une plus grande surface spécifique. Lalaoui et al. [45] ont ainsi immobilisé un dérivé du sel de diazonium (2-diazonium anthraquinone) sur des MWCNTs. Ils ont obtenu une densité de courant de -0,9 mA/cm2. Bielewiz et al. [46] ont quant à eux fonctionnalisé tout d’abord des SWCNTs par génération de sels de diazonium à partir d’aniline substituée par de l’anthracène ou de l’anthraquinone puis immobilisé la laccase. L’enzyme a été par la suite piégée dans une matrice de Nafion diminuant ainsi les pertes suite au lavage. Ils ont mesuré respectivement une densité de courant de -215,8 et -187,2 µA/cm2 pour l’anthracène et l’anthraquinone.
Di bari et al. [47] ont électrodéposé des feuillets de graphène sur du carbone vitreux. Ces feuillets ont été par la suite fonctionnalisés par du 4-aminoaryl diazonium dans le cas de l’immobilisation la laccase (formation d’une base de Schiff entre les groupements amines du support et les sites de glycosylation de l’enzyme) et par du 2-carboxy-6-naphtol diazonium dans le cas de l’immobilisation de la bilirubine oxydase (formation d’une liaison amide entre les groupements carboxyliques du support et les amines de l’enzyme). Ils ont mesuré respectivement des densités de courant de -1 mA/cm2 et -0,4 mA/cm2.
Traitement acide et oxydant
Des fonctions oxygénées (carboxyles, carbonyles et hydroxyles) peuvent être créés à la surface des matériaux carbonés sous des conditions acides et oxydantes [48]. Dans le cas des CNTs, lors de l’élimination des impuretés métalliques, des fonctions réactives telles que des carbonyles ou des acides carboxyliques sont générées. Ces groupements peuvent être utilisés pour l’immobilisation enzymatique. Meredith et al. ont fonctionnalisé des MWCNTs avec du chlorure 2-anthracène carbonyle (Figure I.21) pour immobiliser la laccase via sa cavité hydrophobe. Ils ont obtenu une densité de courant de -155 µA/cm2
Les groupements carboxyliques ont été modifiés avec de l’anthracène et de l’anthraquinone afin d’immobiliser la laccase. Ils ont mesuré des densités de courant (même ordre de grandeur) de -93,8 et -151,7 µA/cm2 respectivement.
Procédé d’amination
On peut aussi fonctionnaliser les CNTs par amination. Il s’agit d’une réaction au cours de laquelle un groupement amine est greffé à la surface d’un matériau par voie électrochimique. Sosna et al. [50] ont électro-oxydé des amines primaires modifiées par de l’anthracène et de l’anthraquinone sur du carbone vitreux. Les amines ont été protégés en utilisant le groupe fonctionnel tert-butoxycarbonyl (Boc) afin d’éviter la formation de plusieurs couches. Bartlett et al. [51] ont quant à eux mesuré sur des nanotubes de carbone fonctionnalisés par une diamine protégée (C6H4CH2NHBoc) puis modifiée par du 2-anthraquinone carboxylique une densité de courant de -3,5 mA/cm2 sur électrode tournante (Figure I.22).
Fonctionnalisation par procédé plasma
Dans le cas de la fonctionnalisation par électroréduction de sels de diazonium, il est difficile de contrôler l’épaisseur de la couche. On observe la formation de multicouches qui entravent le transfert des électrons. Quant à l’oxydation, elle peut parfois détruire la structure de surface du matériau. Pour surmonter ces limitations liées à la fonctionnalisation des matériaux carbonés, le procédé plasma peut constituer une alternative (le principe du procédé plasma sera décrit dans le chapitre IV). Un plasma d’azote permet d’avoir une large gamme de fonctions azotées à la surface du matériau (amines, imines, nitriles), tandis qu’un plasma d’oxygène permet d’avoir des groupements oxygénés (hydroxyles, carbonyles et carboxyliques). Selon les paramètres du plasma, on peut contrôler la densité des groupements fonctionnels. De plus, le procédé plasma est non polluant, rapide et de faible cout. La méthode plasma la plus utilisée est le jet plasma à la pression atmosphérique (APPJ) en raison de sa facilité d’utilisation. Dans le cas de la fonctionnalisation des matériaux carbonés, seulement une publication a utilisé ce procédé [52]. Récemment l’immobilisation de la laccase sur des membranes à base de polymères traités par plasma pour une utilisation en tant que biocapteur a été étudiée [53, 54]. Dans le cas des biopiles enzymatiques, Ardhaoui et al. [3] ont fonctionnalisé du graphite par APPJ en étudiant l’influence de plusieurs paramètres (type d’immobilisation, nature du plasma…). Ils ont obtenu une densité de courant de réduction du dioxygène maximale de -108 µA/cm2 après immobilisation de la laccase par voie covalente.
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Table des matières
CHAPITRE I. BIBLIOGRAPHIE
I.1. LES BIOPILES ENZYMATIQUES
I.1.1. CONTEXTE GENERAL
I.1.2. PRINCIPE DE FONCTIONNEMENT D’UNE BIOPILE
I.1.3. LES BIOPILES MICROBIENNES
I.1.4. LES BIOPILES ENZYMATIQUES
I.2. LES ENZYMES EMPLOYEES DANS LES BIOPILES ENZYMATIQUES
I.2.1. GENERALITES SUR LES ENZYMES
I.2.1.1. La structure d’une enzyme
I.2.1.2. Mécanisme et cinétique des réactions enzymatiques
I.2.2. LES ENZYMES OXYDOREDUCTASES
I.2.2.1. Les enzymes employées dans le compartiment anodique
I.2.2.2. Les enzymes employées dans le compartiment cathodique
I.2.3. LA LACCASE
I.2.3.1. Caractéristiques physico-chimiques des laccases
I.2.3.2. Structure de la laccase B de Trametes versicolor
I.2.3.3. Applications industrielles de la laccase
I.3. L’IMMOBILISATION DES ENZYMES
I.3.1. IMMOBILISATION PAR ADSORPTION
I.3.2. IMMOBILISATION PAR LIAISON COVALENTE
I.3.3. IMMOBILISATION PAR ENCAPSULATION
I.3.4. IMMOBILISATION PAR RETICULATION
I.4. LES SUPPORTS EMPLOYES DANS LES BIOPILES ENZYMATIQUES
I.4.1. LES MATERIAUX CARBONES
I.4.2. L’OR
I.5. FONCTIONNALISATION DE LA SURFACE DES ELECTRODES
I.5.1. LES MATERIAUX CARBONES
I.5.1.1. Electroréduction de sels de diazonium
I.5.1.2. Traitement acide et oxydant
I.5.1.3. Procédé d’amination
I.5.1.4. Fonctionnalisation par procédé plasma
I.5.1.5. π-stacking
I.5.1.6. Fonctionnalisation par électropolymérisation
I.5.2. LES MATERIAUX CARBONES COMPOSITES
I.5.3. LES ELECTRODES D’OR
I.6. BIOPILE ENZYMATIQUE : VERS DES DISPOSITIFS IMPLANTABLES
I.7. CHOIX DES SYSTEMES D’ETUDE ET METHODOLOGIE
CHAPITRE II. MATERIELS ET METHODES
II.1. PRODUCTION DE LA LACCASE
II.1.1. CULTURE DE TRAMETES VERSICOLOR
II.1.2. CONCENTRATION DU MILIEU DE CULTURE
II.1.3. PURIFICATION DE LA LACCASE
II.1.3.1. Chromatographie échangeuse d’ions
II.1.3.2. Chromatographie d’interaction hydrophobe
II.1.4. OXYDATION DE LA LACCASE
II.2. ELABORATION DES ELECTRODES
II.3. IMMOBILISATION DE LA LACCASE
II.3.1. IMMOBILISATION COVALENTE DE LA LACCASE SUR L’ELECTRODE
II.3.1.1. Formation d’une liaison amide
II.3.1.2. Formation d’une liaison imine
II.3.2. IMMOBILISATION PAR ADSORPTION
II.4. MESURE DE LA SURFACE ELECTROACTIVE DE L’ELECTRODE DE GRAPHITE
II.4.1. PRINCIPE
II.4.2. PROTOCOLE EXPERIMENTAL
II.5. MESURE DE L’ACTIVITE ENZYMATIQUE DE LA LACCASE
II.5.1. PRINCIPE
II.5.2. PROTOCOLE DE MESURE DE L’ACTIVITE ENZYMATIQUE DE LA LACCASE
II.6. MESURE DU COURANT BIOCATALYTIQUE
II.7. CARACTERISATION DE LA SURFACE DE L’ELECTRODE
II.7.1. MICROSCOPIE ELECTRONIQUE A BALAYAGE (MEB)
II.7.2. SPECTROMETRIE PHOTOELECTRONIQUE A RAYONS X (XPS)
CHAPITRE III. ELABORATION D’UNE CATHODE GRAPHITE/A-CNX/LACCASE: EFFET DE L’ORIENTATION DE LA LACCASE IMMOBILISEE
III.1. MATERIELS ET METHODES
III.1.1. ELABORATION DE LA BIOCATHODE : DEPOT D’UNE COUCHE MINCE DE NITRURE DE CARBONE AMORPHE (A-CNX) PAR PULVERISATION CATHODIQUE REACTIVE MAGNETRON
III.1.2. MESURE DE LA STABILITE DE LA BIOCATHODE PAR CHRONOAMPEROMETRIE
III.1.3. CARACTERISATION DE LA SURFACE DE LA BIOCATHODE PAR AFM
III.1.4. LA SPECTROSCOPIE D’IMPEDANCE ELECTROCHIMIQUE (SIE)
III.2. RESULTATS ET DISCUSSION
III.2.1. CARACTERISATION MORPHOLOGIQUE ET CHIMIQUE DE LA COUCHE D’A-CNX AVANT ET APRES TRAITEMENT ANODIQUE
III.2.2. MESURES DE DENSITES DE COURANT BIOCATALYTIQUES DE L’ORR POUR DIFFERENTES METHODES D’IMMOBILISATION DE LA LACCASE
III.2.3. ACTIVITE DE LA LACCASE IMMOBILISEE VIS-A-VIS DE L’ABTS ET DETERMINATION DU TAUX DE COUVERTURE EN ENZYMES ACTIVES.
III.2.4. DETERMINATION DU TAUX DE COUVERTURE TOTAL EN ENZYMES PAR XPS
III.2.5. DETERMINATION DU TAUX DE COUVERTURE TOTAL EN ENZYMES ET DE LEUR ORIENTATION SUR LE SUBSTRAT PAR AM-AFM ET PI-AFM.
III.2.6. EVALUATION DE LA STABILITE DE L’ACTIVITE BIOELECTROCATALYTIQUE DE LA LACCASE IMMOBILISEE VIS-A-VIS DE L’ORR.
III.2.7. CARACTERISATION DE L’ACTIVITE BIO-ELECTROCATALYTIQUE DE LA LACCASE ENVERS L’ORR PAR SPECTROSCOPIE D’IMPEDANCE ELECTROCHIMIQUE
III.3. CONCLUSION
CHAPITRE IV. ELABORATION D’UNE CATHODE GRAPHITE/NANOWALLS DE CARBONE/LACCASE:EFFET DE LA NANOSTRUCTURATION DE L’ELECTRODE
IV.1. MATERIELS ET METHODES
IV.1.1. LE PROCEDE PLASMA
IV.1.1.1. Nanostructuration du graphite par revêtement par des nanowalls de carbone
IV.1.1.2. Fonctionnalisation du graphite/CNWs par plasma atmosphérique
IV.1.2. CARACTERISATION DE L’ELECTRODE PAR SPECTROSCOPIE PHOTOELECTRONIQUE A RAYONS X
IV.1.2.1. Identification de groupements aldéhydes à la surface de l’électrode
IV.1.2.1.1. Mise en évidence des groupements carboxyliques à la surface de l’électrode par une méthode chimique
IV.1.3. MESURE D’ANGLE DE CONTACT
IV.1.4. LA METHODE DES PLANS D’EXPERIENCES
IV.1.4.1. Principe de la méthode des plans d’expériences
IV.1.4.1.1. L’espace expérimental
IV.1.4.1.2. Surface de réponse
IV.1.4.1.3. Modélisation mathématique
IV.1.4.2. Plan factoriel fractionnaire du 1er degré
IV.1.4.3. Plan composite
IV.1.4.4. Plan de Doehlert
IV.1.4.5. Détermination des facteurs influents
IV.2. RESULTATS ET DISCUSSION
IV.2.1. CARACTERISATION DE LA SURFACE D’UNE ELECTRODE GRAPHITE/CNWS
IV.2.2. DETERMINATION DE LA SURFACE ELECTROACTIVE D’UNE ELECTRODE GRAPHITE/CNWS
IV.2.3. PERFORMANCES D’UNE ELECTRODE GRAPHITE/CNWS: ESSAIS PRELIMINAIRES
IV.2.3.1. Analyse XPS après traitement APPJ
IV.2.3.2. Performances bioélectrobiocatalytiques
IV.2.4. OPTIMISATION DES CONDITIONS DE TRAITEMENT PLASMA PAR LA MISE EN PLACE DE PLANS D’EXPERIENCES
IV.2.4.1. Optimisation des conditions de traitement plasma atmosphérique sur électrodes de graphite nu
IV.2.4.1.1. Plan d’expérience factoriel fractionnaire
IV.2.4.1.2. Plan d’expérience composite
IV.2.5. PERFORMANCES DES ELECTRODES GRAPHITE/CNWS DANS LES CONDITIONS DE TRAITEMENT PLASMA OPTIMISEES
IV.2.5.1. Electrodes graphite/CNWs60s
IV.2.5.1.1. Conditions de traitement plasma issues du plan d’expérience composite avec électrodes de graphite/CNWs60s
IV.2.5.1.2. Plan Doehlert
IV.2.5.2. Electrode graphite/CNWs120s
IV.2.5.2.1. Immobilisation de la laccase oxydée
IV.3. CONCLUSION
CHAPITRE V. ETUDE PAR PM-IRRAS DE L’IMMOBILISATION DE LA LACCASE SUR UNE SURFACE D’OR PLANE
V.1. MATERIELS ET METHODES
V.1.1. LA SPECTROSCOPIE PM-IRRAS
V.1.1.1. La spectroscopie infrarouge
V.1.1.2. Principe de l’IRRAS
V.1.1.3. Principe du PM-IRRAS
V.1.1.4. Dispositif expérimental
V.1.1.5. Spectroscopie infrarouge des protéines
V.1.1.5.1. Modes de vibration de la liaison peptidique
V.1.1.5.2. Modes de vibration en fonction l’orientation de la protéine sur la surface
V.1.2. PREPARATION DES PLAQUES D’OR
V.1.2.1. Prétraitement des plaques d’or
V.1.2.2. Greffage des SAMs (Self Assembled Monolayer)
V.1.2.3. Immobilisation de la laccase
V.2. RESULTATS ET DISCUSSION
V.2.1. CARACTERISATION EX SITU DE L’IMMOBILISATION DE LA LACCASE
V.2.1.1. Analyse PM-IRRAS
V.2.1.2. Analyse XPS
V.2.2. ETUDE PM-IRRAS EN PHASE LIQUIDE (IN SITU)
V.2.2.1. Etude PM-IRRAS
V.2.2.2. Analyses XPS
V.3. CONCLUSION
Conclusion générale et perspectives
Annexes
Annexe 1 Production de la laccase mutante
Annexe 2 Saturation de la solution tampon acétate en oxygène
Références
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