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Biogenèse des miARNs : aperçu général
La Figure 2A illustre les différentes étapes régissant la biogenèse ou processing des miRs. Seul le modèle dit canonique est représenté. D’autre mécanismes de biogenèse ont été aussi mis en évidence mais sembleraient être moins prépondérants (cf. §2.2.2). La biogenèse des miRs consiste en deux étapes séquentielles, l’une nucléaire et l’autre cytoplasmique, qui conduisent à la production d’un petit ARN de 21-23 nucléotides ayant la capacité de réguler l’expression d’un nombre variable de transcrits. Comme pour les ARNs messagers, les miARNs sont, pour la plupart, produits sous forme de transcrits primaires par l’ARN polymérase II (PolII) : on les appelle pri-miRs (ou miARNs primaires) (Lee 2004). Ces transcrits sont capés, polyadénylés et sont capables de se replier pour donner une structure secondaire en épingle à cheveux ou hairpin. Cette structure, caractérisée par une tige d’ARN double brin (dite imparfaite puisque renfermant quelques mésappariements) et une boucle terminale de taille assez variable, est reconnue par la ribonucléase III Drosha et son partenaire DGCR8 (DiGeorge syndrome critical region 8), nommé également Pasha chez la drosophile et le nématode. Durant cette étape nucléaire, Drosha clive les deux brins du pri-miR et libère une tige-boucle d’environ 60-70 nucléotides nommée pre-miR (ou miARN précurseur) (Lee 2002; Lee 2003). Les microARNs, comme nous venons de le voir, peuvent faire partie de séquences introniques, auquel cas le pri-miR correspondrait en réalité à une partie de l’intron, et l’étape catalysée par Drosha permettant de générer le pre-miR se déroulerait co-transcriptionnellement et au même moment que la réaction d’excision-épissage (splicing) (Figure 2B) (Kim 2007; Morlando 2008; Kim 2009). Le processing des miARNs exoniques est moins bien connu. Une étude récente du miR-155 a montré que le pre-miR peut être produit à partir de transcrits épissés ou non épissés. L’épissage et le transport cytoplasmique des transcrits épissés constituerait cependant des mécanismes permettant de réguler le taux de miARNs exoniques (Slezak-Prochazka 2013).
Le pre-miR est reconnu et transporté vers le cytoplasme grâce au complexe Exportine-5 couplé à la GTPase Ran (Yi 2003; Bohnsack 2004; Lund 2004). Une fois dans le cytoplasme, le pre-miR est pris en charge par Dicer, également une RNase III, qui sépare la tige de la boucle et libère un duplex « miR/miR* » ou « miR-5p/miR-3p » d’environ 22 pb. La coupure se fait à deux tours d’hélice de l’extrémité générée par Drosha (Bernstein 2001; Hutvagner 2001). Le duplex se caractérise entre autre par la présence de 2 nucléotides qui dépassent des extrémités 3’ (et qu’on appelle 3’ overhang). Cette asymétrie est la résultante directe des coupures effectuées par Drosha et Dicer (cf. §2.3.1). Un seul des deux brins du duplex (miARN guide) est préférentiellement incorporé dans le complexe RISC (pour RNA-induced silencing complex), l’autre brin (miR* ou brin passager) est généralement dégradé (Matranga 2005). Actuellement, et suite aux avancées majeures dans les techniques de nouvelles générations et de séquençage à haut débit, il est de plus en plus conseillé d’utiliser l’appellation miR-5p/miR-3p, les deux brins étant généralement exprimés dans les cellules*.
RISC est un complexe formé par l’assemblage du miR avec plusieurs protéines, dont les plus importantes et les plus étudiées sont les protéines Argonautes (AGO). Il permet au miR mature d’interagir avec son ARNm cible (il s’agit principalement du 3’UTR) et de réprimer son expression. Cette reconnaissance requiert la présence d’une complémentarité parfaite entre les nucléotides 2-7 du miR (qu’on appelle séquence seed) et le 3’UTR de l’ARNm. La reconnaissance d’un ARNm par le complexe RISC conduit la plupart du temps au blocage de la traduction de l’ARNm cible (par répression de la traduction suivie éventuellement par le clivage exonucléotidique de l’ARNm) ou au clivage endonucléotidique de l’ARNm (catalysé par AGO2, la seule protéine AGO à posséder une activité catalytique) si la complémentarité entre le miR et l’ARNm est parfait ou quasi-parfaite sur les 22 nucléotides (He 2004; Kim 2009).
Ce modèle de biogenèse est globalement conservé chez toutes les espèces. Cependant des différences existent. Les quelques exemples que nous citerons sont loin d’être exhaustifs, mais ils illustrent bien la grande diversité des mécanismes mis en jeu par différentes espèces pour générer des microARNs. Chez les plantes par exemple, la transition pri-miR → pre-miR et pre-miR → duplex miR/miR* est prise en charge par une seule RNase III jouant à la fois le * « Mature sequences from all human, mouse, and C. elegans precursors are now designated -5p and -3p, rather than miR/miR* ». Source : ftp://mirbase.org/pub/mirbase/18/README. rôle de Drosha et de Dicer : il s’agit de Dicer-Like1 ou DCL1 et son partenaire HYL1 (Hyponastic leaves 1). La structure des précurseurs miARNs chez les plantes est également différente, et nécessite plusieurs clivages par DCL1 avant que le duplex miR/miR* puisse être libéré (Czech 2011). Les plantes possèdent également trois autres protéines DCL nommées DCL 2-4, et qui seraient impliquées dans la biogenèse des siARNs et des tasiARNs (trans-acting siRNA) (Qi 2005). Par ailleurs, la drosophile, possède deux enzymes Dicer, nommés Dicer-1 (avec son partenaire Loquacious ou LOQS-PB) et Dicer-2 (avec son partenaire LOQS-PD ou R2D2) qui génèrent les miARNs et les siARNs, respectivement. Chez les mammifères (l’homme en particulier) une seule enzyme se charge à la fois des miARNs et des siARNs (Czech 2011). L’homme possède quatre protéines AGO, nommées AGO 1 à 4, qui n’ont visiblement pas de préférence pour le substrat, qu’il soit miARN ou siARN. La drosophile ne possède que deux protéines AGO (AGO 1 et 2), qui, comme pour Dicer 1 et 2, se chargent respectivement des miARNs et des siARNs (même si l’on trouve plusieurs exceptions à cette règle) (Czech 2011).
Les modèles non canoniques de biogenèse des miRs
Comme nous venons de le voir, certains microARNs se trouvent inclus dans les séquences introniques (Figure 2B). Dans des cas particuliers, la totalité de la séquence intronique, si elle est assez courte et si elle est capable de se replier en épingle à cheveux, constitue un pre-miR : ce type de précurseurs est appelé mirtrons. Le processing des mirtrons est indépendant de Drosha, mais nécessite deux étapes supplémentaires : le débranchement du lasso formé durant la réaction d’excision-épissage des messagers et le repliement de l’intron en hairpin. Les pre-miRs issus d’un intron rejoignent ensuite la voie classique de biogenèse des miRs (Okamura 2007). Une étude récente dénombre environ 240 mirtrons chez l’homme et 237 mirtrons chez la souris (Ladewig 2012). La biogenèse des mirtrons, si elle est indépendante de Drosha, peut nécessiter parfois la présence d’exonucléases 5’-3’ et 3’-5’ qui servent à raccourcir le mirtron dans le cas où l’une de ces extrémités est un peu plus longue que l’autre (trimming). Les mirtrons raccourcis à l’extrémité 3’ ont été retrouvés uniquement chez la drosophile et sembleraient impliquer le complexe de l’Exosome, alors que les mirtrons raccourcis à l’extrémité 5’ ont été annotés uniquement chez les vertébrés sans qu’une exonucléase 5’-3’ n’ait été expérimentalement identifiée (Yang 2011). D’autres mécanismes, indépendants de Drosha, ont également été mis en évidence. Nous citerons les pre-miRs dérivés des snoRNA (small nucleolar RNA, petits ARNs nucléolaires régissant les modifications enzymatiques post-transcriptionnelles des ARNs ribosomaux), les miARNs dérivés des shARNs endogènes (small hairpin RNA) tels que les miRs 320, 484 et 1980 et les miARNs dérivés des esiARNs (Endogenous small interfering RNAs) chez la drosophile. Dans la plupart des cas, l’enzyme qui libère les pre-miRs n’a toujours pas été identifiée (Miyoshi 2010; Yang 2011). Certains miRs peuvent aussi dériver d’ARNs de transferts : l’ARNt de l’isoleucine renferme le miR-1983 et peut adopter, en conformation alternative, une structure en épingle à cheveux pouvant constituer un substrat pour Dicer (Miyoshi 2010; Yang 2011). Par ailleurs, il existe également dans la cellule des voies de biogenèse indépendantes de Dicer. Le pre-miR-451, produit par Drosha, est exporté vers le cytoplasme, où, au lieu d’être pris en charge par Dicer, est incorporé dans AGO2. AGO2 est capable de cliver un des deux brins de la tige du pre-miR et une RNAse cellulaire rogne l’extrémité 3’ jusqu’à l’obtention d’un miR-451 mature (Cheloufi 2010).
Les RNases III, Drosha et Dicer
Drosha et Dicer font partie de la famille des end oribonucléases ou RNAses III. Cette famille d’enzymes est capable de cliver les ARNs doubles brins (miARNs, siARNs et autres ARNs doubles brins) et cela en présence d’ions magnésium Mg2+. Le clivage génère une extrémité caractérisée par deux nucléotides qui dépassent de l’extrémité 3’ (3’ overhang) qui est due au positionnement inter ou intramoléculaire des sites catalytiques. Trois classes de RNases.
III ont jusqu’à présent été découvertes. La classe I, retrouvée exclusivement chez les bactéries et la levure, possède un seul domaine RNase (RIIID) et est active sous forme de dimère. La classe II, dans laquelle figure Drosha, possède deux domaines RNases en tandem (RIIIDa et RIIIDb) qui forment un seul centre catalytique. Finalement la classe III, incluant Dicer, possède en plus des deux domaines RNases, un domaine PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille) fixant l’extrémité 3’ des ARNs doubles brins (Figure 3) (Tomari 2005; MacRae 2007).
Drosha, seule, est incapable de fixer l’ARN double brin et nécessite la présence du cofacteur protéique DGCR8, les deux formant alors ce qu’on appelle le complexe Microprocesseur (la spécificité de l’interaction ARN-Microprocesseur sera détaillée par la suite) (Gregory 2004). Les formes les plus simples de Dicer (celle du protozoaire Giardia intestinalis par exemple) contiennent uniquement le domaine PAZ et les RNases en tandem. La forme humaine de Dicer contient plusieurs domaines supplémentaires qui régulent la réaction de clivage et jouent un rôle d’échafaudage moléculaire aidant à la fixation de plusieurs cofacteurs protéiques. Il s’agit d’un domaine de fixation au cofacteur TRBP et aux protéines Ago, d’un domaine putatif de liaison à l’ARN double brin nommé DUF283, mais dont la fonction réelle n’est toujours pas connue (Domain of Unknown Function 283), et d’un domaine C-terminal de liaison à l’ARN double brin (Figure 3) (Kim 2009; Lau 2009). La forme humaine contient également un grand domaine N-terminal DExD hélicase-like dont la fonction n’a été qu’en partie élucidée (cf. §2.3.4) (Lau 2009; Sawh 2012).
L’étape catalysée par Drosha
La première étape de maturation des miARNs correspond au clivage du pri-miR afin de libérer l’épingle à cheveux que constitue le pre-miR. Cette étape nucléaire, est catalysée par un complexe protéique formé par la RNase III Drosha et son cofacteur DGCR8, et leur capacité à reconnaître un pri-miR dépend largement de la structure du précurseur (Kim 2009). L’une des premières études essayant de répondre à la question de savoir quels sont les déterminants structuraux qui permettent à Drosha et DGCR8 de reconnaître un pri-miR, a révélé l’importance du segment terminal ARN simple brin. Zeng et al. ont généré une petite librairie de pri-miRs, variant en taille et en séquence, et ont montré, in vitro, qu’indépendamment de la séquence, l’un des prérequis serait la présence de la région simple brin (Zeng 2005). En éliminant cette région ou en introduisant des mutations lui conférant une structure secondaire, ils ont montré que Drosha était incapable de reconnaître et de cliver le pri-miR. En parallèle, la même équipe avait montré que le clivage par Drosha était également dépendant de la présence d’une boucle terminale relativement grande (≥ 10 nucléotides). Le site de clivage serait alors déterminé principalement par la distance (~2 tours d’hélice, soit environ 22 nucléotides) qui le sépare de la boucle terminale (Zeng 2005). Han et al., sans totalement réfuter l’importance d’une grande boucle terminale, soulignent principalement le rôle de la région simple brin (Han 2006). Ils concluent que, si une grande boucle terminale serait dans une certaine mesure avantageuse, le clivage Drosha se ferait plutôt à une distance d’un tour d’hélice (soit environ 11 nucléotides) depuis la jonction entre l’ARN simple brin et la tige. Les auteurs ont également montré que DGCR8 fonctionnerait comme point d’ancrage moléculaire pour Drosha, étant la seule protéine capable d’interagir directement avec les segments simples brins et dans une certaine mesure avec la boucle terminale (Figure 4) (Han 2006).
La structure minimale d’un pri-miR pouvant être reconnue par le complexe microprocesseur consisterait alors en une tige d’environ 33 pb (3 tours d’hélice), une boucle terminale (de taille relativement variable) et un segment basal ARN simple brin (Kim 2009). Cependant, de nombreuses études ont remarqué que tous les ARNs qui se replient de cette façon ne forment pas nécessairement des précurseurs de miARNs. Récemment, Auyeung et al. ont essayé de comprendre quels autres éléments assurent la spécificité de la reconnaissance du pri-miR par le complexe microprocesseur (Auyeung 2013). Les auteurs montrent, tout d’abord, que la plupart des pri-miRs de Caenorhabditis elegans (qui ressemblent assez aux pri-miRs humains d’un point de vue structural) n’étaient pas pris en charge par la machinerie de biogenèse, et ne donnaient pas de miRs matures une fois transfectés dans les cellules humaines. Ils ont émis alors l’hypothèse qu’un déterminant « séquence » devait s’ajouter au déterminant « structure » et que le déterminant « séquence » serait spécifique aux espèces. Générant de nombreux variants de pri-miRs humains et séquençant ceux qui restent fonctionnels, ils ont identifié trois principaux déterminants « séquence » conservés chez l’homme (Figure 4B) : un motif CNNC de fixation de la protéine SRp20 (trouvé en aval de la tige, dans la région simple brin), un motif UG basal (au niveau de la jonction tige et ARN simple brin), et un motif GUG apical (au niveau de la boucle terminale). La protéine SRp20, qui d’ailleurs est connue pour être impliquée dans la régulation de l’épissage, le transport des ARNm et l’initiation de la traduction, serait dans ce cas capable d’améliorer la reconnaissance et le processing des pri-miRs. Auyeung et al. notent en concluant que même si ces motifs sont très conservés dans les pri-miRs humains, tous ne sont pas présents en même temps dans un pri-miR donné. Le modèle actuel qui se dégage met alors en valeur le fait que la reconnaissance des pri-miRs est un phénomène modulaire où chaque pri-miR dépendrait de certains modules (motifs structuraux ou séquences) à des degrés qui varient entre les pri-miRs (Auyeung 2013).
Transport nucléocytoplasmique des pre-miRs
L’étape, nucléaire, catalysée par Drosha conduit à la production d’un miARN précurseur ou pre-miR qui doit être transporté dans le cytoplasme pour donner un miR mature. Son transport à travers le complexe du pore nucléaire nécessite la présence de l’Exportine-5 (XPO-5), membre d’une famille conservée de transporteurs nucléaires (incluant également les importines) connus sous le nom de karyopherines (Figure 5) (Lund 2004). L’activité des kariopherines est régulée par la petite GTPase Ran (Ras-related nuclear protein). Dans la cellule, Ran existe sous deux formes : une forme liée au GTP (Ran-GTP) dans le noyau, et une forme liée au GDP (Ran-GDP) dans le cytoplasme. Le gradient RanGTP-RanGDP à travers la membrane nucléaire est établi par l’action de deux régulateurs: RanGEF (Ran-GDP-exchange factor) dans le noyau et RanGAP (Ran-GTPase-activating protein) dans le cytoplasme. Dans le noyau, le complexe XPO-5/Ran-GTP lie directement et spécifiquement les pre-miRs produits par Drosha. Après translocation vers le cytoplasme, le GTP est hydrolysé en GDP grâce à l’action de la RanGAP (qui active la fonction GTPase de Ran). XPO-5/Ran-GDP perd son affinité pour le pre-miR qui est alors libéré et pris en charge par Dicer. XPO-5/Ran-GDP transite ensuite vers le noyau à travers le complexe du pore nucléaire, où le GDP est échangé avec du GTP grâce au facteur RanGEF (Kohler 2007; Guttler 2011) (Figure 5C).
XPO-5 reconnait et se lie spécifiquement aux pre-miRs. La structure de l’XPO-5 liant un pre-miR a récemment été résolue. Elle montre que la reconnaissance des pre-miRs se fait de manière séquence-indépendante mais structure-dépendante. En effet, XPO-5 forme une sorte de sandwich en forme de U qui lie environ 16 pb du pre-miR. Les deux nucléotides qui dépassent à l’extrémité 3’ des pre-miRs jouent dans ce contexte un rôle particulièrement important : ils sont spécifiquement reconnus et insérés dans une poche de XPO-5 chargée positivement (3’ recognition tunnel) permettant la distinction entre les pre-miRs et leurs précurseurs (Figure 5B) (Okada 2009; Guttler 2011).
L’étape catalysée par Dicer
La deuxième étape catalytique du processing des miRs se caractérise par la prise en charge du pre-miR par une autre endoribonucléase multi-domaine, la RNase III Dicer. Dicer et son cofacteur TRBP reconnaissent le pre-miR, clivent la boucle terminale et libèrent un duplex miR/miR*. La majorité des études qui se sont consacrées à l’étude structurale de Dicer, l’ont fait sur une forme simple de l’enzyme (en l’occurrence celle du protozoaire Giardia intestinalis, qui fait environ 82 KDa), mais qui n’est pas représentative du Dicer des métazoaires, bien plus large (la forme humaine fait environ 3 fois plus en taille que celle de Giardia, soit 219 KDa) (Lau 2012). La première structure cristalline du Dicer de Giardia a été obtenue en 2006 (Figure 6A). Cette structure suggère que Dicer fonctionnerait comme une sorte de règle moléculaire, reconnaissant l’extrémité libre d’un ARN double brin (par extension, celle du pre-miR), et clivant l’ARN à une distance fixe de cette extrémité. La structure a permis de localiser le domaine PAZ capable de lier l’extrémité libre de l’ARN double brin (et plus particulièrement son extrémité 3’) et le domaine catalytique formé par les sites ribonucléase III (RIIIDa et b). Une surface plane, chargée positivement (platform domain) assure une distance de 65Å (soit 25 pb, taille typique des miARNs de Giardia) entre les domaines PAZ et RNases III (Macrae 2006).
Chez l’homme, la taille et la complexité structurale ont jusqu’à présent empêché l’obtention d’une structure cristalline stable de Dicer, mais quelques études ont réussi à avoir une image peu résolutive du complexe. Il s’agirait d’une molécule en forme de L avec une branche longue (de 150 Å environ) et une branche plus courte (de 100 Å environ) (Figure 6B) (Lau 2009; Wang 2009). Récemment, un travail réalisé par Lau et al. a permis d’avoir une vision relativement complète du complexe Dicer-TRBP et de son mode d’action (Figure 6B et C). Les auteurs ont réussi à modéliser la structure de Dicer à partir d’un certain nombre d’images obtenues par cryo-microscopie électronique. Ils ont montré qu’un réarrangement des différents domaines par rapport à Giardia permettrait d’expliquer pourquoi les microARNs humains sont plus courts. Dans ce modèle, le domaine PAZ serait localisé au niveau apical de l’enzyme. Les domaines hélicases (HEL1, HEL2 et HEL2i), qu’on ne retrouve pas chez Giardia, seraient proches du domaine RNAse et formeraient une structure en forme de pince permettant de bien fixer l’ARN double brin (Figure 6B). Le clivage de l’ARN a lieu une fois que l’ARN ait transité à travers le domaine HEL et que son extrémité soit fixée par le domaine PAZ (Figure 6C) (Lau 2012). De manière intéressante, le domaine hélicase posséderait plusieurs propriétés qui diffèrent en fonction du substrat ARN. Chez la drosophile, Welker et al. et ensuite Cenik et al. ont montré que le domaine hélicase de Dicer-2 serait crucial pour le processing des siARNs par Dicer-2. Ces auteurs ont remarqué que le domaine hélicase permettait à Dicer-2 de générer plusieurs siARNs à partir d’un même long ARN double brin. Le rôle du domaine hélicase serait alors de bien fixer l’ARN double brin et d’assurer la processivité de Dicer-2, grâce à l’hydrolyse de l’ATP et à son activité translocase-like (Figure 6C, étape 3) (Cenik 2011; Welker 2011). Alternativement, Tsutsumi et al. proposent que le domaine hélicase de Dicer-1 (qui chez la drosophile est impliqué dans le processing des pre-miARNs), serait capable de reconnaitre spécifiquement et de fixer la partie simple brin de la boucle des pre-miRs. La distance qui sépare le domaine hélicase du domaine PAZ est alors mesurée, ce qui permettrait à Dicer-1 « d’inspecter rigoureusement » l’authenticité des pre-miRs (Tsutsumi 2011). De manière intéressante, le domaine hélicase de la forme humaine de Dicer ressemble plus à Dicer-1 qu’à Dicer-2. Dans ce contexte, il a été récemment montré que chez l’homme, le domaine hélicase serait également capable de lier la boucle des pre-miRs et d’assurer la spécificité de reconnaissance par Dicer (Ma 2012). Par ailleurs, et de manière totalement inattendue, les mêmes auteurs avaient observé précédemment que, in vitro, le domaine hélicase possède un rôle inhibiteur et que son absence (par mutation ou délétion) accélérait considérablement l’activité enzymatique de Dicer et la rendait catalytiquement plus efficace. L’interaction de la forme sauvage de Dicer avec son partenaire TRBP permettait la levée partielle de l’inhibition (Ma, 2008). Il a donc été proposé que le domaine hélicase permettrait de contrôler l’activité endonucléotidique de Dicer, qui dans un environnement riche en ARNs serait préjudiciable à la cellule. La fixation des partenaires de Dicer et le réarrangement moléculaire qui s’ensuit serait alors capable d’assurer la spécificité de reconnaissance des miARNs par le complexe Dicer (Ma 2012; Nicholson 2012). Finalement, nous citerons une étude réalisée par Park et al. ayant révélé l’existence d’une poche supplémentaire au niveau de Dicer capable de lier le phosphate à l’extrémité 5’ des miARNs. Cette poche se situe à proximité de la poche 3’ du domaine PAZ qui, jusqu’à présent, était connu pour pouvoir fixer préférentiellement l’extrémité 3’ des pre-miRs. Les auteurs montrent en même temps que l’existence de cette poche est cruciale pour la biogenèse des miARNs ; la mesure de la distance entre le domaine PAZ et les sites catalytique se faisant principalement à partir de l’extrémité 5’. Dicer-1 chez la drosophile possède ce motif, mais pas Dicer de Giardia (Park 2011).
Les mécanismes d’action des microARNs
La réaction catalysée par Dicer libère un duplex miR/miR* qui est pris en charge par les protéines Argonautes. Les protéines Argonautes forment avec Dicer le complexe RISC et ne sont capables de fixer qu’un seul brin (le miR ou miARN guide qui va cibler les ARNm), l’autre brin (miR*) étant généralement dégradé. Ce processus est connu sous le nom de RISC loading. Les miRs étant continuellement sous pression sélective pour cibler un set particulier de gènes, un changement du brin chargé dans AGO conduirait à des effets indésirables, voire néfastes pour la cellule (Czech 2011). Deux études parues en 2003 ont montré que le chargement du brin fonctionnel dans le complexe RISC dépendait des propriétés thermodynamiques du duplex miR/miR* et plus particulièrement au niveau de ses extrémités 5’. Le brin qui possède l’extrémité la moins stable est celui qui est préférentiellement incorporé dans le complexe RISC (Khvorova 2003; Schwarz 2003). Caractéristiques des protéines Argonautes. La régulation post-transcriptionnelle se fait à travers les protéines Argonautes, qui sont guidées par les petits ARNs vers les ARNm cibles. La famille des protéines Argonautes est subdivisée en deux sous-catégories : celle des protéines AGO et celles des protéines PIWI (P-element induced wimpy testis). Les protéines AGO, ubiquitaires, se lient aux siARNs et miARNs (dont la taille varie entre 21 et 23 nucléotides), alors que les protéines PIWI se lient aux piARNs (Piwi-interacting RNA, qui sont généralement plus grands et font entre 23 et 30 nucléotides). Brièvement, les piARNs et leurs protéines associées sont principalement exprimées dans les lignées germinales et assurent la stabilité du génome en inhibant l’activité des éléments transposables. Chez l’homme il existe 4 protéines Argonautes (AGO 1-4) alors que la drosophile, par exemple, n’en possède que deux (AGO 1-2) (Cenik 2011; Czech 2011).
Les protéines AGO (et également PIWI) possèdent 3 domaines protéiques conservés (Figure 7A). Le domaine amino-terminal PAZ contient une cavité hydrophobe qui reconnait particulièrement les deux nucléotides dépassant de l’extrémité 3’ du duplex. Ce domaine fixe également l’extrémité 3’ du petit ARN guide. Vient ensuite le domaine MID, qui se lie préférentiellement au phosphate à l’extrémité 5’. Cette liaison, forte, permet de recycler le miR ou le siARN afin qu’il puisse cibler successivement plusieurs ARNm. Finalement, vient le domaine carboxy-terminal PIWI. Ce domaine ressemble structuralement à l’endoribonucléase RNase H (enzyme qui clive l’ARN dans les hétéroduplex ARN/ADN) et se caractérise par la présence de trois résidus négativement chargés et conservés (Aspartate-Aspartate-Glutamate ou motif DDE) assurant l’activité catalytique d’AGO (le site de clivage se situant entre les nucléotides 10 et 11 du brin guide). Chez l’homme, seule AGO2 est capable de cliver les ARNm et est donc nommée « Slicer » (Cenik 2011). L’activité catalytique d’AGO2 permet également de cliver le brin passager du duplex (miR*) et facilite sa dégradation par diverses exonucléases. Cette activité dépend de la complémentarité parfaite ou quasi parfaite entre les deux brins (Matranga 2005; Rand 2005). Pour AGO 1, 3 et 4 la dissociation entre le miR et le miR* est indépendante de toute activité catalytique. Le brin passager est libéré par débobinage ou unwinding, une réaction rendue possible par la présence de un ou plusieurs mésappariements aux extrémités du duplex (Czech 2011). L’interaction entre les protéines AGO et les petits ARNs se fait par le biais de leurs squelette sucre-phosphate, les bases sont donc libres d’interagir avec les ARNm cibles (Ender 2010).
Le tri des microARNs et association aux Argonautes. Chez la drosophile, il a été démontré que généralement les miARNs (produits par Dcr-1) s’associaient avec AGO1 et les siARNs (produits par Dcr-2) s’associaient avec AGO2 (Czech 2011). Ce modèle a cependant été rapidement révoqué et l’image qui se dégage à présent souligne le fait que différents éléments structuraux régissent l’association des petits ARNs avec les protéines AGO. Plus particulièrement, il a été montré que les duplex libérés par Dcr-1 pouvaient s’associer avec AGO1 mais aussi avec AGO2 ; et que si globalement les miARNs s’associaient avec AGO1 et les siARNs avec AGO2, cela ne dépendait pas du fait qu’ils soient produits par Dcr-1 ou Dcr-2 (Forstemann 2007; Tomari 2007). Kawamata et al. ont établi les déterminants structuraux derrière ces associations. Les duplex siARNs, du fait de la parfaite complémentarité entre les deux brins, sont systématiquement dirigés vers AGO2. L’existence d’un mésappariement central dans le duplex miR/miR* dirigerait le duplex vers AGO1, et défavoriserait en même temps la liaison avec AGO2 en bloquant son activité catalytique. Par contre les duplex miR/miR* qui ne possèdent pas le mésappariement central mais des mésappariements aux extrémités sont incorporés dans AGO2. L’existence à la fois du mésappariement central et de un ou plusieurs mésappariements aux extrémités du duplex seraient capables de promouvoir la formation d’un complexe RISC mature et fonctionnel (Kawamata 2009). D’une façon moins importante, le premier nucléotide en position 5’ du miR joue également un rôle dans l’association avec les protéines AGO. Chez la drosophile, AGO1 se lie préférentiellement avec les miRs commençant par un U, alors que AGO2 préfère les miRs commençant par un C (Czech 2009; Ghildiyal 2010; Czech 2011). Chez l’homme, jusqu’à présent, une association préférentielle d’un duplex avec l’une des protéines AGO n’a pas encore été établie (Czech 2011; Dueck 2012). Le couplage moléculaire des complexes RISC et Dicer. En 2005, Gregory et al. ont observé, après immunoprécipitation du complexe RISC chez l’homme, que Dicer et son cofacteur TRBP co-purifiaient avec AGO2 et le duplex miR/miR*. Ce complexe moléculaire a été appelé RISC loading complex (RLC). Les auteurs ont alors proposé un modèle où la production du duplex par Dicer et son chargement dans AGO, même si d’un point de vue temporel ils se faisaient de manière séquentielle, se dérouleraient en réalité au niveau d’un même complexe. Le RLC constituerait alors un état de transition entre le processing des pre-miRs (pre-RISC caractérisé par l’association d’un duplex miR/miR* avec les protéines AGOs) et le complexe RISC mature (seul le brin guide reste associé aux AGOs) et permettrait l’incorporation de duplex juste après sa production par Dicer (Gregory 2005). A l’époque, les bases moléculaires de cette association étaient encore inconnues, et le rôle, voire même l’existence du RLC chez l’homme a été contesté (Yoda 2010).
Une étude structurale réalisée par Wang et al. a montré que d’un point de vue moléculaire ce complexe peut théoriquement exister chez l’homme. Les auteurs ont en effet réussi à modéliser en même temps Dicer et AGO2, et observent que la forme en L de Dicer (en gris sur la figure) serait adaptée pour recevoir AGO2 (en jaune sur la figure) et pour interagir avec elle (Figure 7B) (Wang 2009). Récemment, un travail réalisé par Noland et al. a permis de comprendre – du moins en partie – le rôle et les implications d’une association entre Dicer et les protéines AGO (plus particulièrement AGO2). Le RLC ne constituerait pas un complexe moléculairement figé : son assemblage et son désassemblage constitueraient des étapes clés déterminant le choix du brin guide et la dégradation du brin passager. Les auteurs ont démontré qu’une fois produit, le duplex d’ARN est libéré dans le milieu interstitiel et subissait ensuite un repositionnement au sein de Dicer. Ce repositionnement ne serait pas aléatoire et permettrait d’orienter le duplex en fonction de ses propriétés thermodynamiques. C’est en se basant sur cette orientation que le choix du brin guide va être pris par la protéine AGO. Selon ce modèle, Dicer serait capable lui-même de détecter l’asymétrie thermodynamique du duplex, et possèderait deux sites de liaison à l’ARN : le premier pour le processing des pre-miRs et le deuxième pour la détection de l’asymétrie thermodynamique du duplex (Noland 2011). De manière intéressante, la présentation du duplex à AGO serait facilitée par d’autres protéines connues pour interagir avec le RLC telles que Hsc70 (heat shock cognate 70) et Hsp90 (heat shock protein 90), et nécessiterait l’hydrolyse de l’ATP. Cette hydrolyse induirait des changements structuraux au niveau des protéines AGO et leur permettrait d’accepter plus facilement le duplex (Czech 2011). Même si AGO2 chez la drosophile est structuralement différente de AGO1 et des AGOs 1-4 chez l’homme, Tomari et al., l’avaient associée à ce même mécanisme. Leurs résultats montrent que R2D2, un partenaire de Dcr-2 serait capable de lier l’extrémité la plus stable, et Dcr-2 l’extrémité la moins stable du duplex, les deux constituant des « capteurs » d’asymétrie thermodynamique (Tomari 2004).
La reconnaissance des ARNm cibles
Il est actuellement établi que chez les animaux, la grande majorité des miARNs forment des duplex imparfaits avec les 3’UTRs de leur ARNm cibles (Bartel 2009; Brodersen 2009; Pasquinelli 2012). Cette interaction nécessite cependant la présence d’une complémentarité parfaite sur les nucléotides 2-7 du miR, région connue sous le nom de séquence seed. En accord avec cette affirmation, plusieurs études ont été publiées montrant que la partie 5’ des miARNs serait conservée, et qu’une substitution de nucléotides perturbant l’appariement avec la séquence seed aurait pour conséquence une perte de l’activité régulatrice des miARNs (Lai 2002; Lim 2003; Doench 2004). C’est d’ailleurs en se basant sur cette conservation de la séquence seed et de la partie complémentaire au sein de l’ARNm que plusieurs algorithmes tels que TargetScan (http://www.targetscan.org/) et PicTar (http://pictar.mdc-berlin.de/) réussissent à prédire les cibles d’un miARN donné : si, au niveau de l’ARNm, certains sites sont conservés, il est fort probable qu’ils soient sous pression sélective et qu’ils aient une fonction biologique. Ces algorithmes, combinant données expérimentales, génomiques, voire même parfois thermodynamiques, essayent d’en ressortir des règles qui expliqueraient la reconnaissance miARN-ARNm. Cependant, l’hétérogénéité des cibles et la multitude de facteurs cellulaires (protéiques et structuraux) qui entrent en jeu, limitent considérablement la mise en place de modèles prédictifs fiables. Le critère « conservation de la séquence seed » par exemple, ne détermine pas en soit la reconnaissance des cibles : la cellule n’ayant pas le moyen distinguer entre une séquence conservée et une autre non conservée. Il constitue cependant un outil très utile permettant de sélectionner les candidats les plus probables parmi une liste de cibles pouvant inclure des milliers de gènes dont la plupart constitueraient des faux-positifs (Bartel 2009; Friedman 2009). Le contexte structural et moléculaire du 3’UTR joue également un rôle très important. Le site de reconnaissance doit : (1) se situer au moins à 15 nucléotides du codon stop ; (2) être proche du codon stop ou de la queue polyA, pour les longs 3’UTRs ; (3) se trouver dans une région riche en AU, ou tout autre élément structural facilitant l’accessibilité à l’ARNm ; (4) coexister avec des sites de reconnaissance d’autres miARNs pour une plus grande efficacité de régulation (Grimson 2007; Bartel 2009).
La Figure 8 résume les différents types d’interactions qui peuvent exister entre un miARN et son ARNm cible (Bartel 2009). Les exemples donnés sont ceux qui ressortent, in silico, en utilisant le logiciel TargetScan pour prédire les cibles d’un miARN donné (Friedman 2009). Les cases A à C représentent les modes d’interaction dits canoniques, qui à eux seuls représentent environ 60% du total des ARNm ciblés par un miARN-type (case H). Il s’agit dans le premier cas, d’une complémentarité parfaite sur les 6 nucléotides de la séquence seed et une adénine en position 1 de l’ARNm (7mer-A1 site). Dans le second, la séquence seed s’étend au 8ème nucléotide du miARN (7mer-m8 site), alors que le troisième cas combine les deux premiers c’est-à-dire, une complémentarité parfaite sur les nucléotides 2-8 du miARN et un A en position 1 de l’ARNm (8mer site). Dans ces 3 cas, le nucléotide en position 1 du miARN n’interagit pas avec l’ARNm, et se trouve la plupart du temps face à une adénine. Ce mésappariement a tout d’abord été suggéré par une étude génomique chez les vertébrés, qui montre la surreprésentation des adénosines flanquant les sites conservées complémentaires aux séquences seed (Lewis 2005). Il a été ensuite confirmé par plusieurs études protéomiques montrant qu’un appariement A-U entre le nucléotide en position 1 du miARN et l’ARNm réduisait l’efficacité de la régulation (Nielsen 2007; Baek 2008).
D) et dans le deuxième cas, d’un décalage de la séquence seed (offset 6mer site) qui se retrouve aux positions 3-8 du miARNs (case E). Ces sites de reconnaissance sont globalement peu efficaces et dans beaucoup de cas, leur conservation apparait plus liée au hasard qu’à une pression de sélection (Bartel 2009).
L’importance de la région 3’ du miARN. Plusieurs études réalisées chez la drosophile et les mammifères montrent que, d’un point de vue conservation des séquences, la région 3’ du miARN, très peu conservée, semblerait ne pas jouer un rôle majeur dans la reconnaissance des cibles (Brennecke 2005; Lewis 2005). Cependant, il reste envisageable qu’une complémentarité entre la partie 3’ du miR et l’ARNm puisse complémenter l’appariement avec la séquence seed, renforçant la spécificité et l’efficacité de l’interaction avec la cible (Bartel 2009). Une étude très intéressante réalisée en 2007 par Grimson et al. basée sur une approche à la fois expérimentale et computationnelle, a permis de mettre en évidence certaines caractéristiques permettant d’améliorer l’efficacité de reconnaissance de la cible : il s’agit notamment, et en synergie avec la complémentarité avec la séquence seed, d’une complémentarité parfaite sur les nucléotides 13-16 (et parfois 12-17) du miARN (en orange, case F) (Grimson 2007). Ces sites complémentaires coexistent, d’une façon plus ou moins importante, avec les sites canoniques et marginaux (barres oranges, case H). Ils sont certes très spécifiques, mais sont par contre plus rares (sites atypiques) (Bartel 2009; Friedman 2009). De manière très intéressante, dans certains cas peu nombreux, cette complémentarité permet de compenser des mésappariements survenant au niveau de la séquence seed (case G). Le miR let-7 avec sa cible lin-41 et le miR-196 avec sa cible Hoxb8 font partie de cette catégorie. Dans le cas du miR-196, la complémentarité en 3’ est tellement importante que le duplex miR-196/Hoxb8 est dirigé vers la protéine AGO2 qui catalyse le clivage de l’ARNm (Yekta 2004; Bartel 2009).
Les différents modes d’action des miARNs
Comment un miARN peut-il réguler l’expression de sa cible ? Répondre à cette question nécessite préalablement une compréhension de la structure des ARNs messagers et des différentes protéines avec lesquelles ils interagissent. Un ARNm se caractérise en particulier par sa coiffe (7-methylguanosine en position 5’ terminale) et sa queue Poly(A). Ces deux éléments coopèrent pour promouvoir la traduction de l’ARNm. La coiffe en 5’ est reconnue par le facteur d’initiation de la traduction eIF4F (eukaryotic initiation factor 4F). eIF4F est un complexe protéique formé entre autres, par les facteurs eIF4E (liaison à la coiffe), eIF4G (échafaudage moléculaire permettant de recruter la petite sous-unité 40S du ribosome) et eIF4A (une ARN hélicase). La queue poly(A) est recouverte par une protéine spécifique, la PABP (poly(A) binding protein), qui elle-même interagit avec eIF4G ce qui conduit à une circularisation de l’ARNm (Figure 9, structure centrale). Ceci permet le rapprochement du 5’UTR et du 3’UTR et augmente l’efficacité de la traduction en facilitant le recrutement de plusieurs facteurs protéiques et le turnover des sous-unités ribosomiques. La traduction des ARNm procède selon trois étapes : (1) l’initiation, qui correspond au recrutement des différents facteurs eIF, leur phosphorylation et l’assemblage de la petite sous unité ribosomique ; (2) l’élongation, qui correspond au recrutement des différents facteurs d’élongation (eIF, eukaryotic initiation factor), leur phosphorylation, l’assemblage de la grande sous-unité ribosomique et à la production de la protéine et (3) la terminaison de la traduction quand le ribosome arrive au codon « stop » (Filipowicz 2008; Huntzinger 2011).
De nos jours plusieurs arguments suggèrent différents mécanismes permettant aux miARNs de réguler l’expression de leurs ARNm cibles. Ces mécanismes varient entre déstabilisation de l’ARNm, répression de sa traduction et même parfois activation de la traduction (Figure 9) (Huntzinger 2011; Pasquinelli 2012).
Dégradation de l’ARNm. Comme nous venons de le voir, une complémentarité parfaite entre le miARN et sa cible est responsable du recrutement de la protéine AGO2 et du clivage endonucléotidique de l’ARNm et de sa dégradation (Figure 9a). Ce mécanisme, qu’on retrouve surtout chez les végétaux, reste assez rare chez les animaux (Huntzinger 2011; Pasquinelli 2012). De nombreuses études ont néanmoins montré qu’une régulation par les miARNs se manifestait la plupart du temps par une déstabilisation de la cible et cela indépendamment de la présence d’une complémentarité parfaite (Figure 9b). Une étude très intéressante, combinant des techniques de séquençage profond, de puces d’expressions et de « ribosome profiling », montre qu’à l’échelle du génome une diminution du niveau d’expression des ARNm est responsable à elle seule de plus de 84% de la baisse de l’expression protéique (Guo 2010). D’autres études sont venues corroborer ces résultats, montrant que la déstabilisation des ARNm cibles serait une conséquence générale de la régulation par les miARNs (Huntzinger 2011). Moléculairement, il s’agit d’une interaction entre les protéines Argonautes et les protéines GW182 (Glycine-tryptophan repeats containing proteins) également connues sous le nom de TNRC6A, TNRC6B et TNRC6C chez les vertébrés, qui permet le recrutement du complexe de déadénylation CAF1-CCR4-NOT et l’élimination de la queue poly(A). La perte de la queue poly(A) sensibilise les ARNm : la coiffe est éliminée par le complexe DCP2 et ses partenaires, et les ARNm décoiffés sont finalement dégradés par XRN1, une exonculéase 5’-3’. Ces différents complexes protéiques sont organisés dans le cytoplasme au sein de structures appelées P-bodies, ou GW-bodies d’après les protéines GW182 qui les constituent (Filipowicz 2008; Huntzinger 2011).
Répression de la traduction. Les premières études qui ont été réalisées sur les microARNs et leurs modes d’action ont montré que la régulation de l’expression des protéines par les miARNs se fait avec peu ou pas d’effet sur l’abondance des ARNm (Olsen 1999). Nous savons bien évidemment que ceci est loin d’être généralisable sur tous les miARNs. L’étude réalisée par Olsen et al. a par contre permis de montrer, qu’en absence de dégradation des ARNm, alors que la production de protéines est inhibée, les ARNm de LIN-14 et LIN-28 restent attachés au polysomes, suggérant que la répression a lieu une fois que la traduction a été initiée (Figure 9d) (Olsen 1999). L’inhibition de la production des protéines serait alors due soit à une dégradation du polypeptide durant la traduction, soit à une dissociation prématurée des deux sous-unités ribosomiques (Huntzinger 2011; Pasquinelli 2012). En dépit de ces données, d’autres résultats semblent indiquer que les microARNs sont capables d’inhiber l’étape d’initiation de la traduction (Figure 9c). Dans une étude publiée en 2005, Pillai et al. montrent que les ARNm qui ne dépendent pas de la coiffe pour leur traduction n’étaient pas sujets à la répression par les miARNs, laissant suggérer que le complexe RISC interagirait directement avec la coiffe pour inhiber la traduction. Ils montrent également qu’en présence de miARNs, les ARNm cibles ne co-sédimentent pas avec la fraction contenant les polysomes sur gradient de saccharose mais avec les fractions plus légères appauvries en ribonucléoprotéines (Pillai 2005).
Activation de la traduction. Les microARNs sont également capables de stimuler la traduction de certains gènes, même si cela reste encore assez rare (Figure 9e) (Pasquinelli 2012). Pendant un arrêt du cycle cellulaire, les séquences riches en A-U (ARE, AU-rich elements) de l’ARNm de TNFα sont capables de recruter diverses protéines Argonautes et autres facteurs associés au miARNs. Dans ce contexte, le miR-369-3 serait capable d’activer la traduction de TNFα (Vasudevan 2007). Les auteurs ont également constaté que d’autres miRs tel que let-7, connus pour réprimer la traduction, sont capables d’activer la traduction suite à un arrêt du cycle cellulaire (Vasudevan 2007). Un cas assez intéressant a été décrit par Ørom et al. Il s’agit particulièrement d’une interaction entre le miR-10a et le 5’UTR des ARNm de diverses protéines ribosomiques capables d’activer leur traduction (Orom 2008).
SNP, single-nucleotide polymorphism dans les gènes de microARNs
De manière générale, des variations de séquences dans les gènes de microARNs (que ce soit le miR mature ou ses précurseurs) ont potentiellement pour conséquences un effet sur la biogenèse et/ou la fonction des miRs matures (Ryan 2010; Slaby 2012). Les SNP et leurs conséquences fonctionnelles peuvent être classés en trois catégories : (1) des polymorphismes en cis ou trans du promoteur du gène de miARN, ou du gène dans lequel se trouve le pri-miR pouvant influer sur les niveaux de transcription ; (2) des variations dans la séquence même du pri- ou du pré-miARN (miR-SNP) affectant la biogenèse du miR mature et (3) des variations dans la séquence du miR mature (que ce soit au niveau de la séquence seed ou de la partie 3’ du miR) ayant des conséquence sur sa capacité à réguler une cibler et/ou sa stabilité. Nous pouvons également inclure les polymorphismes qui affectent les 3’UTR des ARNm (miR-TS-SNP, TS pour target site) et qui peuvent moduler, créer ou éliminer des sites de fixation des miARNs, et que nous discuterons très brièvement dans ce chapitre.
Une étude in silico réalisée par Saunders et al., a eu pour but d’évaluer à quelle fréquence les séquences de pre-miR étaient polymorphes et cela par rapport aux régions flanquantes en 5’ et 3’ (environ 100 nucléotides de part et d’autre du pre-miR) (Saunders 2007). Sur les 474 pre-miRs étudiés, environs 90% ne présentaient aucun polymorphisme, et pour ceux qui étaient polymorphes, la région seed n’était pratiquement pas affectée. Ils conclurent alors qu’une forte pression de sélection négative (purifying selection) agissait afin de limiter les conséquences potentiellement délétères que pourrait avoir un changement dans la séquence des miRs matures. Dans une étude plus récente, Quach et al., séquençant 92 régions contenant des microARNs (soit 117 miRs matures) chez 91 individus de différentes populations, ont également montré qu’une pression sélective, particulièrement au niveau du miR mature, limitait considérablement le polymorphisme de ces gènes (Quach 2009).
Malgré ces données, plusieurs exemples dans la littérature montrent qu’il existe bel et bien un polymorphisme (quoique relativement limité) au niveau des gènes de microARNs (Ryan 2010; Slaby 2012). Les premières études fonctionnelles qui ont été réalisées dans ce domaine semblent indiquer que le polymorphisme n’a aucun effet sur la biogenèse des miRs. Particulièrement, une étude réalisée par Diederichs et al., qui montre que des SNP au niveau des gènes de microARNs (la majorité étant au niveau du pri-miR), même s’ils entrainent la plupart du temps des changements structuraux assez visibles, n’auraient aucun effet sur l’expression des miRs matures (Diederichs 2006). Par opposition, Duan et al. ont identifié un SNP localisé en position 8 du miR-125a mature et qui, de manière inattendue, bloquait la biogenèse du miR et plus particulièrement, le passage pri-miR vers pre-miR (Duan 2007). Nous citerons également une étude réalisée par Sun et al., où les auteurs montrent qu’en plus d’un effet négatif sur la biogenèse et l’expression des miRs matures, les SNP peuvent, dans certains cas, améliorer l’efficacité du processing (cas de la transition G → A au sein du pri-miR-510) (Sun 2009). De manière très intéressante, les auteurs montrent également que les SNP peuvent parfois altérer les sites de coupures de Drosha ou Dicer. Une conversion T → G au niveau du premier nucléotide du miR-934-5p conduit d’une part à l’apparition d’une espèce 5p plus grande et en moindre quantité, et d’autre part à la production en grande quantité de miR-934-3p. Il s’agit en effet d’une inversion, suite au polymorphisme, entre le brin guide (5p) et le brin passager (3p) (Sun 2009).
De manière assez remarquable, plusieurs SNP touchant les gènes de microARNs ont été associés à diverses pathologies humaines, y compris les cancers (Ryan 2010; Slaby 2012). En 2008, Jazdzewski et al. ont identifié un polymorphisme au niveau du pre-miR-146a qui conduisait à une diminution de l’expression du miR mature et prédisposait au carcinome papillaire de la thyroïde (Jazdzewski 2008). Le miR-146a ciblait, entre autres, des gènes appartenant aux voies de signalisations des cytokines et des récepteurs de type Toll, fréquemment surexprimés dans ce type de cancers. Quelques mois plus tard, Hu et al. étudiant un polymorphisme au niveau du miR-196a2 ont observé qu’il était associé à un mauvais pronostic chez les patients homozygotes possédant ce SNP et atteints de cancer bronchique non à petites cellules (non-small cell lung carcinoma) (Hu 2008). De façon plus générale, une étude récente de 149 SNP chez 6 espèces animales a permis de localiser ces polymorphismes au niveau de divers Locus de caractères quantitatifs (QTL, quantitative trait loci), de sites fragiles de chromosomes et de sites de susceptibilité au cancer, et leur a attribué un rôle potentiel dans le contrôle génétique de différents caractères complexes (Zorc 2012). En ce qui concerne les cancers colorectaux, une étude réalisée par Lee et al. sur 436 patients, a permis d’identifier un polymorphisme au niveau du pre-miR-492. Ce SNP serait alors associé à une mauvaise survie sans progression (PFS, progression free survival) chez les patients hétérozygotes et homozygotes possédant ce SNP, mais n’aurait aucun effet sur la survie globale des patients (Lee 2010). Toujours dans les cancers colorectaux, nous citerons un polymorphisme qui se trouve dans un site complémentaire au miR let-7 (lcs6, let- 7 complementary site) au niveau du 3’UTR du gène KRAS. Il est en fait connu que des mutations du proto-oncogène KRAS sont associées à une résistance aux thérapies basées sur des anticorps monoclonaux ciblant le récepteur EGF. Zhang et al. ont donc montré que pour 130 patients atteints de cancer colorectal métastatique et qui sont sauvages pour KRAS, la présence du SNP au niveau de lcs6, qui conduit à une forte expression de KRAS, serait associée à une meilleure réponse au traitement monoclonal (cetuximab) (Zhang 2011). Ce même polymorphisme a d’ailleurs été également associé à un plus grand risque de développement de cancer bronchique non à petites cellules, et à un mauvais pronostic (survie globale réduite) chez les patients atteints de HNSCC (head and neck squamous cell carcinoma) (Chin 2008; Christensen 2009).
Des mutations germinales et somatiques dans les gènes de microARNs
Peu de mutations germinales ou somatiques ont été identifiées dans les gènes de microARNs. L’exemple le plus connu et le plus important reste une mutation germinale des miR-16-1–miR-15a (Calin 2005). Dans les leucémies lymphoïdes chroniques (LLC), une délétion fréquente affecte le chromosome 13q13.4 dans lequel se trouvent ces deux microARNs suppresseurs de tumeurs (ils agissent sur BCL2 et répriment son activité anti-apoptotique). Calin et al. ont montré que la perte de l’expression des miR-16-1 et miR-15a serait également due à une mutation constitutionnelle C→T au niveau de leur précurseur (pri-miR) et que l’on retrouve uniquement chez les patients atteint de LLC. Cette mutation serait associée, la plupart du temps, à une délétion du second allèle normal, rappelant le modèle de Knudson d’inactivation des gènes suppresseurs de tumeurs (Calin 2005).
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Table des matières
PARTIE I – LES MICROARNS
1. INTRODUCTION – LA DECOUVERTE DES MICROARNS
2. LA BIOGENESE DES MICROARNS
2.1 ORGANISATION GENOMIQUE DES GENES DE MICROARNS
2.2 BIOGENESE DES MIARNS : APERÇU GENERAL
2.2.1 Le Modèle canonique
2.2.2 Les modèles non canoniques de biogenèse des miRs
2.3 LES BASES MOLECULAIRES DE LA BIOGENESE DES MIARNS
2.3.1 Les RNases III, Drosha et Dicer
2.3.2 L’étape catalysée par Drosha
2.3.3 Transport nucléocytoplasmique des pre-miRs
2.3.4 L’étape catalysée par Dicer
3. LES MECANISMES D’ACTION DES MICROARNS
3.1 LE COMPLEXE RISC
3.2 LA RECONNAISSANCE DES ARNM CIBLES
3.3 LES DIFFERENTS MODES D’ACTION DES MIARNS
4. VARIATIONS GENETIQUES : SNP ET MUTATIONS SOMATIQUES
4.1 SNP, SINGLE-NUCLEOTIDE POLYMORPHISM DANS LES GENES DE MICROARNS
4.2 DES MUTATIONS GERMINALES ET SOMATIQUES DANS LES GENES DE MICROARNS
5. MODIFICATIONS POST-TRANSCRIPTIONNELLES DES MIARNS
5.1 MISE EN EVIDENCE
5.2 FREQUENCE
5.3 BASES MOLECULAIRES
5.3.1 Le rôle de Drosha et DICER1
5.3.2 Le rôle des exoribonucléases et des nucléotidyltransférases
5.3.3 ADAR et editing des microARNs
5.4 CONSEQUENCES FONCTIONNELLES
5.4.1 Variabilité à l’extrémité 5’ : liaison aux Argonautes et changement de cibles
5.4.2 Editing : conséquences physiologiques et physiopathologiques
5.4.3 Conséquences de l’uridylation et de l’adénylation
PARTIE II – MICROARNS ET CANCERS COLORECTAUX MSI
6. CANCERS COLORECTAUX INSTABLES SUR LES MICROSATELLITES
6.1 GENERALITES SUR LES CANCERS COLORECTAUX
6.2 LE SYSTEME MMR ET SA PERTE DANS LES CANCERS COLORECTAUX
6.3 GENES CIBLES DE L’INSTABILITE MICROSATELLITAIRE
6.4 CARACTERISTIQUES CLINICO-PATHOLOGIQUES DES CANCERS COLORECTAUX DE TYPE MSI
6.4.1 Cancers MSI sporadiques et héréditaires
6.4.2 Pronostic tumoral et réponse aux traitements de chimiothérapie
7. MICROARNS ET DEREGULATION DE LEUR EXPRESSION DANS LES CCRS
7.1 INTRODUCTION : MICROARNS ET CANCERS
7.2 GENERALITES SUR LES MICROARNS DANS LES CANCERS COLORECTAUX
8. MICROARNS ET CANCERS COLORECTAUX MSI
8.1 DEREGULATION DES MICROARNS DANS LES CANCERS COLORECTAUX MSI
8.2 VARIATIONS GENETIQUES ET MSI DANS LES GENES DE BIOGENESE DES MICROARNS
8.3 LES PROTEINES MMR SONT LA CIBLE DE CERTAINS MICROARNS
9. CANCER, INFLAMMATION ET MICROARNS
9.1 LA NOTION DE DEFAUT DE CHAMP
9.2 CANCERS COMPLIQUANT LES MALADIES INFLAMMATOIRES CHRONIQUES INTESTINALES
9.2.1 Qu’est-ce que les MICI ?
9.2.2 Les MICI peuvent se compliquer par des cancers colorectaux
9.2.3 Développement et progression de cancers colorectaux compliquant les MICI
9.2.4 Comment l’inflammation peut-elle favoriser l’apparition des CCR MSI ?
9.3 INFLAMMATION ET CANCER : LE ROLE DES MICROARNS
9.3.1 Inflammation et expression des miARNs
9.3.2 Plusieurs microARNs se trouvent dérégulés dans les MICI
9.3.3 Rôles multiples des miRs 155 et 21
VUE SYNOPTIQUE DES TRAVAUX DE RECHERCHE
DISCUSSION
PERSPECTIVES
CONCLUSION
ANNEXE
BIBLIOGRAPHIE
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