De l’ARN pré-messager à l’ARNm

La surveillance des ARNm 

Les ARN messagers (ARNm) sont souvent considérés comme des molécules intermédiaires entre l’ADN, support de l’information génétique contenue dans le noyau, et les protéines, support de la fonction du gène. Il n’empêche que les ARNm ont le devoir de transférer l’information génétique de la manière la plus fidèle qu’il soit. Pour cela, les cellules ont développé divers mécanismes de surveillance ou contrôle de qualité des ARNm. Ainsi, tout au long des processus de synthèse, maturation, export et traduction, les ARNm sont vérifiés afin d’assurer que seuls les ARNm correctement maturés sont traduits et ainsi éviter la production de protéines aberrantes qui pourraient avoir des effets délétères pour la cellule voire pour l’organisme.

De l’ARN pré-messager à l’ARNm

Chez les eucaryotes, l’ADN est transcrit en ARN pré-messager dans le noyau par l’ARN polymérase II. Pendant et après la transcription, l’ARN pré-messager subit plusieurs étapes de maturation afin de donner lieu à l’ARNm mature (Figure 1). Au cours de ces étapes, différentes protéines interagissent avec l’ARNm pour former des particules ribonucléoprotéiques (mRNP) qui évoluent au cours du temps. Ces mRNP sont exportées vers le cytoplasme afin de permettre la traduction de l’ARNm en un polypeptide.

La coiffe et la polyadénylation
Immédiatement après le début de la transcription, lorsque le transcrit compte environ 30 nucléotides (nt), l’extrémité 5’ de l’ARNm est protégée de l’action d’exoribonucléases 5’ (les enzymes qui dégradent les ARN par l’extrémité 5’) par l’ajout d’une coiffe N7- méthylguanosine (m7GpppN) (Hocine et al. 2010). Cette coiffe va être reconnue dans le noyau par le cap binding complex (CBC), un hétérodimère composé de deux protéines de 80 et 20 kDa (CBP80 et CBP20). Le CBC est reconnu par le complexe du pore nucléaire et permet l’export de l’ARNm vers le cytoplasme. Une fois dans le cytoplasme et après un premier tour de traduction , le CBC est remplacé par le facteur d’initiation de la traduction eIF4E. Ce dernier recrute d’autres facteurs d’initiation nécessaires pour supporter la traduction intensive en protéine (Hocine et al. 2010).

La polyadénylation a lieu après la fin de la transcription, lorsque le signal de polyadénylation (défini par la séquence AAUAAA) est reconnu par un complexe protéique qui va cliver l’ARN pré-messager nouvellement synthétisé et ajouter une queue de polyadénosine d’environ 250 nt dans son extrémité 3′. La queue poly(A) permet le recrutement de protéines spécifiques appelées PABP (poly(A) binding proteins) qui protègent l’ARNm de l’attaque d’exoribonucléases 3’ et participent aux processus d’export, traduction et dégradation (Shatkin and Manley 2000).

L’épissage
Pour la plupart des ARNm eucaryotes, un processus de maturation très important a lieu : l’épissage. Ce processus permet l’élimination de certaines régions non codantes, les introns, et la jonction des régions qui seront conservées dans l’ARNm, les exons, afin d’établir le cadre de lecture dans l’ARNm mature qui permettra la synthèse d’une protéine. Les réactions d’épissage sont catalysées par cinq complexes ribonucléoprotéiques appelés snRNP (small nuclear ribonucleoproteins) et plus de cent cinquante protéines associées qui constituent collectivement le splicéosome (Black 2003; Valadkhan and Jaladat 2010). L’épissage implique un remodelage important de la mRNP. En effet, une conséquence de l’épissage chez les organismes multicellulaires est le dépôt d’un complexe protéique en amont de chaque jonction exon-exon appelé exon junction complex (EJC) (Le Hir et al. 2000a; Le Hir et al. 2000b). Ce complexe a plusieurs fonctions : il favorise l’export des mRNP vers le cytoplasme (Zhou et al. 2000), il participe à la localisation des ARNm chez la drosophile (Mohr et al. 2001) et, comme nous le verrons dans le chapitre 2, il a un rôle important dans la dégradation des ARNm chez les mammifères par le mécanisme de nonsense–mediated mRNA decay (Le Hir et al. 2001b; Gehring et al. 2005). Ces quelques exemples illustrent à quel point les événements précoces lors de la biogenèse des ARNm peuvent avoir un impact sur leur devenir.

L’épissage alternatif
L’épissage alternatif est le processus par lequel de multiples ARNm peuvent être générés à partir d’un même ARN pré-messager. Ce processus est considéré comme la source principale de la diversification du protéome (Soller 2006) : un seul gène peut coder pour de multiples isoformes de protéines qui peuvent être différentes du point de vue de leur activité enzymatique, repliement, localisation subcellulaire, modifications post-traductionnelles, affinité pour un ligand, etc. Un exemple extrême d’épissage alternatif est le gène Dscam chez Drosophila melanogaster, qui peut en théorie produire par épissage alternatif 38.000 ARNm différents (Schmucker et al. 2000).

Plusieurs types d’épissage alternatif ont été décrits (Figure 2) : les exons peuvent être exclus ou inclus, ils peuvent être mutuellement exclusifs, allongés ou raccourcis, et les introns peuvent être retenus partiellement ou totalement dans l’ARNm. Enfin, des exons en 5’ et 3’ peuvent être inclus ou exclus par l’utilisation de promoteurs ou de sites de polyadénylation alternatifs. La diversité apportée par ce mécanisme pourrait expliquer la complexité de certains organismes comme l’homme qui a relativement peu de gènes (20.000-25.000) en comparaison avec un organisme comme le nématode Caenorhabditis elegans (qui en possède environ 19.000) (Kim et al. 2007a). En effet, on estime qu’environ 95% des gènes multiexoniques chez l’homme subissent au moins un épissage alternatif (Pan et al. 2008) contre environ 25% chez C. elegans (Ramani et al. 2011).

La dégradation des ARNm 

Il a été proposé que lorsqu’ils sont activement traduits, les ARNm présentent une configuration circulaire grâce au facteur eIF4G qui établit des interactions avec l’extrémité 5’ de l’ARNm via le facteur eIF4E, et l’extrémité 3’ de l’ARNm via la protéine PABP (Gallie 1998). Cette disposition augmenterait l’efficacité de la traduction et empêcherait l’accès des facteurs de dégradation à l’ARNm. Lorsque les ARNm doivent être dégradés, cette configuration est déstabilisée et la queue poly(A) est éliminée par le processus de déadénylation. Après cette première étape de déadénylation, deux voies de dégradation sont possibles. Dans la première, qui est la voie majoritaire chez la levure, un complexe de decapping élimine la coiffe 5’ et expose le transcrit à la dégradation par les exoribonucléases 5’→3’ (Mitchell and Tollervey 2000). Dans la deuxième, qui est la voie majoritaire chez les mammifères, le transcrit déadénylé est dégradé par l’extrémité 3’ par les exoribonucléases 3’→5’ de l’exosome (Parker and Song 2004). Alternativement, la dégradation peut être aussi initiée par un clivage endonucléolytique qui coupe l’ARNm en deux fragments, en générant des extrémités non protégées et accessibles aux exoribonucléases (Figure 3) (Parker and Song 2004).

La déadénylation et le decapping

Chez les eucaryotes, il existe deux complexes protéiques très conservés qui possèdent une activité de déadénylation : le complexe PAN2-PAN3 et le complexe CCR4-CAF1 (Goldstrohm and Wickens 2008). Le decapping ou clivage de la coiffe en 5’ est catalysé par le complexe DCP1-DCP2 (decapping protein). De façon intéressante, PABP module l’activité des sous-unités catalytiques des complexes de déadénylation et de decapping. En effet, PABP stimule l’activité déadénylase de PAN2 (Uchida et al. 2004) mais inhibe celle de CCR4 (Tucker et al. 2002). Par ailleurs, il semblerait aussi que PABP inhibe l’activité de decapping de DCP2 (Khanna and Kiledjian 2004).

Yamashita et collaborateurs ont proposé un modèle qui suggère un lien fonctionnel entre la déadénylation et le decapping (Yamashita et al. 2005a). Selon ce modèle, la déadénylation se fait en deux phases. D’abord dans un ARNm avec une queue poly(A) longue (>200 nt), les multiples PABP qui y sont associées stimulent la déadénylation par PAN2- PAN3. Comme conséquence du raccourcissement (<110 nt), il y aura moins de PABP sur la queue poly(A), l’activité de PAN2-PAN3 diminue alors que celle de CCR4-CAF1 et de DCP1- DCP2 est stimulée. L’ARNm subit alors une deuxième phase de déadénylation et le decapping peut avoir lieu (Yamashita et al. 2005a). Selon ce modèle, il y aurait un rôle successif des deux complexes de déadénylation qui commencerait par PAN2-PAN3 puis le relais serait pris par le complexe CCR4-CAF1. Par ailleurs, chez plusieurs organismes multicellulaires, on trouve une autre déadénylase, la poly(A) ribonucléase (PARN) qui a la particularité d’être inhibée par PABP mais d’être stimulée par la coiffe 5’, ce qui suggère que le substrat préférentiel de PARN serait un ARNm qui n’a pas encore perdu la coiffe mais dont la queue poly(A) n’a plus ou peu de PABP (Goldstrohm and Wickens 2008).

Le complexe DCP1-DCP2 est conservé chez tous les eucaryotes (Coller and Parker 2004). DCP2 porte l’activité catalytique et clive la liaison pyrophosphate entre le premier nucléotide de l’ARNm et la coiffe (Lykke-Andersen 2002; van Dijk et al. 2002; Wang et al. 2002c). DCP1, qui chez les mammifères, présente deux isoformes DCP1a et DCP1b, stimule l’activité catalytique de DCP2 (Lykke-Andersen 2002). Suite au clivage, l’ARNm avec un phosphate libre en 5’ est reconnu comme un substrat par les exoribonucléases 5’→3’,  principalement XRN1 dans le cytoplasme et XRN2 (Rat1 chez la levure) dans le noyau (Coller and Parker 2004). La coiffe m7GDP est hydrolysée en m7GMP et phosphate par l’enzyme DCPS (decapping scavenger) (Wang and Kiledjian 2001).

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Table des matières

INTRODUCTION
1. La surveillance des ARNm
1.1. De l’ARN pré-messager à l’ARNm
1.1.1. La coiffe et la polyadénylation
1.1.2. L’épissage
1.1.2.1. L’épissage alternatif
1.2. La dégradation des ARNm
1.2.1. La déadénylation et le decapping
1.2.2. L’exosome
1.2.3. Les P-bodies
1.3. Les mécanismes de surveillance des ARNm
1.3.1. Surveillance co-transcriptionnelle et lors de l’export
1.3.2. Surveillance co-traductionnelle
1.3.2.1. Le No-go decay (NGD)
1.3.2.2. Le Non-stop decay (NSD)
1.3.2.3. Le Nonsense-mediated mRNA decay (NMD)
2. Le mécanisme du NMD
2.1. Les facteurs du NMD
2.1.1. Les protéines hUPF
2.1.1.1. hUPF1
2.1.1.2. hUPF2
2.1.1.3. hUPF3 et hUPF3X
2.1.2. Les protéines SMG
2.1.2.1. hSMG1, hSMG8 et hSMG9
2.1.2.2. hSMG5, hSMG6 et hSMG7
2.1.3. Les protéines hNAG et hDHX34
2.2. Mécanisme de reconnaissance d’un PTC chez les mammifères
2.2.1. La règle des 50-55 nucléotides
2.2.2. L’Exon Junction Complex (EJC)
2.2.3. L’EJC et le NMD
2.3. L’assemblage du complexe de surveillance
2.3.1. La reconnaissance d’un PTC nécessite de la traduction
2.3.2. Reconnaissance des PTC pendant le premier tour de traduction
2.3.3. La phosphorylation de hUPF1 se fait dans le complexe DECID
2.3.4. Le rôle de PABPC
2.3.5. Le rôle de CBP80
2.3.6. Conséquences de la phosphorylation d’UPF1
2.3.7. La déphosphorylation de hUPF1 et la dégradation de l’ARNm
2.3.8. Les P-bodies et la dégradation des ARNm soumis au NMD
2.4. Localisation subcellulaire du NMD
2.5. Les PTC qui ne suivent pas la règle
2.6. La reconnaissance des PTC chez les autres eucaryotes
2.6.1. Le modèle DSE
2.6.2. Le modèle du faux 3’UTR
3. Importance physiologique du NMD
3.1. Origine des codons stop prématurés
3.2. Les substrats physiologiques du NMD
3.3. Régulation par épissage alternatif couplé au NMD
3.4. Le NMD dans la réponse au stress par privation nutritionnelle et au stress oxydatif
3.5. Le NMD dans le développement lymphocytaire
3.6. Le NMD dans le développement embryonnaire
4. Les facteurs du NMD dans d’autres processus cellulaires
4.1. Le maintien des télomères
4.2. La stabilité du génome et la progression du cycle cellulaire
4.3. Le NAS et le SOS
4.4. Le Staufen-mediated decay
4.5. Le métabolisme du virus de l’immunodéficience humaine HIV-1
5. Les maladies associées aux PTC et approches thérapeutiques
5.1. Maladies provoquées par des PTC qui échappent au NMD
5.2. Maladies provoquées par des PTC qui déclenchent le NMD
5.2.1. La mucoviscidose
5.2.2. Les dystrophinopathies
5.2.3. Perte de l’expression de protéines suppresseurs de tumeurs
5.3. Approches pour la correction des PTC
5.3.1. Utilisation d’oligoribonucléotides anti-sens
5.3.1.1. Correction d’épissages aberrants
5.3.1.2. Exon skipping
5.3.2. La translecture ou suppression de la terminaison de la traduction
5.3.2.1. Les ARNt suppresseurs
5.3.2.2. Les aminoglycosides
5.3.2.3. Autres composés non-aminoglycosides
5.3.3. Inhibition du NMD
CONCLUSION

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