Soutenance mémoire
Le stress hydrique et la mémoire du stress
L’eau possede des proprietes permettant le maintien de la vie et constitue une molecule fondamentale dans la plupart des processus cellulaires. En effet, sa disponibilite a un impact direct sur le developpement et la survie des organismes vivants, en particulier les plantes. L’importance de l’eau a ete demontree par exemple chez Arabidopsis thaliana chez laquelle les signaux de secheresse se traduisent par des effets sur l’expression genetique et un controle epigenetique (Yamaguchi-Shinozaki et Shinozaki 2005). Chez cette plante, les transcrits des genes RD29A (Responsive to Dessication), RD20 (preoxygenasse implique dans le metabolisme d’oxylipine en cas de stress biotique et abiotique) et AtGOLS2 (galactitol synthase 2 qui catalyse la formation du galactitol a partir de UDP-galactose de myo-inositol) s’accumulent en reponse au stress hydrique et diminuent en quantite Les plantes disposent de mecanismes permettant la memorisation du stress.
Par exemple, une plante qui subit une periode de secheresse se fletrisse sous le stress de la deshydratation puis se retablit apres une rehydratation (panneau superieur); au cours d’un second stress hydrique, la plante memorise sa premiere exposition au stress, ce qui permet de mieux resister a la deshydratation et d’ameliorer ses chances de survie (panneau inferieur) (Ding et al., 2012). SAM correspond a ≪ S-adenosyl methionine ≫ groupement donneur de methyle (−CH 3 ). Une enzyme ADN methyltransferase est necessaire pour la reaction de methylation au niveau d’une cytosine (Jammes et Renard, 2010). apres une rehydratation. En condition de stress hydrique, l’evolution des niveaux de transcrits est correlee avec l’acetylation de la lysine 9 de l’histone H3 (H3K9ac) et l’abondance d’ARN polymerase II de maniere transitoire. Apres la rehydratation les niveaux de transcrits diminuent. Les modifications de l’histone trimethylee H3 correlees a la transcription active, suggerent que cette marque de la chromatine pourrait jouer un role dans la memorisation du stress hydrique et agirait par une controle epigenetique sur la transcription de ces genes.
En effet, cette marque est induite par le stress hydrique et maintenue a certain niveau pendant la rehydratation (Kim et al., 2012). L’exposition multiple a la secheresse permet aux plantes de mieux reagir a un nouveau stress en modulant plus rapidement l’expression de leurs genes que des plantes non exposees auparavant a un stress hydrique (fig2). Ding et al., 2012 ont montre que, chez A.thaliana, les transcrits RD29A et COR15A s’accumulent progressivement: c’est-a-dire qu’ils sont plus abondants lors d’un second stress hydrique que lors du premier. Le changement progressif dans l’expression genique et l’accumulation des transcrits peuvent etre le resultat d’une augmentation progressive de H3K4me3 et de la phosphorylation de la serine 5 (Ser5P) de l’ARN polymerase II pendant le processus de recuperation apres deshydratation. Bien que la transcription des genes diminue jusqu’au niveau basal chez les plantes d’A.Thaliana non soumises a un stress, les niveaux relativement eleves de H3K4me3 et l’abondance de l’ARN polymerase II (Ser5P) ont ete maintenus et peuvent contribuer a la memorisation du stress (Ding et al., 2012).
La méthylation de l’ADN et mémoire du stress
La methylation de l’ADN est la modification epigenetique la plus analysee. Elle consiste en une addition d’un groupe methyle sur une cytosine, une adenine ou une guanine. Cependant, la methylation de la cytosine est la plus frequente, en particulier la methylation 5C. Chez les plantes, la methylation de l’ADN est une modification covalente de type CHG et CHH (H = A, G ou T) ou le groupe CH3 est apporte par le S-Adenosyl Methionine (SAM) (fig3). Elle est mediee par une famille d’enzymes : les ADN methyl transferases, (DNMT ; Bestor 2000) dont certaines sont responsables de nouvelles methylations tandis que d’autres maintiennent les methylations a travers la mitose et participent donc a la conservation de la memoire epigenetique. La methylation n’affecte que 3 a 8% des cytosines chez les mammiferes contre 50% chez les plantes. En effet, la methylation de novo de l’ADN est consideree comme une reponse adaptative de la plante a son environnement avec la possibilite de changements rapides et stables de l’expression des genes en fonction des conditions environnementales (Zhang et al., 2013).
Plusieurs etudes ont montre une correlation negative entre la methylation de l’ADN, plus precisement la methylation du promoteur, et l’expression des genes tels que chez A.thaliana ou une perte de methylation (demethylation) de l’ADN entraine une induction de la transcription (fig4, Zilberman et al., 2007). La methylation de nombreux genes en reponse a un stress ou lors de processus developpementaux indique le role important de cette modification epigenetique chez la plante (Kawakatsu et al., 2016, Wang et al., 2014; Meyer, 2015). Chez le soja, par exemple lors d’un stress salin, une reduction de la methylation de l’ADN et une activation transcriptionnelle des genes qui codent pour des facteurs de transcription lies a la reponse au stress ont ete mis en evidence (Kim et al., 2015).
L’ADN traite au bisulfite puis purifie sur une colonne de centrifugation et est utilise pour preparer la bibliotheque de sequencage a l’aide du kit EpiGnome ™. Dans cette procedure, l’ADN simple brin traite au bisulfite est amorce de maniere aleatoire en utilisant une polymerase capable de lire les nucleotides de l’uracile afin de synthetiser l’ADN contenant un marqueur de sequence specifique. Les extremites 3′ des brins d’ADN nouvellement synthetises sont ensuite selectivement marquees avec une seconde sequence specifique, ce qui donne des molecules d’ADN bi-marquees avec des etiquettes de sequence connues a leurs extremites 5′ et 3’. Ces etiquettes sont ensuite utilisees pour ajouter des adaptateurs Illumina P7 et P5 par PCR aux extremites 5 ‘et 3’, respectivement, du brin d’ADN original.
Le petunia a fleur blanche (Petunia axillaris) est de la famille des solanacees originaire d’Amerique du Sud. C’est un parent sauvage de l’une des fleurs les plus populaires de l’horticulture, le Petunia de jardin (Petunia hybrida). Son genome diploide de 1,4 Gb donne un apercu de l’evolution du petunia cultive. Le Petunia, avec un nombre de chromosomes de base de x = 7, est le seul genre genetiquement accessible qui est caracterise par une periode de generation relativement courte, la facilite de culture et en particulier la disponibilite du marquage par transposon et de la transformation genetique. Pour cela Petunia est considere comme un excellent modele pour etudier l’ARNi (Napoli et al., 1990), le developpement, l’activite des transposons, l’auto-incompatibilite genetique et les interactions avec les microbes, les herbivores et les pollinisateurs (Bombarely et al., 2016). De plus, des travaux precurseurs sur les regulations epigenetiques s’appuyant sur les variations de couleur de la fleur ont ete conduits sur cette espece (Gerats et Vandenbussche, 2005). Le P. hybrida du commerce est issu de croisements entre P. axillaris pollinise par le papillon et des P. inflata pollinise par des abeilles (fig7) (Segatto et al., 2014). Les premiers hybrides ont ete produits par des horticulteurs europeens au debut du XIXe siecle. De ce fait, la grande diversite phenotypique actuelle des petunias de jardin est le resultat de deux siecles de culture commerciale intense et de croisements successifs des differentes accessions des deux parents. La figure 4 montre P. axillaris N et P. inflata S6, deux accessions de laboratoire representant les parents de P. hybrida (Bombarely et al., 2016).
Génomes parentaux : Les genomes parentaux ont ete sequences recemment (Bombarely et al., 2016). Pour P. axillaris, un assemblage de novo hybride a ete realise en utilisant une combinaison de technologies a lecture courte (Illumina; couverture 137X) et a lecture longue (PacBio; couverture 21X), tandis que pour P. inflata S6, seulement des lectures courtes ont ete utilisees (Illumina; Illumina; couverture 135X). Les sequences d’assemblage ont une taille de 1,26 Gb pour P. axillaris et de 1,29 Gb pour P. inflata (Tableau 1). La taille estimee des deux genomes est de 1,4 Go, en utilisant des k-mer de taille 31. Les statistiques d’assemblages des genomes montrent que pour P. axillaris, on a 83,639 scaffolds avec un L50 de 1236.73 kb (L50 est la taille du scaffold median) et pour P. inflata, on a 136,283 scaffolds avec un L50 de 884,43 Kb.
La fraction non assemblee estimee du genome comprend environ 140 Mo pour P. axillaris et environ 110 Mo pour P. inflata qui est sans doute due au grand nombre de sequences repetitives. L’annotation du genome a identifie 32 928 genes codant pour des proteines de P. axillaris et 36 697 genes codant pour des proteines de P. inflata avec une moyenne de 5,2 et 5,1 exons par gene codant pour une proteine et une taille de proteine predite moyenne de 393 et 386 acides amines, respectivement. Le genome de P.axillaris est moins fragmente que celui de P.inflata (tableau 1, Bombarely et al., 2016).. La figure montre que la proportion des genes dans le genome de P. axillaris est plus importante que dans ceux de N. tomentosiformis et de Solanum lycopersicum. Le genome de petunia contient plus de DNA transposon (5,2%) par rapport aux deux autres genomes avec une proportion de LRT retroelements proche de celle de N. tomentosiformis. Par ce qu’il s’agit d’une premiere annotation du genome de P. axillaris, on remarque une proportion non negligeable des ≪ others ≫ contenant des satellites est des elements inconnus (15,1%) (Bombarely et al., 2016)..
Origine des génomes de P. hybrida :
Les comparaisons des deux sequences du genome avec les donnees transcriptomiques de trois lignees non apparentees de P. hybrida, nommees Mitchell, R27 et R143 ont revele une histoire complexe du petunia de jardin. La plupart des genes analyses (environ 20 000) pourraient etre attribues a P. axillaris (environ 15 000) avec seulement 600 genes environ qui seraient attribues a P. inflata. Cela indique que le parent P. inflata n’apporte qu’une contribution mineure dans le genome de P. hybrida. La dominance du genome du parent sauvage pourrait etre le resultat de la selection des couleurs qui necessite un fond genetique avec des mutations recessives responsable de la pigmentation. Environ 2 000 genes de P. hybrida contiennent un pourcentage eleve de SNPs (single-nucleotide polymorphism) qui proviennent probablement d’un ancetre inconnu (Bombarely et al., 2016).
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Table des matières
Liste de vocabulaires
Liste des abréviations
Contrôle épigénétique de l’adaptation de pétunia au stress hydrique
1 . Introduction
1.1. Structure d’accueil
1.2. Bibliographie
1.2.1. Introduction
1.2.2. L’épigénétique et l’adaptation au stress
1.2.3. Le stress hydrique et la mémoire du stress
1.2.4. La méthylation de l’ADN et mémoire du stress
1.2.5. Séquençage bisulfite
1.2.6. Analyse de la méthylation différentielle:
1.2.7. Pétunia : un modèle biologique
1.3. Objectifs du stage
2. Matériel et Méthodes
2.1. Matériel Végétal
2.2. Séquençage bisulfite
2.3. Mapping des reads bisulfite sur le génome de référence
2.4. Annotation des gènes de stress hydrique
2.5. Recherche des régions différentiellement méthylées
2.5.1. L’approche a priori
3. Résultats
3.1. Résultats du BSMAP
3.2. Résultats de démarche a priori
3.3. Résultats de l’approche sans a priori
3.4. Résultats de l’approche gènes candidats
4. Discussion
L’approche sans a priori
Conclusions et perspectives
Références bibliographiques
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