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LES ACTINOMYCETES
Généralités sur les actinomycètes
Définition des actinomycètes
D’un point de vue étymologique, le mot Actinomycète provient des mots grecs « Aktis » qui veut dire rayon et « mykes » qui veut dire champignon. Les actinomycètes ont été considérés comme étant un groupe intermédiaire entre bactéries et champignons du fait qu’ils possèdent une structure procaryote, mais que leur cycle biologique est semblable à celui de certains champignons.
Similitude entre actinomycètes et bactéries
Les propriétés suivantes suggèrent toutes l’appartenance des actinomycètes aux bactéries:
le noyau étant dépourvu d’une membrane nucléaire;
le diamètre des filaments et des spores des actinomycètes similaires à ceux des eubactéries;
la reproduction de la plupart des actinomycètes se fait par des fragments ou des spores qui sont de forme et de taille similaires aux formes bacillaires et coccoïdes des bactéries;
la composition de la paroi cellulaire ne montrant ni la présence de cellulose ni celle de la chitine;
La sensibilité aux attaques virales (propriété comparable à celle des eubactéries); Cependant, les actinomycètes, surtout les formes les plus évoluées, rivalisent en complexité morphologique avec les champignons.
Similitude entre actinomycètes et champignons (Alexander, 1961)
Il existe deux points qui rapprochent les actinomycètes des champignons :
le mode de branchement du mycélium aérien chez les différents groupes d’actinomycètes (qui ressemble énormément à celui des champignons) ;
la production de mycélium et de spores qui est définitivement typique à plusieurs espèces de champignons.
Caractéristiques générales des actinomycètes
Les actinomycètes forment un groupe de microorganismes procaryotes à Gram positif, généralement filamenteux et sporulant. Ils sont hétérotrophes et la majorité des actinomycètes connus sont mésophiles mais il existe des individus capables de se multiplier à des températures avoisinant les 50°C, on les appelle les « Thermoactinomyces » (Omura, 1992).
En comparaison aux autres bactéries qui ont une croissance rapide avec un temps de génération d’environ 20 min, les actinomycètes ont une croissance plus lente avec un temps de génération moyen de 2 à 3 heures (Ottow et Glathe ,1968 ; Larpent et Sanglier, 1989). Ils ont un ADN riche en Guanine et en Cytosine puisque leur taux de GC est supérieur à 55%. Parmi les actinomycètes, le genre Streptomyces est le plus dominant et les non-Streptomyces sont appelés actinomycètes rares.
Ecologie et distribution des actinomycètes
Les actinomycètes sont les habitants communs du sol. Leur production de géosmine et de MIB (2-méthyl isobornéol) contribue significativement à l’odeur caractéristique du sol. Ils sont, souvent, moins reconnus en tant qu’organismes importants du sol comme c’est le cas des cyanobactéries et des champignons tels que Penicillium sp. et Chaetomium sp. qui sont des producteurs importants de métabolites secondaires (Zaitlin et Waston, 2006).
Les actinomycètes ont été également isolés de nombreux environnements aquatiques. Ils ont été isolés de l’eau de mer et des sédiments marins (Ghanem et al., 2000); d’eau douce (Kitouni et al., 2005) et dans les marécages salés (Boughachiche et al., 2005).
Les actinomycètes se rencontrent également sur les débris végétaux qu’on trouve au bord des rivières et des lacs, les champs de riz (Wang et al., 2006) et les cavernes naturelles (Lee, 2006). Beaucoup sont capables de sporuler, ce qui leur permet de survivre en conditions défavorables telles que la salinité (Zaitlin et Waston, 2006).
Biologie de développement
Les actinomycètes possèdent un caractère tout à fait remarquable qui se traduit le plus souvent par une différenciation importante et l’existence d’un cycle biologique semblable à celui de certains Eucaryotes.
En effet, la plupart des actinomycètes développent, sur un milieu gélosé, une masse d’hyphes mycéliens répartis en deux couches distinctes: le mycélium aérien et le mycélium du substrat (figure 2). Selon les cas, des spores peuvent se former sur le mycélium aérien ou sur le mycélium du substrat ou les deux à la fois, pour permettre la propagation de la souche.
Mycélium aérien et mycélium du substrat
Le mycélium du substrat, également dénommé mycélium végétatif ou primaire, se développe à partir du tube de germination issu de la spore (Theilleux, 1993). Il est ancré dans le support solide où il puise les nutriments. La croissance des hyphes est apicale.
Le mycélium aérien, appelé aussi mycélium secondaire, est formé d’hyphes dressés sur le mycélium du substrat. Ces hyphes aériens sont plus épais et beaucoup moins ramifiés que les hyphes du substrat. Ils sont en général pigmentés et enfermés dans une enveloppe externe hydrophobe.
Divers mutants de Streptomyces sans mycélium aérien ou incapables de sporuler ont été décrits (Chater et Merrick, 1979).
Classification des actinomycète
Au cours de ces trente dernières années, la taxonomie des actinomycètes est passée par plusieurs stades. Son évolution est étroitement liée à l’évolution du nombre des genres des actinomycètes. Ainsi, les 5 genres d’actinomycètes recensés en 1948 en comptent 10 en 1958 et 37 en 1974 selon la huitième édition du “Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology” (Gottlieb, 1974).
L’application des critères chimiotaxinomiques en plus des critères morphologiques et biochimiques a permis, en 1989, de répartir les actinomycètes en sections de 26 à 33.
Une nouvelle classification basée uniquement sur l’analyse des séquences de l’ARNr 16S et des gènes codant pour l’ARNr 16S a été proposée par Stackebrandt et al., en 1997. Dans cette classification, une nouvelle classe a été décrite.
Actuellement, on sait, selon la seconde édition du « Taxonomic Outline of The Procaryotes, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology » (Garrity et al., 2004), que le phylum Actinobacteria est constitué d’une seule classe dénommée également Actinobacteria qui est subdivisée en cinq sous-classes : ACIDIMICROBIDAE, RUBROBACTERIDAE, CORIOBACTERIDAE, SPHAEROBACTERIDAE, ACTINOBACTERIDAE.
Relations plantes-actinomycètes
Les actinomycètes sont des microorganismes capables de coloniser la rhizosphère grâce à leurs caractères antagonistes et compétitifs vis-à-vis des autres microorganismes du sol. Certains sont connus pour leur production de sidérophores qui permettent de chélater le fer, privant ainsi cet élément aux autres microorganismes (Cao et al., 2005), ou de lutter contre certaines maladies des plantes (Getha et al., 2005).
D’autres sont parasites de champignons en produisant des enzymes qui leur permettent de dégrader la paroi des cellules fongiques (Mahadevan et Crawford, 1997). Le parasitisme des mycélia de champignons par les actinomycètes a été décrit dans plusieurs travaux (El-Tarabily et Sivasithampar, 2006 ; Errakhi et al., 2007 ; Jain et Jain, 2007).
Les actinomycètes peuvent également agir par compétition nutritionnelle et spatiale contre les microorganismes phytopathogènes. Leur faculté d’adaptation à différents milieux rhizosphériques leur permet d’être de bons compétiteurs.
Les métabolites secondaires des actinomycètes
Les métabolites secondaires sont définis comme étant des composés de faible poids moléculaire, non essentiels à la croissance du microorganisme producteur mais que celui-ci peut utiliser pour d’autres mécanismes biologiques (défense, parasitisme, etc.).
Une des propriétés les plus significatives des actinomycètes est leur aptitude à synthétiser de nombreux métabolites bioactifs, parmi lesquels on compte les deux tiers des antibiotiques produits par les microorganismes. A ces antibiotiques s’ajoutent d’autres métabolites à grande potentialité industrielle entre autres les enzymes, les nucléotides et certaines vitamines. Par contre, les actinomycètes sont absents dans trois secteurs : la production d’acides organiques, de polysaccharides et d’alcaloïdes.
Chez les actinomycètes, la production de métabolites secondaires est souvent associée à une croissance limitée correspondant à la phase stationnaire de la courbe de croissance ou idiophase (Rondags et al., 2003).
Les germes tests
Ils proviennent de la collection du Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement du CNRE et sont utilisés pour le test d’activité antimicrobienne. Ces germes comprennent 4 bactéries à Gram négatif dont : Enterobacter cloacae ATCC 700323, Klebsiella oxytoca ATCC 8724, Escherichia coli et Salmonella enteridis ATCC 13076 ; 3 bactéries à Gram positif qui sont : Staphylococcus aureus ATCC 11632, Bacillus cereus ATCC 13061 et Streptococcus pneumoniae ATCC 63012; et enfin 2 champignons dont une levure : Candida albicans et un champignon phytopathogène de plantes: Fusarium sp.
METHODES
Isolement des actinomycètes
Isolement des actinomycètes à partir du sol
Le but de cette étape est d’isoler et ainsi d’obtenir le maximum de souches d’actinomycètes contenues dans l’échantillon de sol. La technique d’isolement des souches d’actinomycètes proposée par le Laboratoire de Daw Agro Sciences (DAS) aux Etats Unis a été appliquée.
Trois méthodes ont été utilisées: sélection par antibiotiques, traitement à haute température, sol aérosolisé. Ces trois méthodes consistent à isoler les souches d’actinomycètes à partir de l’échantillon de sol en utilisant le milieu AS1 (Antibiotic Selection 1) (la composition est présentée en annexe 1) additionné d’antibiotiques.
Une semaine avant son utilisation pour l’isolement des souches d’actinomycètes, l’échantillon de sol est distribué dans des boîtes de Pétri. Ces boîtes sont ensuite laissées dans un dessiccateur sous vide contenant du silicagel qui absorbe l’humidité. Cette étape préliminaire permet de sélectionner les souches d’actinomycètes présentes dans l’échantillon de sol.
Techniques d’isolement
Sélection par antibiotiques
Cette première méthode consiste à peser 1 g de sol de l’échantillon puis à le mettre en suspension dans un tube à essai contenant 9 ml d’eau distillée stérile. Après agitation au vortex, 1 ml de ce mélange est prélevé puis versé dans un deuxième tube à essai contenant également 9 ml d’eau distillée stérile, des dilutions en cascade sont ainsi réalisées jusqu’à la dilution 10-2.
A partir de chacune des deux dilutions, 0,1ml de solution est prélevé puis étalé à l’aide d’un racloir stérile sur le milieu AS1 solide additionné des 3 antibiotiques : triméthoprime (à une concentration de 25µg/l), cycloheximide (10µg/l), et acide nalidixique (10µg/l). Les boîtes de Pétri sont ensuite incubées à 30°C et observées quotidiennement pendant une durée de 4 semaines.
Traitement à haute température
Ici, un gramme de l’échantillon de sol est placé dans une étuve à 100°C pendant une heure. Par la suite, cet échantillon est mis en suspension dans 9 ml d’eau distillée stérile, puis des dilutions en cascade sont effectuées jusqu’à la dilution 10-2. Pour l’ensemencement, les deux dilutions 10-1 et 10-2 sont retenues. Un dixième de millilitre de chacune de ces dilutions est alors étalé sur le milieu d’isolement et les boîtes sont ensuite incubées à 30°C pendant 4 semaines.
Sol aérosolisé
Un gramme de l’échantillon de sol est placé dans le récipient Grayson Aerosol Sampler (GAS) stérile. Le récipient est ensuite fermé, agité vigoureusement et laissé reposer pendant une heure. Après une heure, le couvercle et le bouchon de la boîte de GAS sont retirés, et une boîte de Pétri contenant le milieu AS1 est placée en position renversée à 1 cm de l’ouverture de la GAS. En utilisant un petit tuyau et une poire, de l’air est produit par pompage disséminant ainsi les spores dans la GAS vers le milieu solide. Les boîtes de Pétri sont ensuite incubées à 30°C pendant 4 semaines.
Isolement des actinomycètes à partir des différents organes de la plante
La méthode d’isolement des actinomycètes à partir des racines, des feuilles ou des tiges des plantes décrite par DAS a été adoptée dans cette étude.
Préparation du matériel végétal
Chacune des différentes parties de la plante (tiges, feuilles, racines) est tout d’abord soumise à une stérilisation superficielle : il s’agit alors, dans un premier temps, de les tremper dans de l’alcool 70° pendant 30 secondes puis de les placer dans de l’eau de javel 6° chlorométrique à 3% pendant 3 min; Ceci fait, les racines, tiges et feuilles sont rincées trois fois à l’eau distillée stérile pour éliminer les résidus de chlore. Deux méthodes sont alors effectuées pour l’isolement des actinomycètes : soit l’organe en question est directement placé dans la boîte de Pétri contenant le milieu de culture, soit quelques échantillons sont broyés dans un mortier stérile contenant 10 ml de MRD (Maximum Recovery Diluant) stériles (la composition est donnée en annexe 1).
Inoculation du milieu
La première méthode nécessite l’implantation directe des organes stériles dans les boîtes de Pétri contenant le milieu AS1 solide additionné des 3 antibiotiques. Pour la seconde méthode, le broyat obtenu a été dilué. Pour cela, deux tubes à essais contenant chacun 9 ml de MRD stérile ont été préparés. Un millilitre du broyat a été prélevé et dilué dans le premier tube et une série de dilutions est réalisée jusqu’à la dilution 10-2. Un dixième de millilitre des deux dilutions a ensuite été déposé sur les boîtes de Pétri contenant du milieu AS1; puis étalé à l’aide d’un racloir stérile. Les boîtes de Pétri sont alors incubées à 30°C pendant une semaine à 30 jours.
Prélèvements des colonies d’actinomycètes
Dans un premier temps, les colonies d’actinomycètes sont repérées d’après leur aspect macroscopique caractéristique (colonies dures incrustées dans la gélose). Puis par leur aspect microscopique (colonies circulaires constituées d’hyphes), par observation directe sous microscope optique (grossissement × 10).
Pour une observation plus claire, une colonie entière est placée sur une lame stérile et après élimination du maximum d’agar, elle est légèrement écrasée avec une lamelle et observée sous microscope optique (grossissement ×40) (Suzuki, 2001). Les colonies d’actinomycètes sont toutes repiquées sur le milieu AS1.
Conservation des souches d’actinomycètes
A partir d’une culture pure, quelques colonies d’actinomycètes sont prélevées à l’aide d’une œse stérile puis mises en suspension dans un cryotube stérile contenant 1 ml de glycérol 20% (V/V) (Isik et al., 1999). Les cryotubes contenant les souches à conserver sont ensuite immédiatement placés dans un congélateur à -80°C.
Mise en évidence de l’activité antimicrobienne des souches d’actinomycètes
Mise en évidence de l’activité antibactérienne
L’évaluation de l’activité antibactérienne des souches d’actinomycètes sur les germes test a été réalisée selon la méthode des cylindres d’agar (Acar et Goldstein, 1996).
Pour chaque souche test, un inoculum a été préparé à partir d’une culture de 24 heures sur Gélose nutritive pour les bactéries et sur milieu Sabouraud pour la levure. Une ou deux colonies bien isolées ont été prélevées à l’aide d’une anse stérile et diluées dans 10 ml d’eau distillée stérile. La densité cellulaire de l’inoculum est ensuite mesurée au spectrophotomètre de manière à obtenir une densité optique égale à 0,125 à la longueur d’onde 550 nm, ce qui correspond à 106 UFC/ml. La surface entière du milieu Muëller Hinton solide (dont la composition est présentée en annexe 1) est inondée par 10 ml de l’inoculum contenant 106 UFC/ml de germes. La culture est incubée dans une étuve à 37°C pendant 15 min afin que les germes puissent adhérer au milieu.
Puis, l’excès de liquide est aspiré à l’aide d’une micropipette stérile et le milieu est séché pendant 15 min dans une étuve à 37°C.
Des cylindres d’agar de 6 mm de diamètre de souches pures d’actinomycètes sont prélevés à l’aide d’emporte-pièces stériles et sont ensuite déposés dans les boîtes de Pétri contenant le milieu Mueller-Hinton, préalablement ensemencé avec les germes tests. Trois répétitions ont été réalisées pour chaque test. L’activité a été évaluée par la mesure des zones d’inhibition après 1 à 2 jours d’incubation à 37°C. Les isolats présentant une zone d’inhibition supérieure à 8 mm ont été considérés comme souches actives.
Mise en évidence de l’activité antifongique
La production de métabolites antifongiques par les souches d’actinomycétales est mise en évidence par la technique utilisée par Loqman et al. en 2009 ; illustrant également la technique des cylindres d’agar.
Déroulement de la confrontation
Les souches d’actinomycètes sont ensemencées sur milieu AS1 et incubées pendant 14 jours à 30°C, alors que celles des champignons sont ensemencées sur milieu PDA (la composition est présentée en annexe 1) et incubées à 28°C pendant 72 heures.
Des cylindres d’agar de 6 mm de diamètre des souches d’actinomycètes et des souches fongiques sont ensuite préparés à l’aide de transfert-tubes. Les cylindres d’agar des isolats d’actinomycètes sont transférés aseptiquement sur les côtés des boîtes de Pétri contenant du milieu PDA, tandis que celui de la souche fongique est déposé au centre des boîtes de Pétri à la distance d= 3 cm de la culture d’actinomycètes. Des cultures des souches fongiques sans actinomycètes servent de témoins négatifs. L’incubation a été réalisée à 30°C pendant 5 jours et trois répétitions ont été effectuées pour chaque test.
II.3.2.2. Evaluation des résultats
L’évaluation de l’inhibition exercée par des germes antagonistes est estimée par le calcul du pourcentage d’inhibition de la croissance mycélienne par rapport au témoin selon la formule suivante (Khamna et al., 2009):
PI (%) : Pourcentage d’inhibition de la croissance mycélienne de champignon phytopathogène par le germe antagoniste.
Mo (mm): Mesure de la croissance mycélienne normale représentant le rayon opposé à la colonie du germe testé.
Mi (mm): Mesure de la croissance mycélienne de champignon phytopathogène influencée
Evaluation de l’activité antioxydante des extraits issus des souches d’actinomycètes
Production et extraction de métabolites secondaires
Cette étape vise à stimuler et à inciter les souches d’actinomycètes à produire des métabolites secondaires bioactifs par fermentation sur milieu solide et à extraire la quasi-totalité de ces derniers dans le milieu de fermentation.
Fermentation sur milieu solide
De la culture pure d’actinomycètes, une colonie est prélevée à l’aide d’un écouvillon stérile, puis ensemencée en surface sur le milieu APFM (la composition est présentée en annexe 1) solide. Les cultures sont ensuite incubées pendant 8 jours dans une étuve à 30°C.
Extraction
Après 8 jours d’incubation, on procède à l’extraction de métabolites secondaires produits par les actinomycètes. Pour cela, 30 ml d’acétate d’éthyle ont été versés dans le milieu APFM. Le mélange est par la suite laissé pendant 2 heures à température ambiante, et est filtré à l’aide d’un stériflip de porosité 0,45 µm. Les extraits sont distribués dans des tubes en verre stériles et séchés dans le Speedvac (température 50°C, Vaccum pressure 05,1 Vac). Les résidus secs obtenus sont conservés à +4°C jusqu’à utilisation.
Evaluation de l’activité antioxydante
Test préliminaire
L’activité antioxydante des extraits issus des souches d’actinomycètes a été mise en évidence par CCM. Le développant utilisé a été le gradient de solvants Acétate d’éthyle/Méthanol (9:1; v/v). La plaque est ensuite révélée par imbibition par la solution de DPPH. Pour cela, elle est plongée pendant quelques secondes dans la solution de DPPH. La plaque chromatographique est ensuite séchée à la température ambiante pendant quelques minutes. L’apparition de taches jaune pâles sur fond violet (ou pourpre), témoigne de l’activité antioxydante des extraits.
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Table des matières
INTRODUCTION
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I. DONNEES SUR OCOTEA
I.1. Le genre Ocotea à Madagascar
I.2. Usages du genre Ocotea
I.3. Description et position systématique de la plante Ocotea trichophlebia
II. LES ACTINOMYCETES
II.1.Généralités sur les actinomycètes
II.1.1. Définition des actinomycètes
II.1.2. Similitude entre actinomycètes et bactéries
II.1.3. Similitude entre actinomycètes et champignons
II.2. Caractéristiques générales des actinomycètes
II.3. Ecologie et distribution des actinomycètes
II.4. Biologie de développement
II.4.1. Mycélium aérien et mycélium du substrat
II.5. Classification des actinomycètes
II.6. Relations plantes-actinomycètes
II.7. Les métabolites secondaires des actinomycètes
MATERIELS ET METHODES
I. MATERIELS
I.1. Matériel végétal
I.2. Echantillonnage de sol
I.3. Les germes tests
II. METHODES
II.1. Isolement des actinomycètes
II.1.1. Isolement des actinomycètes à partir du sol
II.1.2. Techniques d’isolement
II.1.3. Isolement des actinomycètes à partir des différents organes de la plante
II.1.3.1. Préparation du matériel végétal
II.1.3.2. Inoculation du milieu
II.1.3.3. Prélèvement des colonies d’actinomycètes
II.2. Conservation des souches d’actinomycètes
II.3. Mise en évidence de l’activité antimicrobienne des souches d’actinomycètes
II.3.1. Mise en évidence de l’activité antibactérienne
II.3.2. Mise en évidence de l’activité antifongique
II.3.2.1. Déroulement de la confrontation
II.3.2.2. Evaluation des résultats
II.4. Evaluation de l’activité antioxydante des extraits issus des souches d’actinomycètes
II.4.1. Production et extraction de métabolites secondaires
II.4.1.1. Fermentation sur milieu solide
II.4.1.2. Extraction
II.4.2. Evaluation de l’activité antioxydante
II.4.2.1. Test préliminaire
II.4.2.2. Mesure de l’activité antioxydante par la méthode de DPPH
II.4.3. Etude préliminaire pour l’identification de la famille chimique probable des composés actifs
II.5. Traitement statistique
RESULTATS
I. ISOLEMENT DES SOUCHES D’ACTINOMYCETES
I.1. Les souches d’actinomycètes endophytes
I.2. Les souches d’actinomycètes telluriques
II. ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DES SOUCHES D’ACTINOMYCETES
III. ACTIVITE ANTIFONGIQUE DES ISOLATS D’ACTINOMYCETES
IV. ACTIVITE ANTIOXYDANTE DES EXTRAITS ISSUS DES SOUCHES D’ACTINOMYCETES
V. IDENTIFICATION DE LA FAMILLE CHIMIQUE PROBABLE DES COMPOSES ACTIFS
DISCUSSION
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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