Détection du polymorphisme

DETECTION DU POLYMORPHISME

Mise au point et conditions d’amplification

PCR Pour chaque couple d’amorces, la température d’hybridation proposée par RAIZ a été réajustée sur un Mastercycler Gradient Eppendorf en microplaque de 96 puits. L’ADN génomique, 15 ng pour chaque échantillon, est amplifié par PCR dans un volume total de 25 J.!l contenant 0,2 J.!M de chaque amorce, 1 ng de BSA, 200 J.!M de chaque dNTP, 0,05% de détergent W-1 (Invitrogen), 12,5 J.!l de tampon 10X stérile [166 mM CNH4)2S04, 670 mM Tris HCl pH=8, 20 mM MgCh, 0,7 % mercaptoéthanol] et 1 U de Taq DNA polymérase (Invitrogen). Les conditions d’amplification sont les suivantes : une dénaturation initiale de 4 min à 94°C suivie de 35 cycles comprenant une dénaturation (30 secondes (sec) à 94°C), une hybridation (1 min à une température spécifique pour chaque couple d’amorces) et une élongation (1 min à 72 °C), et enfin une élongation finale de 5 min à 72 °C. Les températures d’hybridation spécifiques à chaque couple d’amorces fournies par la compagnie RAIZ ont d’abord été testées, et selon les besoins, des tests de gradient de température ont été réalisés. D’ autres tests ont été réalisés sur la composition du mélange réactionnel des PCR: la quantité d’amorces (de 0,1 J.!M à 0,4 J.!M), la concentration en MgCh (de 0 mM à 3,5 mM), la nature, la concentration du cation et leur combinaison (KCl à 25 mM ou 50 mM, et NH4 à 16,6 mM ou 8mM), la provenance du lOX (soit produit au laboratôire, soit fourni avec la Taq DNA polymerase (Invitrogen)) ont été les paramètres variants de ces tests. Pour chaque produit PCR, la spécificité d’amplification est vérifiée après une électrophorèse sur gel d’agarose à 2% dans du TBE (Tris Borate EDTA) 0,5X et une coloration au BET (bromure d’éthidium).

Mise au point et conditions d’amplification

PCR Pour chaque couple d’amorces, la température d’hybridation proposée par RAIZ a été réajustée sur un Mastercycler Gradient Eppendorf en microplaque de 96 puits. L’ADN génomique, 15 ng pour chaque échantillon, est amplifié par PCR dans un volume total de 25 J.!l contenant 0,2 J.!M de chaque amorce, 1 ng de BSA, 200 J.!M de chaque dNTP, 0,05% de détergent W-1 (Invitrogen), 12,5 J.!l de tampon 10X stérile [166 mM CNH4)2S04, 670 mM Tris HCl pH=8, 20 mM MgCh, 0,7 % mercaptoéthanol] et 1 U de Taq DNA polymérase (Invitrogen). Les conditions d’amplification sont les suivantes : une dénaturation initiale de 4 min à 94°C suivie de 35 cycles comprenant une dénaturation (30 secondes (sec) à 94°C), une hybridation (1 min à une température spécifique pour chaque couple d’amorces) et une élongation (1 min à 72 °C), et enfin une élongation finale de 5 min à 72 °C. Les températures d’hybridation spécifiques à chaque couple d’amorces fournies par la compagnie RAIZ ont d’abord été testées, et selon les besoins, des tests de gradient de température ont été réalisés. D’ autres tests ont été réalisés sur la composition du mélange réactionnel des PCR: la quantité d’amorces (de 0,1 J.!M à 0,4 J.!M), la concentration en MgCh (de 0 mM à 3,5 mM), la nature, la concentration du cation et leur combinaison (KCl à 25 mM ou 50 mM, et NH4 à 16,6 mM ou 8mM), la provenance du lOX (soit produit au laboratôire, soit fourni avec la Taq DNA polymerase (Invitrogen)) ont été les paramètres variants de ces tests. Pour chaque produit PCR, la spécificité d’amplification est vérifiée après une électrophorèse sur gel d’agarose à 2% dans du TBE (Tris Borate EDTA) 0,5X et une coloration au BET (bromure d’éthidium).

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Table des matières

1. INTRODUCTION 2. MATERIELS ET METHODES
!. MATERJEL VEGETAL
2. EXTRACTION D’ ADN GENOM!QUE
3. CARACTERJST!QUES DES E ST ET DES GENES ETUDIES
4 . MISE AU POINT ET CONDITIONS D’ AMPLIFICATION PCR
5. REVELATION DU POL YMORPHlSME CHEZ LES GENITEURS
Par SSCP
Par PCR-RFLP
Séquençage des produits PCR
6. CARTOGRAPHIE GENETIQUE
3. RESULTATS .
!. AMPLIFICATION DES EST ET DES GENES
2. DETECTION DU POLYMORPHISME
Par SSCP Par utilisation d’enzymes de restriction
Séquençage des produits d ‘amplification
3. CARTOGRAPHIE GENETIQUE DES SEQUENCES
Localisation des séquences polymorphes uniquement chez E
Localisation des EST polymorphes uniquement chez E. grandis
Localisation des séquences polymorphes chez les deux
4. DISCUSSION
1. SSCP
2. LES CAUSES MOLECULAIRES DE LA DETECTION DE POL YMORPHlSME EN SSCP
3. LES AUTRES APPORTS DU SEQUENÇAG E
4 . LA TRANSFERAB!LITE DES EST
5. CARTOGRAPHIE
S. CONCLUSION ET PERSPECTIVES

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