Soutenance mémoire
Présentation du virus West Nile
Découverte du virus West Nile
Le virus WN (ou virus du Nil occidental) a été isolé et identifié pour la première fois en Ouganda en 1937 (Smithburn et al., 1940) dans le district de WN, d’où son nom. En effet, ce premier isolement a été fait chez une femme adulte présentant une maladie fébrile.
Structure du virus West Nile
Le virus WN est un virus enveloppé à ARN simple brin, de polarité positive, d’environ 11 kilobases. Le génome viral code pour un seul cadre de lecture qui est flanqué par des régions 5’ et 3’ non traduites (UTR: Untranslated Region) (figure 1a). Le virion, ayant un diamètre d’environ 50 nanomètres, est constitué d’une enveloppe entourant une capside. Le génome viral, code pour une polyprotéine de prés de 3000 acides aminés, qui va être clivée en 10 protéines par les protéases cellulaires et virales (van Marle et al., 2007). En effet, ce clivage commence par les protéases cellulaires qui libèrent la protéase virale NS3. Ensuite, celle-ci ayant une activité d’hélicase et d’ATPase, continue le clivage. Trois de ces protéines virales sont des composantes structurales requises pour l’encapsidation de l’ARN viral (par la protéine de capside C) et pour l’interaction et la fusion avec la cellule cible (par les protéines de pré membrane prM/M et d’enveloppe E) (figure 1b). La protéine d’enveloppe virale E et la protéine de membrane M sont insérées dans la bicouche lipidique de l’enveloppe. De nombreuses propriétés biologiques des flavivirus, telles que le tropisme, l’attachement, la fusion cellulaire et la virulence, sont associées à la protéine d’enveloppe E. Les sept autres protéines virales non-structurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, et NS5) (figure 1a) jouent un rôle dans la réplication virale, l’assemblage des virions et l’évasion à la réponse antivirale de l’hôte (Kummerer et Rice, 2002). La NS5 est une méthyltransférase et une ARN polymérase ARN-dépendante, responsable de la réplication du génome viral. La NS5 coopère avec la NS3 pour la réplication de l’ARN viral. Les autres protéines non structurales sont courtes, et sont généralement des protéines hydrophobes de fonctions diverses. Elles sont reconnues comme étant impliquées dans la réplication de l’ARN viral (NS1, NS2B, NS4A et NS4B) et dans l’assemblage (NS2A).
Taxonomie
Le WN est un arbovirus neurotrope appartenant au Complexe des Encéphalites Japonaises (JEV), à la famille des Flaviviridae et au genre flavivirus. Cette famille comprend d’autres agents pathogènes humains comme ceux de la Dengue et de la Fièvre jaune. Le sérocomplexe de l’encéphalite japonaise regroupe également d’autres virus comme ceux de l’Encéphalite Japonaise (JE), de l’Encéphalite de la Murray Valley (MVE), de l’Encéphalite de Saint Louis (SLE), Usutu (USU), du Cacipacore (CPC) et du Yaounde (YAO) (Source: ICTV International Committee on taxonomy of Viruses).
Cycle de réplication du virus West Nile
Comme tous les flavivirus, le virus WN présente un cycle de vie d’environ 24 heures, constitué de 4 principales étapes; à savoir l’attachement/entrée, la traduction, la réplication du génome et l’assemblage/libération. Le virus WN pénètre dans la cellule hôte par un récepteur médiateur d’endocytose non encore défini et passe dans un endosome. Une fois à l’intérieur de la cellule, l’acidification du compartiment de l’endosome (baisse du pH) entraine un changement de conformation de la protéine E du virus. Il s’en suit une fusion entre les membranes du virus et de l’endosome et enfin le génome viral est libéré dans le cytoplasme de la cellule hôte (Mukhopadhyay et al., 2005). L’ARN génomique viral de polarité positive, étant considéré comme un ARNm (ARN messager), est pris en charge directement par les ribosomes de la cellule hôte pour la traduction en une polyprotéine qui va être clivée. La polymérase virale NS5 permet la réplication du génome viral dans le Réticulum Endoplasmique; ce qui produit plusieurs nouvelles copies du génome. Ensuite, le génome est encapsidé dans les virions qui font leur maturation par le biais des voies de sécrétions du Réticulum Endoplasmique rugueux et du Golgi (Mackenzie et al., 2001). Ces virions s’entourent de la protéine d’enveloppe E, des lipides dérivés de la cellule hôte, et de la protéine de pré-membrane prM qui va être clivée par la suite: c’est l’assemblage. Enfin, les nouveaux virions sortent de la cellule hôte par un phénomène d’exocytose .
Diversité génétique du virus West Nile
Le virus WN présente une grande diversité génotypique exprimée en 8 lignées différentes circulant dans le monde (figure 3). Les analyses phylogénétiques montrent deux lignées majeures: les lignées 1 et 2 qui sont les seules encore isolées d’humains. La lignée 1 est cosmopolite et responsable de toutes les grandes épidémies humaines de WN, y compris celle de 1999 aux Etats-Unis. La lignée 1 est repartie en 3 clades; les souches circulant en Amérique du Nord, en Europe, au Moyen-Orient, et en Afrique (clade Ia), les souches du virus australien Kunjin (clade Ib) qui a été montré comme étant un sous-type du virus WN (Hall, et al., 2001) et les souches isolées en Inde (clade Ic). La lignée 2 était exclusivement présente en Afrique et à Madagascar jusqu’en 2004 lorsqu’elle a été signalée pour la première fois chez des hommes et des populations d’oiseaux en Europe, particulièrement en Russie en 2004 (Platonov et al., 2011), en Romanie, en Hongrie (Sirbu, et al., 2011), en Grèce en 2010 (Papa, et al., 2011) et en Italie en 2011 (Bagnarelli, et al., 2011). Les souches de lignée 1 étaient plus associées aux formes neurologiques sévères mais des études réalisées par Beasley, et al., en 2002 montrent que des souches avec un phénotype neuro-invasif élevé ou bas existent dans chacune de ces deux lignées. Ainsi, la lignée 2 a été associée à plusieurs dizaines de cas d’infections neuro-invasives chez le cheval ou l’Homme en Afrique du Sud en 2007-2008 (Venter et Swanepoel, 2010) et en Hongrie en 2008 (Kutasi et al. 2011).
La lignée 3 est représentée par des isolats du virus Rabensburg qui ont été obtenus à partir de moustiques Culex pipiens en République Tchèque en 1997 (Bakonyi, et al., 2005). Des isolats décrits en 1998 au sud de la Russie (virus LEIV-Krnd88-190) constituent la lignée 4 du virus WN (Lvov DK, et al., 2004). Les souches indiennes, anciennement incluses dans le clade 1c, ont été proposées, par la suite, comme appartenant à la lignée 5 du virus WN. La souche du virus Kunjin Sarawak, isolée en Malaisie, est significativement différente des autres virus Kunjin, et donc a été classifiée comme la lignée 6 du virus WN. Le virus africain Koutango, qui a été initialement classé dans une espèce virale, a été par la suite considéré comme un variant du virus WN suite à des études phylogénétiques et représente la lignée 7 du virus WN (Charrel, et al., 2003). Il est intéressant de noter que le virus Koutango a été souvent isolé à partir de tiques et de rongeurs, ce qui est une caractéristique unique parmi les lignées du virus WN connues à ce jour. La lignée 8 correspond à une nouvelle lignée isolée à Kédougou, au Sud-Est du Sénégal en 1992 (Dupressoir et al, manuscrit en préparation). En Afrique, particulièrement au Sénégal, seules les lignées 1, 2, 8, et Koutango ont été signalées (Source: Base CRORA). En outre, la diversité du virus WN a été également décrite sur le site N-glycosylation de la protéine d’enveloppe. En effet, la protéine pré-membrane (prM) contient un site de glycosylation hautement conservé (Berthet, et al., 1997), tandis que celui de la protéine E à la position 154 (protéine de l’enveloppe) est perdu chez certaines souches du virus WN (Shirato et al., 2004). Il a été montré que ce site joue un rôle important dans la réplication virale in vitro (Hanna et al., 2005 ; Murata et al., 2010).
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Table des matières
INTRODUCTION
CHAPITRE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Présentation du virus West Nile
1.1. Découverte du virus West Nile
1.2. Structure du virus West Nile
1.3. Taxonomie
1.4. Cycle de réplication du virus West Nile
1.5. Diversité génétique du virus West Nile
2. Présentation clinique
2.1. Les Hôtes
2.2. Symptômes
3. Epidémiologie du virus West Nile
3.1. Distribution géographique et épidémies
3.2. Cycle de Transmission naturel du virus West Nile
4. Méthodes de diagnostic et de prévention
4.1. Méthodes de diagnostic
4.2. Méthodes de prévention
5. Traitements
CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES
1. Matériel biologique
1.1. Souches virales utilisées
1.2. Cellules et milieux de culture
2. Démarche Expérimentale
3. Techniques utilisées
3. 1. Préparation de stocks viraux
3. 2. Extraction d’ARN
3. 3. RT-PCR temps réel
3. 4. Immunofluorescence Indirecte (IFI)
3.5. Titrage
3. 6. Analyses statistiques
CHAPITRE III : RESULTATS ET DISCUSSION
1. Résultats
1.1. Stocks de départ
1.2. Surnageant après 4h d’incubation
1.3. Evolution à partir de T0
1.3.1. Cellules de moustiques
1.3.2. Cellules de mammifères
1.3.3. Comparaison AP61 versus Vero
2. Discussion
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
WEBOGRAPHIE
ANNEXES
