Soutenance mémoire
Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études
Profil en taille des ARNs
Il a été montré dans le cas des ARNs que le degré d’intégrité pouvait affecter fortement la détection par RT-qPCR contrairement à une PCR classique.120 Des efforts doivent donc être menés pour que cette caractéristique soit connue lors de détection des miARNs. Il a par ailleurs été démontré que la dégradation des plus longs fragments d’ARN pouvait mener à une surestimation du niveau de miARNs.121
Afin de pouvoir mesurer individuellement la quantité d’ARNs de différentes tailles, il est indispensable de les séparer. Pour ce faire, on utilise le principe de l’électrophorèse qui consiste à la migration des acides nucléiques dans un gel (aussi appelé matrice solide) contenant des pores dans lesquels les plus courtes séquences vont migrer plus vite. La migration dépend d’une forte tension qui, de par la présence de charges négatives sur l’atome phosphate des nucléotides composant les séquences ADN ou ARN, s’accompagne du déplacement des séquences vers le pôle positif imposé par le champ électrique. Un détecteur en fluorescence ou UV permet d’évaluer le temps de passage d’une molécule devant le détecteur, ce temps étant directement relié à sa taille.
Ce type de séparation peut être implémenté sur capillaire ou bien sur puce microfluidique. Contrairement aux électrophorèses classiques, la réduction des dimensions avec ce type de technologies présente l’avantage de permettre une meilleure dissipation thermique, et donc l’application de champs électriques plus importants, poussant les limites de détection à la dizaine de ng/mL.
Plusieurs technologies telles que le Fragment Analyzer (AATI) en électrophorèse capillaire ou le Bioanalyzer (Agilent) en format puce microfluidique sont aujourd’hui utilisées en routine dans les laboratoires de recherche et de biologie clinique afin de caractériser les échantillons extraits.
Mesure d’expression génique
Une fois l’échantillon purifié, quantifié et validé, il est possible de détecter une séquence spécifique. Plusieurs méthodes sont bien connues, nous allons les aborder dans la suite par ordre chronologique d’apparition. Notons cependant que la RT-qPCR reste le standard le plus utilisé dans les laboratoires de biologie depuis son arrivée dans les années 1990.
Northern Blot
Le Northern Blot est une adaptation à la détection d’ARN du Southern Blot mis en place par Edwin Southern en 1975,122 qui permettait la détection spécifique de séquence ADN. Aussi appelé transfert d’ARN, il consiste en un gel d’électrophorèse qui permet dans un premier temps la séparation des ARNs en fonction de leur taille, comme décrit dans la section précédente, en condition dénaturante. Le formaldéhyde utilisé en routine peut être remplacé par de l’urée pour améliorer la dénaturation des ARNs de courte taille.123 Après séparation des ARNs, ces derniers sont transférés sur une membrane en nylon par capillarité et pression. Cette étape de report est nécessaire afin de pouvoir effectuer la révélation avec des sondes spécifiques aux séquences ARNs à détecter. L’étape de détection est réalisée à l’aide d’une sonde complémentaire ADN, ARN ou encore incorporant des nucléotides de type LNA (Locked Nucleic Acid) marquée de façon radioactive, ou plus récemment, avec un fluorophore.124,125 Malgré sa bonne sélectivité, cette méthode contient beaucoup de limites telles que l’utilisation de produits dangereux (formaldéhyde), la faible sensibilité ainsi que le nombre important d’étapes pour arriver aux résultats menant à un temps de détection très long (~ 4 jours).126 Elle est, par conséquent, de moins en moins utilisée de nos jours car très contraignante malgré l’avantage d’être une méthode quantitative qui permet également de connaître la taille des ARNs détectés.
La RT-qPCR
La PCR, pour polymerase chain reaction en anglais, a été pour la première fois mise en place en 1985 par Mullis,127 qui recevra le prix Nobel de chimie huit ans plus tard pour cette découverte. Cette méthode de détection se base sur l’amplification de séquences d’oligonucléotides via des réactions enzymatiques. Une solution de PCR est généralement composée des séquences à amplifier, d’amorces ADN complémentaires à la cible, de nucléotides libres (qui permettront la réplication des nouvelles séquences) et, bien sûr, de l’enzyme polymérase qui permet l’élongation des nouvelles séquences ADN dans le sens 3’ vers 5’. Des concentrations en ions bivalents (e.g. Mg2+ ou Mn2+) et monovalents (K+) sont nécessaires afin d’obtenir une réaction enzymatique optimale. Une fois le matériel en solution, la PCR se base sur des cycles en température afin d’actionner l’amplification. Une étape de dénaturation à une température de 95°C est tout d’abord effectuée afin de casser les structures secondaires et d’ouvrir ainsi la matrice, les amorces sont ensuite hybridées à leur séquence d’ADN cible à une température comprise entre 50 et 65°C (température d’hybridation) pour finalement se placer à 72°C, température optimale de fonctionnement de la polymérase et permettre ainsi l’élongation de la chaine naissante (température d’élongation) (cf. Figure 1-10).
Figure 1-10 : principe de l’amplification par PCR, les séquences cibles (en vert) sont d’abord dénaturées (étape 1) puis appareillées avec les séquences d’amorce (en rouges) (étape 2) et enfin leur élongation est effectuée à l’aide des nucléotides présents dans le mix de réaction (en bleus) (étape 3), ces étapes sont répétées pendant un nombre de cycle fixé par l’expérimentateur.128 Dans le cas de la détection d’ARN, l’étape de PCR doit être précédée d’une RT (transcription inverse ou reverse transcriptase en anglais), c’est-à-dire d’une transcription inverse des ARNs en séquences d’ADNs complémentaires (ANDc). Cette conversion des ARNs en ADNc rencontre des limitations dans le cas des miARNs, de par leur petite taille mais également en raison de la présence dans l’extrait de pre-miARNs et pri-miARNs qui peuvent entrer en compétition.41 Pour permettre cette transcription inverse il est possible d’utiliser des amorces spécifiques aux miARNs, ou alors d’ajouter une queue de nucléotides aux miARNs à l’aide d’une ligase à laquelle l’amorce sera spécifique. La première méthode permet de réduire le bruit de fond, alors que la seconde, plus universelle, laisse plus de place à la détection de plusieurs cibles en même temps. On peut noter cependant qu’Ozsolak et al. ont montré en 2009 la possibilité d’une PCR adaptée à la détection directe d’ARN.129
Des améliorations technologiques ont permis par la suite le développement de la qPCR (PCR quantitative), le suivi de la détection s’est fait dans un premier temps par incorporation de bromure d’éthidium.130 La qPCR se distingue ici de la PCR classique (aussi appelée PCR point final) où la mesure était déterminée à la fin des n cycles. Dans le cas de la qPCR une mesure en fluorescence est réalisée automatiquement après chaque cycle d’amplification, on parle donc de PCR en temps réel. Aujourd’hui, deux technologies sont principalement utilisées. La première consiste à utiliser un intercalant, comme le SYBR Green, dont la fluorescence est multipliée par 100 lorsqu’il est lié à une séquence double brin d’ADN. On comprend que le SYBR Green n’est pas spécifique à une séquence, il peut donc détecter des produits d’ADN double brin non spécifiques de la qPCR, ou même des dimères d’amorces. L’analyse de la courbe de fusion en fin de détection permet de s’assurer de la spécificité de l’amplification.
La détection des produits ADN par une sonde TaqMan est en revanche beaucoup plus spécifique. Cette sonde est marquée avec un fluorophore à une extrémité et un désactivateur (c’est-à-dire une molécule permettant d’absorber l’émission de lumière par le fluorophore) à l’autre extrémité de la séquence complémentaire aux cibles ADNs. Du fait de la proximité du fluorophore est du désactivateur, on mesure une absorption de la lumière émise. En revanche, lors de l’étape d’amplification, c’est l’activité de l’exonucléase qui entraine le clivage de la séquence TaqMan lorsque cette dernière se trouve en interaction avec la séquence ADN cible. On observe alors une augmentation du signal fluorescent du fait de l’éloignement du désactivateur par rapport au fluorophore. Cette approche a l’avantage d’avoir une excellente sensibilité et autorise la détection de plusieurs cibles en même temps (cf. Figure 1-11).41
Les puces à ADN
Les puces à ARN, aussi appelées microarrays en anglais, sont des matrices de sondes complémentaires spécifiques aux miARNs étudiés. Ces sondes ADN sont greffées sur une surface généralement en verre via des groupements amine en fin de chaîne. Dans le même temps, les miARNs sont habituellement marqués avec un fluorophore (cf. Figure 1-12). Une analyse par mesure de fluorescence pour chaque spot d’ADN, dont la spécificité est connue, rend alors possible la détermination du niveau d’expression des différents miARNs. Cette technique de détection a été largement utilisée pour la détection et la quantification des miARNs131–133 même si des étapes de validation par RT-qPCR sont souvent nécessaires.82,134 Le design des sondes est une étape cruciale : en effet, les affinités des différents couples ARN/ADN doivent être très proches, sans quoi les niveaux de fluorescence ne seront pas comparables car un taux d’hybridation donné ne sera pas équivalent à la même concentration de cible miARNs en solution d’un duplex à l’autre. Il est alors possible de jouer sur la longueur de la sonde ou bien d’intégrer des bases LNA dans la séquence sonde135 pour équilibrer les constantes d’association. La méthode de marquage des miARNs est elle aussi discutable car elle peut mener à de mauvais rendements et influencer la mesure.
Bien que les approches par microarray soient peu couteuses et permettent de détecter un nombre important de cibles sur une même puce, on peut relever que les temps d’incubation de ces méthodes sont très longs (~ 18h). De plus les quantités d’ARN total nécessaires à la détection des miARNs sont très importantes (de l’ordre du µg).137
Le nanostring
En 2008, une nouvelle technologie similaire aux microarrays : le nanostring, est devenue accessible aux chercheurs pour la quantification de l’expression génique138. La première application dédiée aux miARNs a été publié dès 2012 par Nuovo et al.139 avec la détection de plus de 700 miARNs simultanément. Cette méthode dépend de la cible recherchée et notamment de sa taille ; dans le cas des miARNs, les séquences miARNs subissent dans un premier temps une ligation avec une séquence contenant un code-barre constitué de six marqueurs fluorescents : l’ordre dans lequel ils sont disposés permet d’identifier la séquence miARN ciblée lors de l’étape d’analyse. Cette ligation s’effectue à l’aide d’une troisième séquence qui fait office de « pont » entre le code barre et la séquence miARN (cf. Figure 1-13). La première étape consiste donc à effectuer cette hybridation, précédée d’une dénaturation et succédée par une purification, via des réactions enzymatiques afin d’éliminer les codes-barres en excès. L’étape d’hybridation dure au moins 12h et se pratique à 65°C. Les codes-barres sont ensuite adsorbés sur une surface en métal via l’application d’un courant et l’analyse assistée par ordinateur permet de compter le nombre de codes-barres correspondants aux différentes séquences recherchées. Bien que souvent décrite comme plus sensible, cette technique se rapproche de la sensibilité des microarrays,140 sa sélectivité serait en revanche nettement améliorée.141
Les micro et nanotechnologies pour la biodétection des miARNs
Nous discuterons dans cette partie des approches basées sur les micro et nanotechnologies pour la détection des miARNs. Après un bref historique et la mise en place de considérations sur le réel potentiel d’utilisation de ces technologies en clinique, un effort sera fait pour mettre en avant les applications au plus proche de l’analyse d’échantillons complexes.
Histoire et intérêt des micro et nanotechnologies pour la biologie
La micro-électronique se base sur l’industrie des semi-conducteurs apparue à la fin des années cinquante. Les matériaux semi-conducteurs, de par leurs propriétés uniques de conduction du courant, sont à la base des circuits électriques intégrés. En effet, il est possible de contrôler localement leurs propriétés électriques en intégrant des défauts (typiquement l’insertion d’atomes accepteurs ou donneurs d’électrons, e.g. de bore ou phosphore) dans leurs structures : on parle de dopage du matériau. Cette modification par dopage a permis la réalisation technologique des transistors bipolaires, puis MOS. Ce composant est une porte logique qui constitue la brique élémentaire de tout circuit intégré aujourd’hui. C’est la réduction des dimensions de ce composant qui fut à l’origine des premiers pas vers la miniaturisation des circuits électroniques.
On parlait déjà, dans les années soixante, d’électronique moléculaire (comme on parle de nanoélectronique aujourd’hui), technologie qui permettrait d’atteindre des niveaux de miniaturisation encore plus poussés. Depuis, l’industrie (Westinghouse, IBM ou encore AT&AT) a, conjointement avec la recherche académique, permis le développement de nouvelles approches techniques pour réduire la dimension des composants fabriqués par la filière silicium.152 On a pu observer alors un parfait respect de la loi de Moore153 qui prévoyait dès 1965 que le nombre de transistors pour une surface donnée doublerait quasiment tous les 18 mois (cf. Figure 1-16).
Les progrès opérés dans la micro et nanofabrication du silicium ont permis la réduction des dimensions des dispositifs électroniques. Les conséquences directes se sont produites dans le domaine de l’informatique, mais l’intégration de plus en plus poussée de la microélectronique a aussi permis la mise en place de nouvelles générations de capteurs. Le premier pas fait vers la biologie de la part des physiciens et électroniciens a été la mesure de concentration d’espèces chimiques en solution. On parlait alors de biocapteurs pour tout instrument qui permettait de faire une mesure dans un système biologique (pH, température, etc.).155 Cependant cette notion a très rapidement évoluée, et c’est au début des années soixante que Clark définit le biocapteur comme la combinaison d’une couche de reconnaissance biologique avec un capteur physique156,157 en fonctionnalisant des électrodes avec des enzymes permettant la mesure de la concentration d’oxygène. Les mesures étaient alors essentiellement effectuées via des capteurs électrochimiques. Les couches sensibles ont ensuite pu être couplées à des capteurs optiques, mécaniques, etc. De plus, alors que les enzymes ont un effet catalytique sur les réactions mises en jeu, il a été par la suite mis en place des couches d’éléments spécifiques (avec une grande affinité) aux cibles recherchées tels que des anticorps, des acides nucléiques ou encore des ligands synthétiques.
Outre l’émergence des biocapteurs, les méthodes de microfabrication ont permis l’émergence de la microfluidique dès les années quatre-vingt,158 c’est-à-dire de la fabrication de canaux fluidiques avec des dimensions comprises entre 1 et 100 µm comme définit par Whitesides.159 Cette nouvelle approche est, en effet, une conséquence directe du développement de la technologie silicium et a permis la manipulation de fluides dans des volumes réduits (nL-fL), ainsi que des niveaux d’intégrations et d’automatisations importants.
On comprends alors qu’en réduisant la taille des capteurs, ainsi que des systèmes qui manipulent les objets biologiques, on se rapproche des dimensions de ces derniers, ce qui rend leur étude plus adaptée160 (cf. Figure 1-17). On permet, de plus, des niveaux d’intégration très importants, c’est-à-dire la possibilité de coupler plusieurs fonctions sur un même système d’analyse. La formule « laboratoire sur puce » promet cette combinaison des fonctions multiples d’un laboratoire d’analyse, permettant alors une approche « sample-in, answer-out ».161 Il est difficile ici de ne pas faire l’analogie avec l’informatique : en effet, le premier ordinateur nécessitait un nombre important d’opérateurs et occupait un espace comparable à un laboratoire d’analyse médicale aujourd’hui (en 1946, le premier ordinateur occupait une surface de 137 m2) pour des performances incomparables avec les technologies informatiques actuelles. Cependant, un tel développement dans les technologies biomédicales semble moins direct. En effet, ce développement demande des expertises dans des domaines très variés : la microfabrication, la chimie, la biologie, la microfluidique, la bioinformatique, etc.162
Vers une application clinique des micro et nanotechnologies ?
Les standards actuels utilisés en biologie pour la détection de miARNs sont rarement basés sur des technologies de micro et nano fabrication. Nous souhaitons ici démontrer les possibilités de telles approches à un niveau clinique. Nous allons nous concentrer sur les dispositifs issus des nouvelles technologies pour la détection du cancer en clinique. On peut cependant noter que les applications peuvent être déclinées à des champs cliniques vastes et variés (imagerie médicale, nanoparticules, thérapie génique, délivrance de médicament, etc.).
De manière générale, le constat en clinique démontre les limitations des méthodes microarray (bien que séduisantes de prime abord) qui nécessitent des marquages et des temps de manipulation longs et chers. De son côté la PCR, comme cela a déjà été décrit, repose sur une amplification et peut faire apparaître des biais qui peuvent s’avérer importants. Cette méthode reste, en revanche, très utilisée notamment dans des applications en lien avec l’oncologie, l’infectiologie et la virologie. Dans ce contexte, la demande en clinique pour des méthodes de détection plus rapides, sans marquage, directes, moins chères et fiables est constante. Mais les micro et nanotechnologies pourraient-elles satisfaire ces critères ?
Le diagnostic moléculaire et la mise en place de systèmes de détection à l’échelle de la cellule unique sont des problématiques biologiques qui intéressent de plus en plus les chercheurs et qui profitent de développements technologiques récents, comme c’est le cas de l’approche single cell 10x genomics. Ces approches permettraient, en effet, d’appréhender plus efficacement l’hétérogénéité tumorale, pour pouvoir mettre en place un diagnostic personnalisé au chevet du patient prenant ainsi la suite de la médecine de masse qui a montré certaines limitations, notamment dans la prise en charge oncologique.163 D’autres indicateurs sont très positifs : on peut noter dans une étude de 2013 de Etheridge et al.164 l’arrivée des nouvelles technologies en clinique. En effet, 247 études cliniques impliquent actuellement des nano et des microtechnologies, basées sur 141 produits distincts (un même produit peut parfois participer à plusieurs tests) dont 38 sont d’ores et déjà approuvés. Si une majorité des micro et nanotechnologies concerne la prise en charge du cancer, on remarque de plus qu’une grande partie des technologies associés aux différents essais sont les systèmes tests, devant l’imagerie (cf. Figure 1-18). On peut citer, par exemple, le Verigene qui permet la détection à la fois de protéines et d’ADN sans PCR en se basant sur des technologies de type microarray.165
Enfin, une étude plus récente discute du potentiel industriel de ces nouvelles applications biomédicales dans le domaine du cancer.166 Selon les auteurs, les nouvelles technologies devront répondre à plusieurs questions dont celle (encore une fois) de la meilleure compréhension de l’hétérogénéité des cancers et des facteurs biologiques qui les influent. On note ici que des tests à valeur de diagnostic et pronostic pourraient donc permettre une meilleure connaissance des cancers mais aussi, et par conséquence, une meilleure prise en charge des patients au niveau des traitements proposés. De façon remarquable, ce type de test compagnon devrait devenir une condition sine qua none de la mise sur le marché des prochaines thérapies innovantes en oncologie, afin de limiter non seulement les risques d’échecs thérapeutiques et mais également de justifier le prix grandissant des nouveaux traitements.
Le principe de transduction : de l’évènement biologique au signal physique
Dans la suite du manuscrit, les méthodes de détection avancées se baseront toujours sur le même principe : dans un premier temps, une bio-reconnaissance des molécules spécifiques de miARNs est effectuée, on entend par bio-reconnaissance, la capture des cibles par une sonde, cela correspond donc à la partie biologique du capteur. Cette capture doit engendrer ensuite un changement physique, on parle alors de transduction de la reconnaissance biologique en signal physique. Ce dernier peut être de natures variées : optique, mécanique ou encore électrique (cf. Figure 1-19). Ces voies comportent des avantages et limites que nous allons décrire, notamment dans le cadre de la détection et de la quantification des miARNs.
Les approches électrochimiques et électriques
Détection électrique
La détection électrique de miARNs est basée sur la mesure d’un courant ou d’une différence de potentiel suite par exemple au changement de résistance d’un système après hybridation du miARN avec la sonde. Elle permet, en général, d’avoir des niveaux de détection bas, une bonne sélectivité du miARN et un faible coût.
Une première manière de procéder est d’utiliser des nano-pores dont la résistance électrique peut être modulée par le passage des ARNs. Dans les travaux de Tian et al., la détection est effectuée en deux étapes : dans un premier temps, les miARNs sont hybridés avec des sondes PNA (Peptid Nucleic Acid), ces sondes ont la particularité d’être électriquement neutres car les nucléotides ne contiennent pas de groupement phosphate. Chaque sonde est de plus conjuguée à un peptide polycationique (c’est-à-dire, un peptide chargé positivement). Après hybridation avec le miARN (qui est chargé négativement), un dipôle est alors formé et conduit jusqu’au nano-pore (formé à l’intérieur d’une bicouche lipidique) via un fort gradient de champ électrique (cf. Figure 1-20). Les miARNs n’ayant pas subi d’hybridation restent, quant à eux, chargés négativement et s’éloignent des nano-pores de par l’influence du champ électrique. Lorsqu’un complexe miARN/PNA traverse le nano-pore, un décalage en intensité de l’ordre de quelque picoampère est observé via une mesure du courant. Cette méthode à l’avantage de bénéficier d’une très bonne sélectivité (détection d’une seule différence de nucléotide) et de présenter une limite de détection de l’ordre du picomolaire. Cependant, la preuve de concept a été réalisée en utilisant des miARNs synthétiques dilués à des concentrations connues dans des tampons contenant du chlorures de potassium.168 On note ainsi la présence de contraintes fortes liées à l’utilisation d’une solution tampon qui doit être compatible avec une mesure électrique et ne permet donc pas de traiter des échantillons peu purifiés.
Description de la plateforme nanofluidique sélectionnée pour ces études
Considérations générales sur la micro et nanofluidique
La microfluidique est apparue dans les années 1980. Elle est une des conséquences directes des avancées de la microélectronique apparue 20 ans plus tôt. Elle se distingue néanmoins des circuits intégrés par le fait que ce ne sont pas des courants électriques mais des fluides qui sont manipulés. Comme décrit par Georges Whitesides dans la revue Nature en 2006,1 la microfluidique peut se définir comme « la science et la technologie des systèmes qui manipule des petits volumes (10-9 à 10-18 litres), en utilisant des dimensions de la dizaine à la centaine de micromètres ». Les avantages de la microfluidique sont nombreux, on peut souligner par exemple la consommation de faibles volumes de fluides, ce qui permet d’économiser du matériel (avantage clé pour une application clinique, où les échantillons biologiques sont souvent peu conséquents) ainsi que d’améliorer l’efficacité des réactions et la dissipation thermique. C’est aussi une technologie à faible coût, robuste et permettant une grande reproductibilité, dans le sens où les flux sont laminaires et donc prévisibles car décrits de manière très fine par des modèles physiques (notamment avec les équations de Navier-Stokes). La microfluidique a fait ses preuves via de multiples applications, allant du domaine biomédical (délivrance de médicament avec dosage précis, biodétection, etc.) jusqu’à la purification de l’eau ou encore les batteries et piles à combustible.
La nanofluidique ou, dans notre cas, la fluidique submicronique (ou encore nanofluidique étendue), complète l’espace entre les objets de taille nanométrique (1 – 10 nm) et la microfluidique (1 – 1000 µm). L’observation de phénomènes liés au confinement de fluide à cette échelle est réalisée depuis plusieurs décennies via l’étude de matériaux naturellement nanoporeux (e.g. zéolite, gel, etc.). On peut cependant souligner que les récentes avancées dans les procédés de nanofabrication ont permis de contrôler les dimensions des systèmes ainsi fabriqués.2,3 Cela a, par conséquent, rendu possible la compréhension et la prédiction des effets liés à une réduction des échelles.4
Les implications de la nanofluidique ont alors pu être étudiées autant dans le cas de recherches théoriques mettant en avant des propriétés originales (liées à un rapport surface sur volume important inhérent à l’échelle nanométrique),5 que pour des applications en biologie et chimie telles que la séparation de molécules avec des nanofiltres,6,7 leur pré-concentration8 ou encore le confinement de biomolécules dans des nanocanaux.9 Enfin, la nanofluidique a des conséquences importantes sur la biodétection, avec notamment des effets sur les réactions mises en jeu.10 Cependant, ces effets restent, jusqu’à aujourd’hui, peu étudiés. Nous allons, par conséquent, dans la suite du chapitre, décrire l’intérêt de l’utilisation d’une plateforme nanofluidique dans la détection de miARNs en nous appuyant sur un modèle de simulation par dynamique moléculaire.
Effet de la réduction des échelles sur la détection de biomolécules
Intérêt de la réduction des échelles pour la capture des miARNs
Prenons le cas d’un capteur spécifique à une cible biologique d’intérêt en solution couplé à un microcanal ou un nanocanal (cf. Figure 2-1). Les effets du confinement entrainent une réduction importante du temps de diffusion des molécules cibles jusqu’au capteur intégré (car ce temps caractéristique varie en fonction du carré de l’inverse de la hauteur du canal) comme précédemment décrit dans la littérature.11 La conséquence directe est que le taux de capture, c’est-à-dire le ratio entre le nombre de cibles consommées sur le nombre de cibles capturées, est très important. En effet, du fait de ce temps de diffusion considérablement réduit, la probabilité d’une molécule se trouvant dans le canal de rencontrer le capteur lors de son temps de parcours au-dessus de ce dernier est bien plus importante.
Figure 2-1: différence et implication de la réduction de la hauteur de canal sur la capture de biomolécules dans (a) un système microfludique et (b) une plateforme nanofluidique : du fait du confinement on observe dans le deuxième cas un gradient spatial de concentration en molécules cibles (en rouge) dû à l’interaction qui s’établit avec les molécules sondes greffées en surface (en bleues). Dans le cas (a) en revanche la concentration en cible est homogène au-dessus de la surface car la hauteur élevée du canal ne permet pas la mise en place d’une interaction pour toutes les molécules cibles : certaines échappent donc à la capture.
Afin de mieux aborder ce problème, il peut être utile de décrire plusieurs grandeurs caractéristiques des systèmes micro et nanofluidiques telles que le nombre de Péclet (PeH) qui définit le rapport entre le transport par convection et celui par diffusion. Ainsi dans le cas d’un microcanal, la valeur de PeH sera typiquement supérieure à 1, ce qui signifie que l’interaction est limitée par la diffusion des molécules jusqu’au capteur. De la même manière, dans le cas d’un nanocanal, nous obtenons PeH < 1. Il est alors possible de conclure que l’accroche des cibles sera, cette fois, limitée par la convection, c’est-à-dire la vitesse de la solution au-dessus du capteur.
Pour comprendre comment le capteur interagit avec les cibles en solution, il est intéressant de comparer le nombre de Péclet avec ! = %$ où l est la longueur du capteur et h, la hauteur du canal. Comme décrit par Squires et al.,12 dans le cas où le nombre de Péclet est suffisamment petit et λ assez grand, ce qui correspond à un régime limité par la convection couplé à un capteur grand par rapport à la hauteur de canal, il est possible d’obtenir des taux de capture proches de 100%, c’est-à-dire que chaque cible présente en solution a la possibilité d’interagir avec la surface.
Il est aussi intéressant de comparer la vitesse de réaction (liée à l’affinité du duplex mis en jeu et à la densité de sonde) à la vitesse de diffusion des molécules via le nombre de Damkölher, &’ = . Dans le cas de nanocanaux, tout comme pour le nombre de Péclet, le terme Da est inférieur à 1. Selon la vitesse de convection des cibles au-dessus du capteur, la détection sera alors soit limitée soit par la convection, soit par la réaction en surface du capteur.
Si l’interaction a lieu dans un microcanal (et pour un capteur de taille micrométrique), alors PeH > 1 et λ ~ 1 ; ainsi le taux de capture sera inférieur à 100% et la concentration en cibles sera homogène sur tout la surface du capteur, entrainant une interaction uniforme sur ce dernier. En revanche, dans le cas d’un nanocanal, il est possible d’observer une déplétion des molécules de la solution.12 En effet, comme le temps de diffusion des cibles jusqu’à la surface est très court (PeH < 1) et que le capteur est long par rapport à la hauteur du canal (λ > 1), on mesure, dans un premier temps, l’hybridation des premiers micromètres seuls du capteur. Lorsque la densité de sondes disponibles devient trop faible, la suite du capteur est hybridée et ainsi de suite jusqu’à hybridation totale de la surface. On peut alors parler ici d’hybridation non-uniforme du capteur au cours du temps (cf. Figure 2-1). On peut noter que ce type de phénomènes peut être aussi observable dans des microcanaux pour des surfaces d’accroche de longueur plus importantes et des vitesses de solution très faibles.
Ce type de système est également décrit comme une vague ou onde de cibles capturées par la surface et avançant au-dessus du capteur. En effet, du fait des très faibles volumes consommés, on observe une interaction en surface qui n’est pas homogène, entrainant ainsi la déplétion en cibles de l’échantillon biologique ; ainsi, l’hybridation du capteur s’effectue à une vitesse bien plus faible que la vitesse de la solution dans le canal.15,16
Ces considérations sont importantes afin de comprendre comment l’accumulation des cibles se déroule dans les conditions où les molécules sont confinées. Elles entrainent, par ailleurs, deux conséquences directes sur la biodétection. La première implique que le volume total de solution cible consommé est bien moindre dans le cas d’un nanocanal pour un même nombre de cibles capturées, ce point est pertinent pour l’étude d’échantillons cliniques souvent en quantité limitée. La deuxième, quant à elle, signifie qu’à volume équivalent les cibles sont hybridées sur une surface plus petite, ce qui signifie que la quantité de sondes hybridées par unité de surface est plus importante dans le cas des nanocanaux (pour un même débit de solution), ce point sera discuté plus amplement lors de l’analyse du modèle de simulation par dynamique moléculaire, à la fin de ce chapitre.
Effet connexe sur une détection avec des cibles marquées en fluorescence
Outre les conséquences de la nanofluidique sur la capture des biomolécules, il nous semble important de souligner l’implication d’une réduction de hauteur des canaux dans le cas d’une détection avec des cibles marquées en fluorescence. Ces dernières pourraient, en effet, bruiter le signal mesuré sur la zone du capteur. La mesure ne devient alors possible qu’après une étape de lavage du canal avec une solution sans cible afin de pouvoir permettre la détection. Dans le cas de notre plateforme nanofluidique, nous observons, en revanche, que le nombre de cibles en solution au-dessus du capteur est considérablement réduit (du fait de la réduction de la hauteur de canal), permettant alors une mesure de l’accroche des molécules en fluorescence en temps réel, sans étape de lavage. Par souci de clarté, nous soulignons ce point qui sera d’un intérêt capital dans le chapitre 3 car la détection par fluorescence est le mode de transduction (c’est-à-dire la méthode de détection qui permet de traduire la reconnaissance biologique en signal physique) que nous avons choisi pour la mise en place des manipulations expérimentales.
Il est important de noter que la plateforme nanofluidique, ainsi que le modèle décrit dans la suite du chapitre ont le potentiel d’être appliqués à n’importe quel mode de transduction (SPR, MEMS, etc.).
Réalisation du dispositif et modèle biologique utilisé
Description du dispositif
Le dispositif nanofluidique utilisé dans ces travaux est fabriqué sur des plaques de silicium standards de 100 mm de diamètre à l’aide des technologies de micro-fabrication issues de l’industrie microélectronique. Nous décrirons, dans cette partie, le design du dispositif, ainsi que son procédé de fabrication.
Conception des puces nanofluidiques
Le dispositif utilisé pour la détection de miARNs consiste en six canaux nanofluidiques d’une hauteur de 500 nm pour une largeur de 50 µm et une longueur de 500 µm. Au sein des nanocanaux se trouvent des plots en or de 50 µm par 50 µm (i.e. sur toute la largeur du canal), qui permettent d’effectuer des modifications de surface sélectives afin de rendre le dispositif spécifique d’une (ou plusieurs) espèce chimique ou biologique. Chaque nanocanal dispose de trois plots en or (qui constituent notre capteur dans le cas d’une détection en fluorescence, ils pourraient cependant être remplacés par n’importe quel type de capteur), la puce fluidique est donc composée, au total, de 18 zones de détection. Enfin, les nanocanaux sont reliés à des microcanaux d’une hauteur de l’ordre de 10 µm. Du fait de leur plus faible résistance hydrodynamique, ces derniers permettent les connections aux deux entrées et deux sorties de la puce tout en facilitant le remplissage des canaux fluidiques. On note que chaque puce présente une taille de 16 par 16 mm, ce qui permet d’en fabriquer jusqu’à 16 sur une seule et même plaque en silicium (cf. Figure 2-2).
Fabrication des puces fluidiques
Le principe de fabrication repose sur deux étapes de photolithographie successives puis un dépôt par évaporation des plots en or. De manière succincte, la photolithographie consiste à utiliser une couche de résine photosensible déposée via une enduction. Une étape d’insolation dans les ultraviolets de la plaque enduite de résine permet de changer la solubilité de la couche déposée localement. Ensuite, une étape de développement dans un solvant approprié rend possible la solubilisation de la résine sur des zones bien spécifiques avec une résolution de l’ordre du micromètre. La structuration de cette couche de résine permet d’exposer la surface de silicium à des attaques physico-chimiques afin de permettre sa gravure, tout en masquant les zones de la plaque en silicium que l’on souhaite laisser intactes.
Les premières étapes du procédé de fabrication des puces fluidiques consistent à graver de manière successive les micro puis les nanocanaux dans la plaquette de silicium (cf. Figure 2-2). Ensuite, une oxydation thermique est effectuée entre 800 et 1 200°C afin d’obtenir la formation d’une couche d’oxyde de silicium sur toute la surface de la plaque. Cette dernière est essentielle afin de rendre la surface des canaux hydrophile pour faciliter leur remplissage. En effet, ces dispositifs sont destinés à des applications en milieu liquide et la formation de bulles lors du remplissage des canaux peut parfois s’avérer très problématique.
|
Table des matières
Chapitre 1 : challenges techniques et enjeux translationnels de l’identification et de la quantification des miARNs pour la prise en charge du cancer du pancréas
1.1. Les microARNs
1.1.1. Histoire et découverte
1.1.2. Biogenèse des miARNs
1.1.3. Fonction et rôle des miARNs en oncologie
1.1.4. Les miARNs et le cancer du pancréas
1.1.5. Notion de biomarqueur : pourquoi les miARNs ?
1.2. De l’échantillon à la détection des miARNs : standards actuels, vers une application clinique
1.2.1. Considérations pré-analytiques
1.2.2. Approches standards d’extraction des miARNs
1.2.3. Méthodes de quantification et de qualification des échantillons extraits
1.2.4. Mesure d’expression génique
1.2.5. Bilan
1.3. Les micro et nanotechnologies pour la biodétection des miARNs
1.3.1. Histoire et intérêt des micro et nanotechnologies pour la biologie
1.3.2. Vers une application clinique des micro et nanotechnologies ?
1.3.3. Le principe de transduction : de l’évènement biologique au signal physique
Conclusion du chapitre 1
Références du chapitre 1
Chapitre 2 : description de la plateforme nanofluidique et considérations théoriques sur la capture de miARNs en milieu confiné
2.1. Description de la plateforme nanofluidique sélectionnée pour ces études
2.1.1. Considérations générales sur la micro et nanofluidique
2.1.2. Effet de la réduction des échelles sur la détection de biomolécules
2.2. Réalisation du dispositif et modèle biologique utilisé
2.2.1. Description du dispositif
2.2.2. De la nanofluidique au bio-capteur
2.3. Construction d’un modèle 1D pour l’étude de la capture des miARNs
2.3.1. Description du modèle
2.3.2. Approximations et résolution du modèle
2.4. Influence des choix expérimentaux sur la capture de miARNs
2.4.1. Cas d’une analyse globale du capteur : influence du flux sur la détection
2.4.2. Cas d’un capteur résolu spatialement : effet de la longueur de capteur analysée sur le signal détecté
2.4.3. Influence de la concentration en cibles sur le niveau de détection
Conclusion du chapitre 2
Références du chapitre 2
Chapitre 3 : mise en place de la plateforme nanofluidique couplée à une détection en fluorescence : analyse du profil d’hybridation et étude de sélectivité sur des miARNs exogènes
3.1. Commentaires préliminaires
3.2. Spatial analysis of nanofluidic-embedded biosensors for wash-free single-nucleotide difference discrimination
3.2.1. Abstract
3.2.2. Introduction
3.2.3. Results and discussion
3.3. Conclusion
3.4. Materials and methods
3.5. Associated content: supporting Information
Conclusion du chapitre 3
Références du chapitre 3
Chapitre 4 : vers une détection de miARNs endogènes dans des échantillons d’origine biologique
4.1. Vers une préparation d’échantillon dédiée à la détection de miARNs et compatible avec des systèmes nano et microfluidiques
4.1.1. Les RNases ou l’impossibilité de trouver des miARNs libres en circulation
4.1.2. Lyse des interactions entre les protéines ou les vésicules liées aux miARNs
4.1.3. Bilan
4.2. Méthodes de marquage pour la détection de miARNs endogènes
4.2.1. Choix de la séquence cible
4.2.2. Marquage des cibles par réaction enzymatique
4.2.3. Mise en place d’une détection avec des sondes marquées de types balises moléculaires
4.2.4. Quelle attitude adopter pour détecter et quantifier les miARNs endogènes
4.3. Dosage des miARNs dans des extraits de lignées cellulaires
4.3.1. Gamme étalon et sensibilité de la RT-qPCR
Conclusion du chapitre 4
Références du chapitre 4
Conclusion générale et perspectives
Références de la conclusion générale et des perspectives
Annexe A : biomarqueurs prédictifs en clinique
Annexe B : synthétisation du hard-PDMS
1. Quelques caractéristiques du hard-PDMS
2. Composants du hard-PDMS
3. Protocole
4. Dépôt du hard-PDMS
Annexe C : code MatLab
Annexe D : marquage Qubit
Annexe E : isolement des exosomes
Télécharger le rapport complet
