Soutenance mémoire
CULTURE CELLULAIRE
MATERIEL ET METHODES
Animaux
Seize agneaux mâles Ile de France ont été inclus dans le protocole de préparation ventriculaire. Ces agneaux ont été achetés chez un fournisseur agrémenté pour l’expérimentation animale (Lycée Agricole Crézancy, Crézancy, France). Cet élevage est garanti indemne de toute maladie légalement réputée contagieuse (MLRC). Les animaux ont été considérés comme sains à leur entrée en protocole après une inspection vétérinaire. Les animaux ont été par la suite hébergés dans la ferme de Bligny de la Fondation de l’Avenir (Fontenay les Briis), en bergerie paillée et en pâture restrictive. Elles ont été nourries avec foin et granulés et abreuvées ad libitum avec de l’eau propre à la consommation humaine. Les interventions (biopsie, culture, greffe et prélèvement final) ont eu lieu au Centre d’expérimentation et de recherche appliquée (CERA-IMM Recherche, Paris). Le projet a été préalablement audité par le comité d’éthique de la Fondation de l’Avenir pour la Recherche Médicale Appliquée. La totalité du protocole a été conduit en accord avec les recommandations de ce même comité d’éthique et en conformité avec les principes exposés dans les textes et guides de référence, notamment le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (préparé par l’Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council, et publié par National Academy Press, révisé en 1996).[81]
A l’entrée en protocole, les poids des agneaux étaient de 40±4 kg.
Les études ont été réalisées sur 16 animaux randomisés en 3 groupes correspondant aux 3 différentes interventions prévues:
Matériel et méthodes 18
Groupe 1 (5 agneaux) : Cerclage classique de l’AP
Groupe 2 (5 agneaux +2 décédés en cours de protocole) :
Prélèvement musculaire
Cerclage classique de l’AP
Greffe cellulaire dans le VD
Groupe 3 (4 agneaux) : Cerclage de l’AP classique
Greffe d’un placebo dans le VD
Après deux mois de préparation ventriculaire droite, les quatorze agneaux ayant survécu ont subi une évaluation hémodynamique, puis les cœurs ont été prélevés pour analyse histologique.
Culture cellulaire
Technique de culture
La technique de préparation cellulaire utilisée ici pour sélectionner les cellules satellites (myoblastes squelettiques) in vitro, a été développée au laboratoire de l’IMM recherche
[12]. La biopsie musculaire a été réalisée dans le muscle biceps fémoral. Le principe est celui d’une dissociation mécanique, d’une digestion enzymatique puis d’une sélection des cellules d’intérêt par centrifugations différentielles.
Produits utilisés
Divers types de produits et de milieux ont été utilisés pour la technique de culture présentée ci-dessous. Leurs noms, leurs compositions et leurs abréviations sont les suivants :
1. DULBECCO’S Modified Eagle Medium (DMEM) avec Glutamax-1, sodium pyruvate, pyridoxine, 4500 mg/l glucose, GIBCOND
2. Phosphate Buffered Saline (PBS), pH7, 2/0,1M, GIBCOND
3. Collagénase (dessicat) SIGMAND C-9891, Lot 129H8607 collagen digestion activity: 548U/mg solid; FALGPA hydrolysis activity: 1.9 U/mg solid
4. Trypsine (1X) , GIBCOND
5. Sérum de veau fœtal (SVF), GIBCOND
6. Pénicilline/Streptomycine (Péni/strepto), GIBCOND
Milieux préparés par l’opérateur
Milieu de culture de base :
DMEM complété (DMEMc)
DMEM 79%
SVF 20%
Péni/strepto 1%
Pour la culture cellulaire (boîtes témoins pour valider la nature myoblastique des cellules implantées à J0), une observation quotidienne a été réalisée avec un microscope inversé à contraste de phase (LEICAND, DMIL).
Biopsie musculaire
Le prélèvement a porté sur 10 grammes de tissu musculaire pris sur la cuisse gauche (muscle biceps fémoral). La technique anesthésique utilisée a été la même que celle employée pour la deuxième intervention (cerclage de l’AP et/ou implantation intramyocardique) et est détaillée dans la partie « Anesthésie ».
Les agneaux du Groupe 2 ont été placés en décubitus latéral droit avec les membres postérieurs en extension. Le muscle biceps fémoral a été exposé par une incision cutanée en regard de ce muscle, sur la face latérale de la cuisse gauche. Après l’incision du fascia recouvrant cette région, un morceau de tissu musculaire (10 grammes environs) a été prélevé en utilisant le bistouri électrique. Le prélèvement a été nettoyé du fascia et du tissu conjonctif, puis haché avec des ciseaux par l’opérateur avant d’être stérilement transféré dans un milieu de culture: DULBECCO’S Modified Eagle Medium (DMEM, GIBCO ND), refroidi à 4°C. Les différents plans ont été fermés successivement de manière classique.
Dissociation mécanique
La biopsie a été transférée dans une cupule stérile puis coupée aux ciseaux de Mayo en petits dés. La dissociation mécanique a été poursuivie avec des ciseaux plus fins jusqu’à l’obtention d’un mélange type compote. Cette préparation a été stérilement transférée dans deux tubes contenant chacun 10 mL d’une solution stérile à base de collagénase 0,2% (voir préparation plus bas) puis a été pesée (environ 10 grammes).
Préparation des enzymes
Une solution de collagénase (SIGMAND C-9891, Lot 129H8607, collagen digestion activity: 548 U.mg solid; FALGPA hydrolysis activity: 1.9 U/mg solid) à 0,2 % a été préparée comme suit : 0,2g (/100mL) dans deux tubes de 50 mL avec 50 mL de DMEM par tube. Le mélange a été filtré avec une unité de filtration à dépression (ultrafiltration à 0.2µm).
Digestion enzymatique des fragments musculaires
Les tubes contenant les fragments musculaires ont été transférés dans un agitateur sec à 37°C pendant 20 min. Les tubes ont été ensuite centrifugés à 200g (=1200 t/mn) pendant 2 min. Le surnageant contenant les cellules satellites (environ 5 mL de culot et 10 mL de surnageant) a été retiré et conservé dans un flacon de 75 cm² contenant 50 mL de DMEM complété avec du sérum de veau fœtal et des antibiotiques (DMEMc). Dix mL de collagénase 0,2 % ont été rajoutés à chaque tube avec le culot restant puis remis à l’agitation à 37°C pendant 20 min encore. Cette série de digestions enzymatiques a été recommencée 4 fois, soit 5 extractions en tout.
Filtration et préparation finale
Le contenu du flacon de 75 cm² avec les cellules satellites a été filtré avec des filtres autoclavés de 250 µm pour le retrait des plus gros éléments musculaires. La préparation a été ensuite lavée par centrifugation dans 4 tubes de 50 mL, à 2000 t/min pendant 15 min ; le surnageant a été éliminé. Cette étape a été répétée encore une fois. L’ensemble a été reconditionné dans du DMEM pour la phase de marquage.
Marquage cellulaire
La technique de marquage cellulaire a été pratiquée comme suit :
Les cellules ont été lavées au PBS une fois dans 30 mL puis remises en suspension dans
10 mL de PBS. Le cmDiI a été ajouté (un tube de 50 µL, à 1 mg/mL dans du DMSO, dilution=1/200 (5×10-4/mL)). Les cellules ont été laissées 5 min à température ambiante puis 15 minutes dans la glace. Vingt mL de PBS ont été ajoutés puis les cellules ont été centrifugées pendant 5 min à 2000 t/min. Les cellules ont enfi été lavées 3 fois puis reconditionnées dans 2 mL de DMEM pur pour être greffées.Pour vérifier le nombre de cellules présentes dans la préparation cellulaire d’origine (et donc le nombre de cellules injectées), un échantillon de la préparation a également été sauvegardé avant marquage au cmDiI (utilisé ici pour le marquage in vivo) puis marqué au DAPI (4′-6-diamidino-2-phenylindole, marqueur fluorescent bleu de l’ADN (SigmaND) utilisé ici comme marqueur des noyaux in vitro uniquement). Les cellules ont été lavées au PBS une fois dans 30 mL puis remises en suspension dans 5 mL de DMEM pur. Le DAPI a été ajouté (25 µL/ 5mL ) et laissé au contact des cellules pendant 30 min à température ambiante. Les cellules ont enfin été lavées 3 fois. Les cellules ont été ensuite reconditionnées puis comptées à la cellule de Malassez avec un microscope à immunofluorescence bleue (LEICA ND, DMIL).
Observation de myotubes et immunomarquage
Deux boîtes de Pétri ont été systématiquement ensemencées au moment de la greffe ; l’une d’entre-elles a été observée au maximum de confluence pour l’éventuelle formation de myotubes, structures multinuclées allongées et larges, précurseurs de la fibre musculaire, signant ainsi la nature myoblastique des cellules cultivées. La formation des myotubes a été favorisée par le non-renouvellement du milieu de culture classique DMEMc. L’autre boîte a été gardée pour un immuno-marquage avec le facteur de régulation musculaire MyoD (DAKOND), comme précédemment décrit.[77]
Anesthésie
Prémédication
Juste avant l’induction, les agneaux ont reçu une prémédication avec une injection de midazolam (HYPNOVEL ND, 0,5 mg/kg IV) dans la veine jugulaire.
Induction
L’induction a été réalisée à l’aide d’étomidate (HYPNOMIDATE ND, 0,5 mg/kg, IV) ; les animaux ont ensuite été intubés et placés sous oxygène pur.
Une sonde gastrique a été posée pour drainer le contenu de l’estomac.
Entretien
Les animaux ont été placés sous ventilation contrôlée (Veterinary Anesthesia Ventilator, HALLOWELL EMC Model 2000, volume courant : 15mL/kg/min, permettant d’atteindre une pression de 20 cm H2O). Des apnées ont été faites pendant chaque acquisition des mesures hémodynamiques.L’entretien de l’anesthésie a été obtenu avec 2% d’isoflurane dans 100% d’oxygène. L’antibioprophylaxie a été réalisée avec du céphamendole (Kéfandole ND) 750 mg IV toutes les 2 heures.Pendant toute la durée de l’intervention, les animaux ont été perfusés avec un soluté de Ringer Lactate (10mL/kg/h). Les agneaux ont également été placés sur tapis chauffant à circulation d’eau.La surveillance comportait un ECG et les mesures suivantes : pression artérielle invasive (cathéter posé à l’oreille), capnométrie, température corporelle (sonde œsophagienne).
Des valeurs seuil étaient fixées : fréquence cardiaque entre 60 et 120 bpm, pression artérielle moyenne entre 60 et 90 mm Hg, pression partielle en CO2 entre 35 et 45 mmHg.Au moment de la fermeture du thorax par le chirurgien, un bloc de bupivacaïne 0,5% a également été réalisé sur les espaces intercostaux intéressés par la thoracotomie (4 mL à chaque injection, trois sites intercostaux en tout).
Soins postopératoires
Les cathéters veineux et artériels ont été retirés avant le réveil des animaux. De la morphine (Morphine base ND) a été administrée au moment du réveil (0,2 mg/kg IV). Une injection de kétoprofène (Ketofen ND), à la dose de 2 mg/kg IM, a été faite pendant le réveil de l’animal. Les animaux ont également reçu une injection de dexaméthasone (Dexafort, 0,1mg/kg IM) au réveil puis tous les trois jours, soit trois fois en tout. L’antibioprophylaxie avec du céphamendole (20mg/kg IV par jour) a été poursuivie avec une injection d’amoxycilline longue action (10mg/kg, IM), une fois tous les deux jours, trois fois en tout.
Evaluation hémodynamique avant et après l’entraînement
La technique utilisée au cours de l’étude a été d’acquérir des valeurs de pression et de volume pour établir des courbes pression-volume. A partir de ces courbes, il a été démontré [19] que des facteurs relativement indépendants des conditions de charges pouvaient être calculés pour mesurer la contractilité cardiaque. Les pressions ont été acquises par un cathéter dont le micro-transducteur se trouve directement dans la cavité ventriculaire (cathéter d’ultra précision de Millar ND). Le volume a été également mesuré par ce même cathéter (dit de conductance), fonctionnant sur la mesure de la résistivité du sang, dont des volumes segmentaires du ventricule peuvent être déduits.
Technique d’évaluation
L’application du cathéter de conductance a été largement publiée et validée pour le ventricule gauche [5, 7]. Plus récemment, cette même méthode a été utilisée avec succès pour mesurer le volume du ventricule droit [25, 106, 108]. Brièvement, le signal de conductance a été acquis en trois segments parallèles dans le VD. Tous les signaux instantanés de pression et volume étaient acquis puis transformés en une boucle de pression-volume à l’aide du logiciel IOX 1.6.17.7 d’EMKA Technologies. La technique d’évaluation de la fonction ventriculaire reposait sur l’acquisition de courbes pression-volume de la cavité droite, en condition hémodynamique normale. De ces valeurs amplifiées et calibrées ont été mesurés les paramètres hémodynamiques suivants : dPdtmax et min, pression développée, travail d’éjection, PRSW (preload recruitable stroke work).
Les mesures des performances contractiles du VD consistaient en deux parties : état mécanique stable et occlusion.
1. Etat mécanique stable
L’acquisition a eu lieu pendant une période sans influence mécanique ou chimique.
Quatre paramètres ont été mesurés :
Pression développée : la différence entre les pressions systolique et diastolique ;
dP/dt Max et dP/dt Min: le maximum et le minimum de la première dérivée de la pression en fonction du temps[79, 111];
Stroke work : Travail d’éjection produit par le ventricule à chaque cycle cardiaque, soit l’aire déterminée par la courbe pression-volume à chaque battement [93].
2. Etat d’occlusion
Pour obtenir différentes courbes pression-volume du VD, et ainsi pouvoir déterminer les valeurs d’intérêt sous différentes conditions de charge, les signaux de pression et de volume ont été enregistrés pendant un gonflement progressif d’un ballonnet dans la veine cave caudale. Pendant cette diminution, la relation entre le travail d’éjection et le volume télé-diastolique (PRSW Preload recruitable stroke work) a été enregistrée [93].
Méthode du cathéter de conductance
1. Introduction des principes
La technique de cathéter de conductance est fondée sur les mesures de la conductance électrique instantanée-variable du sang dans le ventricule. La conductance électrique est linéairement proportionnelle au volume réel du sang dans le ventricule (loi d’Ohm). Le ventricule est divisé précisément en plusieurs segments. La conductance de chaque segment est obtenue par la mesure du voltage entre deux électrodes consécutives du cathéter de conductance (voir Figure 2).
A : Les segments du cathéter de conductance dans le ventricule
B : Les signaux des volumes segmentaires
C : Le signal du volume total
Les volumes segmentaires présentent une relation avec les conductances segmentaires mesurées en utilisant l’équation 1:
Vi(t) = L2 • ρ • Gi (t)
Équation 1
Vi(t) = volume segmentaire instantané-variable
L = distance inter-électrode
ρ = résistivité du sang
Gi(t) = conductance segmentaire instantanée-variable mesurée
Le volume total du ventricule est défini comme l’addition des volumes segmentaires comme décrit par l’équation 2 :
n
V(t) = L2 • ρ • ∑Gi(t)
i =1
Équation 2
Mais, il existe deux phénomènes qui rendent le calcul du volume ventriculaire plus compliqué que celui de l’équation 2:
Le cathéter de conductance mesure non seulement la conductance du sang dans le ventricule, mais aussi détecte la conductance du myocarde environnant, conductance dite parallèle (Gp). La conductance parallèle doit donc être déterminée pour obtenir un volume de correction (Vc), qu’il est nécessaire de soustraire au volume total mesuré pour obtenir le volume intra-ventriculaire absolu[15].
Il existe également un facteur de pente nécessaire à la calibration : le facteur alpha (α).
L’introduction de ces deux facteurs de calibration se présente selon la relation suivante:
V( t ) = 1 2 n
α L ⋅ ρ ⋅ ∑Gi ( t ) −Vc
i=1
Équation 3
Détermination des facteurs
a) Facteur α
Le facteur α peut être déterminé par comparaison entre une mesure de débit ou de volume par une technique de référence (par exemple, mesure du débit par thermodilution) et par la technique du cathéter de conductance. Le facteur α est donné par l’équation suivante :
α = débit – Conductance débit – Thermodilution
Équation 4
b) Volume de conductance parallèle (Vc)
La méthode la plus souvent utilisée pour déterminer le Vc est la technique de dilution. Elle est de fait une analyse du signal de conductance pendant un changement momentané et provoqué de la conductivité du sang. Pour les mesures dans le VD, une injection rapide de sérum salé hypertonique 10% dans la veine cave permet un bon mélange avec le sang avant son entrée dans le ventricule. Lorsque ce mélange entre temporairement dans le ventricule, un changement progressif du signal de conductance est observé (voir Figure 3). L’augmentation du signal de conductance (ou volume) peut être extrapolée en télésystole et télédiastole pour obtenir un volume intraventriculaire théoriquement nul (volume télésystolique=volume télédiastolique). La valeur du volume total est alors celle de la conductance et du volume parallèle.
Ainsi, la conductance parallèle est calculée puis enregistrée dans l’ordinateur pour réaliser la calibration des mesures.
Voie d’abord
L’animal a été placé en décubitus dorsal. Une tonte large et une préparation chirurgicale classique du cou et des creux inguinaux ont été effectuées avant de draper l’animal stérilement. Après une héparinisation de l’animal (0,5 mg/kg IV), deux introducteurs ont été posés de manière percutanée: l’un de 7 Fr dans la veine fémorale droite (CORDISND), l’autre de 10 Fr dans la veine jugulaire droite (CORDISND).
Matériel utilisé
Toute la manipulation a été réalisée sous amplificateur de brillance (Sténoscope, General Electric, Milwaukee, USA).
Après calibration en pression et en volume, une sonde de Millar pression-volume (HOUSTON, USA – 6 Fr, 120 cm avec extrémité en queue de cochon, 10 électrodes, espacement de 7 mm, référence : 815-0039-1, model SPC-560) a été introduite par l’introducteur de 7 Fr (veine fémorale droite) jusqu’au ventricule droit. Cette sonde était connectée à un processeur Leycom Sigma-50F (Cardiodynamics, Zoetermeer, Pays-Bas). Les signaux de pression et de volume étaient traités par le logiciel IOX 1.6.17.7 d’EMKA Technologies, installé sur un PC CompaqND Pentium I avec Windows NT.
Le cathéter de thermodilution de Swan Ganz [26] (BAXTERND 7,5F, 110 cm, référence : 831HF75) a été introduit par l’introducteur de 10 Fr jusqu’à l’artère pulmonaire. Il a été connecté à un moniteur Hewlett Packard (78354A) avec module de débit[72]. (voir Figure 4-position des cathéters dans VD)
Protocole d’acquisition
Avant l’introduction des cathéters, une calibration à l’air de la sonde de Millar a été réalisée pour la pression et pour le volume.
Tous les animaux ont été évalués lorsque les paramètres de monitorage peropératoire étaient stabilisés, en particulier la pression partielle en CO2 entre 35 et 40 mmHg, la pression artérielle moyenne 60 et 90 mmHg et le pourcentage d’isoflurane (mesurés par analyseur de gaz halogéné) entre 1,5 et 2,5%. Toutes les acquisitions hémodynamiques ont été obtenues pendant une apnée en fin d’expiration.
Le débit cardiaque de référence pour mesurer le paramètre alpha a été acquis de manière classique avec le cathéter de thermodilution de Swann-Ganz. Trois mesures répétées à 3 minutes d’intervalle ont servi à ce calcul. Puis la sonde de Swan-Ganz a été retirée dans l’oreillette droite pour injecter le sérum salé hypertonique 7,5% (2 fois 10mL à 3 minutes d’intervalle). Les modifications de la résistivité, donc du volume perçu par la sonde, étaient vérifiées en temps réel sur l’écran de l’ordinateur. La sonde de Swan Ganz a été ensuite retirée de l’introducteur placé en jugulaire et un cathéter à ballonnet de 18 mm (CORDISND) a été placé dans la veine cave caudale. Une série de trois occlusions a été réalisée en gonflant le ballon à 3 minutes d’intervalle. Les variations caractéristiques de la courbe pression-volume étaient vérifiées sur l’écran de l’ordinateur. Cette technique a été appliquée pour les deux évaluations, à J0 (avant le cerclage) et à J60 (avant le sacrifice et prélèvement du cœur pour étude histologique).
Les gestes chirurgicaux n’ont été démarrés qu’après une période de 30 minutes suivant l’évaluation hémodynamique du VD.
Technique chirurgicale
1. Voie d’abord
Une tonte large de toute la face latérale du thorax a été effectuée. L’animal était placé en décubitus latéral droit. Un billot a été placé sous le thorax. L’abord chirurgical s’est fait par thoracotomie intercostale gauche par le 4ème espace intercostal. Les muscles cutanés du tronc, grand dorsal, dentelé, scalènes et intercostaux ont été incisés dans le sens des côtes. Une fois la cavité pleurale pénétrée, un écarteur autostatique de Finochietto a été introduit dans le 4ème espace intercostal. Le péricarde a été ouvert sur toute sa longueur, le long du grand axe cardiaque et mis en tension par des fils de traction reliés au champ opératoire.
2. Cerclage de l’AP
Le tronc de l’AP a été disséqué de la racine de l’aorte avec des ciseaux fins, puis un petit dissecteur a été utilisé pour la mise en place d’un lac sans serrage autour de l’AP. Un cathéter 22G a été introduit à la base de l’artère pulmonaire (proximalement au lac bleu). La pression systolique proximalement au site de cerclage a alors été notée (pression de base); cette même mesure a été réalisée lors de clampage complet de courte durée de l’artère pulmonaire avec un clamp vasculaire (pression maximale). Le cerclage était ensuite serré (puis suturé avec un fils de ProlèneND 5-0) pour atteindre la pression moyenne ((pression de base + pression maximale) / 2).
3. Préparation des cellules pour l’implantation myocardique
Les cellules ont été conditionnées dans un tube de 10 mL de DMEM. Le temps maximal entre le conditionnement des cellules et leur implantation était de 10 minutes. Une homogénéisation du contenu cellulaire a été pratiquée avant l’implantation cellulaire.
4. Dispositif d’injection
Une seringue à insuline (1 mL) a été connectée à une aiguille épicrânienne de 27G (VYGONND). Les ailettes de l’aiguille étaient maintenues dans une pince de Halstedt. Le fourreau de l’aiguille a été taillé à façon pour servir de garde et ne laisser dépasser qu’une petite partie de l’aiguille; ce dispositif simple a assuré ainsi une injection intramyocardique. Les longueurs d’aiguilles ont été fixées à 2 mm.
5. Injections intramyocardiques
Vingt injections sur le ventricule droit ont été pratiquées sur les deux premiers animaux puis 10 sur les 5 autres du groupe 2 et les 4 du groupe 3.
Une zone d’injection a été repérée par trois points de suture épicardiques en triangle avec un fil de polypropylène 6-0 (Prolène ND) pour faciliter les prélèvements prévus le jour de l’autopsie.
Un contrôle de l’ECG était effectué au moment de chaque pénétration de l’aiguille et pendant les injections.
6. Fermeture du thorax
Le péricarde a été refermé partiellement par un surjet de polyglactine 910 (VICRYLND) décimale 3. Après la mise en place d’un drain thoracique (30 Ch) à aspiration continue, la paroi costale a été fermée de manière classique plan par plan. Du fil de polyglactine 910 (VICRYLND) décimale 4 a été utilisé pour rapprocher les côtes et suturer les différents plans musculaires par des surjets interrompus ; ce même fil en décimale 3 a été utilisé pour le surjet sous-cutané ; puis un surjet continu avec un fil de polyamide (ETHILON ND) décimale 2 a été réalisé sur le plan cutané.
Autopsie, analyse histologique et immunohistochimique
Après l’évaluation à J60, les agneaux ont été sacrifiés. L’euthanasie a été pratiquée par l’injection intraveineuse de pentobarbital (DoléthalND). Les cœurs ont été prélevés par la même voie d’abord intercostale.
La partie sténosée de l’AP a été prélevée en gardant le lac. Après la résection des gros troncs (jusqu’aux valves sigmoïdes) et des oreillettes gauche et droite, le reste du cœur a été pesé. Puis la paroi libre du VD a été disséquée du cœur et pesée.
Le VD a ensuite été prélevé en différents endroits : zones greffées et zones non-greffées respectivement.
Chaque prélèvement a été divisé en deux éléments. Le premier a été fixé dans du formol dilué au 1/10ème (formol 3%) pour la microscopie optique et l’immunohistochimie, le deuxième a été congelé à –80°C avant d’être coupé au cryostat (-20°C) pour la fluorescence.
Sur les coupes en paraffine de 7µm pour la microscopie optique, après une inclusion en paraffine classique, un marquage HE standard et une révélation par une technique immunohistochimique de la chaîne lourde de myosine squelettique au 1/100ème (clone MY32, SigmaND) a été appliquée par une technique automatisée pour rechercher les signes de myogenèse dans les sites de greffe.
Le principe de révélation immuno-histochimique sur banc automatisé est le suivant : Les lames ont été déparaffinées et réhydratées avec du PBS puis incubées 30 min avec les anticorps primaires (MY32). Après un rinçage dans du PBS, les coupes ont été incubées pendant 8 min avec un anticorps anti-IgG de souris biotinylé. Après un rinçage dans du PBS, les coupes ont été incubées pendant 8 min avec de la streptavidine couplée à de la peroxydase. Après un rinçage dans du PBS les coupes ont été incubées pendant 8 min avec les substrats de la peroxydase (eau oxygénée et diamino-benzidine) jusqu’à obtention d’un produit de réaction coloré en marron. Puis elles ont enfin été contre-colorées avec de l’hématoxyline et post-contre colorées avec un réactif bleu, puis rincées et montées sur lamelles.
Les coupes faites au cryostat pour évaluer la présence des marqueurs fluorescents ont été réalisées à –20°C. L’épaisseur des coupes était de 10µm. Les lames ont été gardées vierges et ont été observées avec un microscope à immunofluorescence (LEICAND, DMIL).
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Table des matières
INTRODUCTION
ETAT DES LIEUX
I. TRANSPOSITION DES GROS VAISSEAUX
A. APERÇU GENERAL
B. OPTIONS THERAPEUTIQUES
1. Correction anatomique : « switch »
2. Correction physiologique : Mustard et Senning
C. LIMITES TECHNIQUES
1. Correction physiologique
2. Correction anatomique
II. CARDIOMYOPLASTIE CELLULAIRE
A. RAPPELS
B. ETAT DE LA QUESTION : POINTS CLEFS ET REFERENCE
C. APPLICATION POTENTIELLE DANS LE VENTRICULE DROIT BUT DE L’ETUDE
MATERIEL ET METHODES
I. ANIMAUX
II. SCHEMA EXPERIMENTAL
III. CULTURE CELLULAIRE
A. TECHNIQUE DE CULTURE
B. PRODUITS UTILISES
C. MILIEUX PREPARES PAR L’OPERATEUR
D. BIOPSIE MUSCULAIRE
E. DISSOCIATION MECANIQUE
F. PREPARATION DES ENZYMES
G. DIGESTION ENZYMATIQUE DES FRAGMENTS MUSCULAIRES
H. FILTRATION ET PREPARATION FINALE
I. MARQUAGE CELLULAIRE
J. OBSERVATION DE MYOTUBES ET IMMUNOMARQUAGE
IV. ANESTHESIE
A. PREMEDICATION
B. INDUCTION
C. ENTRETIEN
V. SOINS POSTOPERATOIRES
VI. EVALUATION HEMODYNAMIQUE AVANT ET APRES L’ENTRAINEMENT
A. TECHNIQUE D’EVALUATION
1. Etat mécanique stable
2. Etat d’occlusion
B. METHODE DU CATHETER DE CONDUCTANCE
1. Introduction des principes
2. Détermination des facteurs
C. VOIE D’ABORD
D. MATERIEL UTILISE
E. PROTOCOLE D’ACQUISITION
F. TECHNIQUE CHIRURGICALE
1. Voie d’abord
2. Cerclage de l’AP
3. Préparation des cellules pour l’implantation myocardique
4. Dispositif d’injection
5. Injections intramyocardiques
6. Fermeture du thorax
VII. AUTOPSIE, ANALYSE HISTOLOGIQUE ET IMMUNOHISTOCHIMIQUE
VIII. ETUDE DES ANIMAUX DECEDES
IX. GESTION STATISTIQUE DES DONNEES
RESULTATS
I. EVOLUTION CLINIQUE DES AGNEAUX AU COURS DE L’ETUDE
II. PREPARATION CELLULAIRE SANS CULTURE
A. COMPTAGE CELLULAIRE
B. RICHESSE EN MYOBLASTES DES CULTURES TEMOINS
1. Observation de myotubes
2. Méthode immunocytochimique
C. MARQUAGE MEMBRANAIRE AVEC LE CMDII
III. EVALUATION FONCTIONNELLE
A. REALISATION DE L’EXAMEN HEMODYNAMIQUE / ACQUISITION DES COURBES PRESSIONVOLUME
B. RESULTATS
1. Pression développée (DP developed pressure)
2. dP maximale (Max dP/dt)
3. dP minimale (Min dP/dt)
4. travail d’éjection (SW stroke work)
5. pente de PRSW (S-PRSW Preload Recruitable Stroke Work Slope)
IV. ANATOMO-PATHOLOGIE
A. OBSERVATIONS MACROSCOPIQUES
B. ANALYSE HISTOLOGIQUE
DISCUSSION
I. PREPARATION CELLULAIRE ISSUE DU MUSCLE SQUELETTIQUE ET RESULTATS HISTOLOGIQUES
II. MODE D’ADMINISTRATION DES CELLULES
III. MARQUAGE
IV. MODELE DE PREPARATION AVANT « SWITCH »
V. METHODOLOGIE ET RESULTATS DES COURBES PRESSION-VOLUME
CONCLUSION
PERSPECTIVES
REFERENCES
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