Soutenance mémoire
Croissances folliculaire et ovocytaire
RECOLTE ET SELECTION DES OVAIRES
Les ovaires ont été collectés lors d’ovariectomies de convenance de 43 chattes dans le cadre des activités cliniques de l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort. Ces chattes étaient âgées de 7 mois à 3 ans et 4 mois (moyenne ± erreur standard sur la moyenne : 1,17 ± 0,09 ans) et au moins cinq d’entre elles présentaient des signes comportementaux d’œstrus. Il n’a pas été tenu compte de leur race, mais il s’agissait, pour la plupart, de chattes de type européen.Dès leur exérèse, les ovaires ont été placés dans une solution contenant un tampon phosphate (Phosphate Buffered Saline ou PBS, Sigma-Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, France) et maintenus à 38°C, c’est-à-dire dans des conditions d’osmolarité et de température proches de celles retrouvées in vivo. La figure 6 présente l’aspect macroscopique d’un ovaire de chatte présentant de nombreux grands follicules immédiatement après son exérèse.
PREPARATION HISTOLOGIQUE
Seuls les ovaires présentant de nombreux follicules de 1 à 3,5 mm de diamètre et sur lesquels aucun corps jaune ne pouvait être observé ont été sélectionnés et fixés dans une solution de formaldéhyde à 10 % (v/v, VWR, Fontenay sous Bois, France) pendant une semaine.
Suite à leur fixation, les ovaires ont été progressivement déshydratés par passages successifs dans des solutions d’éthanol (VWR) de degré croissant. Ils ont ensuite été inclus dans la paraffine (Paraplast, CML, Nemours, France) et disposés dans des moules plastiques cubiques.Le détail du protocole de déshydratation et d’inclusion des ovaires est donné dans l’annexe 1.Après démoulage, les blocs de paraffine ont été sectionnés à l’aide d’un microtome (Leitz, Wetzlar, Allemagne), en coupes de 7 µm d’épaisseur. Les lames ont préalablement été traitées au 3-aminopropyltriethoxysilane (silane, Sigma-Aldrich), un composé corrosif, afin que les coupes de paraffine adhèrent plus efficacement.Les coupes ont ensuite été déposées sur les lames traitées et placées sur une plaque chauffante à 42°C afin de permettre leur étirement. L’excédent de milieu de montage a été éliminé grâce à un papier absorbant et les lames ont été laissées à températureambiante pendant douze heures sur un portoir pour le séchage.Les lames ainsi préparées ont été réhydratées dans des bains successifs de solutions d’éthanol de degré décroissant et colorées par la coloration Hématoxyline-Eosine-Safran (HES) (annexe 2). L’hématoxyline colore d’abord les noyaux cellulaires en violet. L’éosine colore ensuite le cytoplasme des cellules en rose. Enfin, le safran colore les fibres de collagène du tissu conjonctif en orange.
MESURE DES DIAMETRES FOLLICULAIRES ET OVOCYTAIRES
Chaque coupe d’ovaire a été observée au microscope (BX41, Olympus, Rungis, France). Les mesures ont été réalisées grâce à un micromètre oculaire. Le diamètre des follicules et des ovocytes a été déterminé par deux mesures perpendiculaires en prenant comme limites : – pour le follicule, la membrane basale – pour l’ovocyte, la zone pellucide d’une part, et la membrane cytoplasmique d’autre part. La différence entre les deux types de mesures réalisées pour le diamètre ovocytaire a permis de calculer l’épaisseur de la zone pellucide. Sauf mention contraire, nous nommerons désormais « diamètre ovocytaire » le diamètre mesuré en incluant la zone pellucide. La figure 7 présente la photographie d’un follicule pré-antral au microscope optique sur laquelle sont annotés les repères qui ont été choisis pour mesurer les diamètres ovocytaires et folliculaires.Chaque mesure a été réalisée au grossissement le plus élevé possible, c’est-à-dire x400 pour les follicules inférieurs à 300 µm, x200 ou x100 pour les follicules de 300 à 1000 µm et x40 pour les follicules de plus de 1000 µm. Les lames ont été photographiées à l’aide d’un appareil photographique numérique (Camedia digital camera C-3030 zoom, Olympus, Rungis, France). Les images ainsi obtenues ont été transférées vers un ordinateur via un logiciel spécifique (Camedia Master 2.0, Olympus) puis analysées. Cette procédure a permis de localiser plus aisément les lames d’intérêt, et donc d’effectuer un gain de temps considérable. Les plus gros follicules ont été observés sur plusieurs coupes consécutives afin de déterminer avec précision leur diamètre maximal. Pour ces follicules, le diamètre de l’ovocyte a été mesuré sur la coupe centrée sur son noyau. La présence de plusieurs ovocytes par follicule, caractérisant un follicule polyovocytaire, n’a pas été spécifiquement étudiée. Les résultats ont été retranscrits dans des tableaux dont un exemple est donné en annexe 4. Pour chaque follicule ont été rapportés le stade folliculaire, le diamètre de l’ovocyte comprenant ou non la zone pellucide et le diamètre du follicule. Pour chaque donnée, le numéro de la lame ayant été utilisée pour la mesure ainsi que le grossissement choisi ont été soigneusement indiqués afin de permettre les vérifications éventuelles.
CLASSIFICATION DES STADES FOLLICULAIRES
Pedersen et Peters (1968) ont proposé une classification des ovocytes et des follicules à partir de leurs observations chez la souris. Elle est basée sur la taille de l’ovocyte, la taille du follicule, le nombre de cellules folliculaires entourant l’ovocyte (nombre de cellules visibles au microscope optique sur la plus grande section du follicule) et la présence et la morphologie de l’antrum. Cette classification a été reprise dans cette étude. Néanmoins, dans un souci de simplification, certains stades folliculaires ont été regroupés (tableau 1).
Nous avons ainsi défini les stades folliculaires comme suit (figure 8) : – Primordial : ovocyte entouré de couche de cellules folliculaires aplaties – Primaire : ovocyte entouré d’une couche de cellules folliculaires cuboïdales – Secondaire : ovocyte entouré de deux couches de cellules folliculaires – Pré-antral : ovocyte entouré de plus de deux couches de cellules folliculaires – Jeune antral : follicule contenant plusieurs petites cavités antrales – Antral : follicule contenant une grande cavité antrale unique
ANALYSE STATISTIQUE
Pour chaque stade folliculaire, les moyennes des diamètres folliculaires, ovocytaires ainsi que l’épaisseur de la zone pellucide ont été calculées et les résultats sont exprimés sous la forme de moyenne ± SEM (en anglais Standard Error of the Mean, ou erreur-type sur la moyenne). L’erreur-type est le résultat du quotient de l’écart type de l’échantillon par la racine carrée de la taille de cet échantillon. Elle informe sur le degré selon lequel la moyenne de l’échantillon approche la moyenne de la population. Plus elle est petite, plus l’échantillon est donc représentatif. De même, plus l’échantillon est grand, plus cette erreur est petite.Lors de la comparaison des diamètres folliculaires, des diamètres ovocytaires et de l’épaisseur de la zone pellucide en fonction du stade folliculaire, nous avons procédé à une analyse de la variance puis à un test de Student-Neuman-Keuls (SAS, Cary, NC, USA). L’analyse de la variance (ANOVA, en anglais ANalysis Of VAriance), est un test statistique qui permet de comparer les moyennes issues de plusieurs échantillons. On peut considérer qu’il s’agit d’une généralisation du test de Student à plus de deux moyennes. En effet, l’utilisation du test de Student pour comparer les moyennes deux par deux conduirait à surestimer le risque d’erreur. Nous avons supposé pour l’utilisation de ces tests que la distribution des populations observées suivait une loi normale dont les variances étaient identiques. De plus, nous avons décidé de façon arbitraire que les résultats seraient significatifs si le risque de considérer que les moyennes observées étaient différentes alors qu’elles ne l’étaient pas (risque α) était inférieur à 5 %. La conclusion de l’ANOVA utilisée seule est que toutes les moyennes comparées sont identiques ou que l’une des moyennes est significativement différente. Nous avons donc poursuivi notre étude par un test de Student-Neuman-Keuls qui a permis de comparer les moyennes deux par deux.Enfin, afin de permettre la mise en relation de la croissance folliculaire avec la croissance ovocytaire, nous avons utilisé les régressions linéaires simples fournies par le logiciel Excel (Office XP, Microsoft, Courtaboeuf, France). Pour chaque équation nous avons calculé le coefficient r, appelé coefficient de corrélation linéaire de Bravais-Pearson. Ce coefficient a pour but d’évaluer la pertinence de la régression linéaire. Il peut être comparé à une valeur seuil indiquée dans la table de Bravais-Pearson, et qui tient compte de la taille de l’échantillon étudié ainsi que du risque d’erreur toléré. En règle générale on considère que le test est valide lorsque r est supérieur à la moitié de la racine de 3 (environ 0,87). Par convention, nous avons choisi d’indiquer le carré de ce coefficient, r2, qui représente le coefficient de détermination et permet de faciliter la comparaison. La valeur de ce dernier est comprise entre 0 et 1, 1 indiquant une corrélation parfaite. Ainsi, r2 = 0,8 signifie que 80 % de la variation de Y est expliquée par la variation de X et vice versa. On en déduit la probabilité qu’il n’y ait pas réellement de relation linéaire (risque α) entre les deux variables, notée P. Par convention, nous avons choisi de rejeter cette hypothèse lorsque cette probabilité était inférieure à 5 %.
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Table des matières
ABLE DES MATIERES
LISTE DES ABREVIATIONS
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
INTRODUCTION
1.Matériels et méthodes
1.1.Récolte et sélection des ovaires
1.2. Préparation histologique
1.3. Mesure des diamètres folliculaires et ovocytaires
1.4. Classification des stades folliculaires
1.5.Analyse statistique
2. Résultat
2.1. Croissance folliculaire
2.2. Croissance ovocytaire
2.3.Relation entre la croissance folliculaire et ovocytaire
2.3.1. Selon le stade folliculaire
2.3.2. Tous stades folliculaires confondus
2.4. Apparition et évolution de l’épaisseur de la zone pellucide
2.4.1. Selon le stade folliculaire
2.4.2. Tous stades folliculaires confondus
3. Discussion
3.1. Croissances folliculaire et ovocytaire
3.1.1. Croissance folliculaire
3.1.2. Croissance ovocytaire
3.2. Formation de l’antrum
3.2.1. Rôles et origine de l’antrum 1
3.2.2. Apparition de l’antrum lors de la folliculogenèse
3.2.3. Relation entre la formation de l’antrum et l’acquisition de la compétence méïotique
3.3. Relation entre la croissance folliculaire et ovocytaire
3.3.1 Croissance biphasique de l’ovocyte
3.3.2. Relation entre l’acquisition du diamètre ovocytaire maximal et la formation de l’antrum
3.3.3. Relation entre le diamètre ovocytaire et l’acquisition de la compétence méïotique
3.4. Apparition et évolution de l’épaisseur de la zone pellucide
3.4.1.Composition et structure de la zone pellucid
3.4.2. Apparition de la zone pellucide lors de la folliculogenèse et origine
3.4.4. imensions de la zone pellucide chez la chatt
3.4.5. Perspectives
3.5. Quelques remarques sur les follicules polyovocytaires
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES
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