Soutenance mémoire
Modèle de mammites à S. aureus
S. aureus est une coque Gram+. On le retrouve très majoritairement sur la peau et les muqueuses. La présence de lésions au niveau des trayons (plaies, gerçures, crevasses) ou au niveau de la mamelle (pyodermite d’échauffement par exemple) constituent des réservoirs important pour ce germe, de même la présence de crevasse dans les caoutchoucs des manchons de traites constituent des réservoirs bien identifiés. S. aureus est à l’origine de mammite subclinique dans la majorité des cas. Le germe pénètre de façon profonde dans le parenchyme mammaire et donne lieu à la formation d’abcès au sein du parenchyme. Il s’agit d’une bactérie à caractère mono ou oligoclonal.
Une à deux souches au maximum est responsable des infections à Staphylococcus aureus dans un troupeau. Il s’agit d’un modèle contagieux strict, les animaux sains se contaminent à partir d’animaux infectées particulièrement au moment de la traite(machine, trayeurs) ( Durel et al., 2004, Eicher et al., 2003).
La première étape de l’infection par S. aureus est la colonisation du canal du trayon avec la capacité du germe à se fixer aux cellules kératinisées. Une fois cette étape réalisée, la colonisation du parenchyme mammaire suit.
De nombreux facteurs de virulence propres à S. aureus ont été décrits. Trois facteurs majeurs expliquent en partie la pathogénie de S. aureus. Le premier est la présence de récepteurs à des composants cellulaires tels que les récepteurs à la fibronectine. La fibronectine est en particulier exprimée sur les cellules «Allongées» des parenchymes mammaires, expliquant la forte affinité de S. aureus pour ce Le deuxième facteur est la présence d’une capsule, ou plutôt pseudocapsule, qui ne présente pas totalement les caractéristiques habituellement observées chez les autres bactéries capsulées. Enfin la dernière grande classe de facteur de virulence est la production de coagulase e t de toxines aux propriétés hémolytiques, en particulier les toxines alpha et beta. Des é tudes sur les souris et les lapins ont pu montrer que l’inoculation de ces toxines en particulier la toxine alpha, serait responsable de formation de foyers de nécrose au sein du parenchyme mammaire. La production de ces toxines participerait à la formation d’une structure fibrineuse isolant les germes des défenses de l’organisme mais aussi des antibio tiques. Cette particularité de S. aureus expliquerait sa capacité à envahir le parenchyme mais aussi celle à persister au sein de la mamelle de façon chronique (Sultral et al., 1994).
Infection à réservoir mammaire principal
• Taux de prévalence plus 40%.
• CCT plus 350000 cellules/ml.
• Taux de guérison au tarissement moins 70%.
• Efficacité de traitement limitée des pénicillines (Durel et al., 2011).
Staphylococcus aureus réside dans la peau et l’épithélium muqueux des vaches laitières et d’autres mammifères, et se trouve couramment dans l’environnement (Roberson et al., 1994). S.aureus est un germe impliqué dans les mammites contagieuses, source est soit le quartier infecté soit les mains trayeur, le risque de transmission est pendant la traite et l’antibiothérapie (début de lactation, traitement long) (Durel et al., 2011).
Résistance au Antibiotiques
Résistance naturelle
La résistance naturelle d’une bactérie est une caractéristique propre à une espèce bactérienne, qu’est partagée par toutes les souches normales de cette espèce. Elle délimite le spectre naturel de l’antibiotique et constitue une aide à l’identification, elle se traduit habituellement par des CMI supérieures à la valeur critique basse de concentration de l’antibiotique concerné (Rebiahi, 2012).
Résistance acquise
La résistance acquise est une caractéristique de certaines souches au sein de l’espèce de Staphylococcus aureus. Cette résistance résulte d’une modification génétique par mutation ou par acquisition de matériel génétique étranger (Rebiahi, 2012).
Résistance à la meticilline
Une souche est dite (résistante à la méticilline) lorsqu’elle présente une résistance à la pénicilline du groupe M, et par extension à toutes les ß-lactamines. Elle se définit par une concentration minimale inhibitrice supérieure à 2 mg/l pour l’oxacilline, la pénicilline du groupe M de référence (Rebiahi, 2012). Les souches SARM sont le plus souvent résistantes à d’autre classe d’antibiotiques (CASFM, 2012), elles sont considérées comme des bactéries multirésistantes, et la résistance à la méticilline est depuis lors utilisée, comme marqueur de multirésistantes (Grohs, 2009).
Mécanisme à la résistance à la méticilline
Les mécanismes et les gènes de résistance des staphylocoques dorés et des staphylocoques à coagulase négative (SCN) sont les même. En revanche, la fréquence des résistances diffère : elle est plus élevée pour les SCN (Leclercq, 2002). La résistance à la méticilline chez les staphylocoques est principalement due à la présence du gène mec A présent dans une cassette SCC mec (Hiramatsu et al., 2002).
Mesure de conductivité du lait
Principe
La mesure de conductivité du lait a été développée dans le but de diagnostiquer les mammites cliniques et subcliniques. La conductivité du lait correspond à la capacité du lait à conduire un courant électrique. Elle est déterminée majoritairement par les ions Na+, K+ et Cl‐ . Lors d’infection la quantité de K+ augmente alors que celle de Na+ diminue. Elle est largement utilisée par les laboratoires pour mesurer les CCI du contrôle laitier (Allain, 2011).
Réalisation
La mesure de conductivité peut s’effectuer soit manuellement à l’aide d’un des nombreux appareils disponibles sur le marché, soit par des appareils de mesures intégrés dans la griffe de traite (Allain, 2011).
Interprétation
Deux types de lectures sont proposés (Ferrouillet et al., 2004). La première dite de « seuil absolu » préconise l’utilisation d’un seuil défini : lors du dépassement de ce seuil l’animal est considéré comme atteint d’une mammite. La seconde dite de « seuil relatif » préconise de comparer la conductivité des différents quartiers entre eux permettant ainsi de créer une valeur d’alerte lorsque l’animal est atteint d’une mammite. Cependant la conductivité est soumise à de nombreux facteurs de variations (Ferrouillet et al., 2004, Leroux et al., 2002 et Poutrel, 2002). L’intervalle de traite, le stade de lactation, la teneur en matière grasse du lait, l’effet race et enfin l’effet du cycle oestrien. Ces nombreux facteurs rendent difficile l’interprétation des valeurs de conductivité. Il semblerait que la méthode de lecture par valeur relative soit d’une meilleure efficacité. Les différents éléments évoqués font de cette méthode de diagnostic, une technique encore trop peu standardisée pour être utilisée isolément des autres techniques de détection des mammites.
Concentration cellulaire individuelle (CCI)
La concentration cellulaire individuelle se définit comme la concentration en cellule du lait issue du mélange du lait des quatre quartiers de la vache. La mise en place de cette mesure a fait appel à la création de seuil permettant l’interprétation de résultats. Dans la pratique le seuil des 300 000 cellules/mL et le seuil de 800 000 cellules/mL sont souvent retenus respectivement comme valeur « seuil basse » et valeur « seuil haute ». Ainsi une vache ayant un comptage cellulaire inférieur à 300000 cellules/mL sera considérée comme saine, unevache comprise entre 300000 cellules/mL et 8000000 cellules/mL sera considérée comme douteuse et enfin une vache avec un comptage supérieur à 800000 cellules comme infectée (Allain, 2011).
Cependant de nombreuses études ont pu montrer que le comptage cellulaire individuel était influencé par de nombreux paramètres comme le niveau d’infection de la mamelle, l e stade de lactation, le rang de lactation, de la production laitière mais aussi de la saison (Allain, 2011).
Comptage des cellules somatiques
Comptage des cellules somatiques à l’aide de la cellule de Thoma
Principe
On dépose entre hématimètre et lamelle, une goutte de lait, dilué au 1/10 avec le diluant de Lazarus, puis on compte dans le quadrillage toutes les cellules somatiques. Le nombre de cellule comptée dans les 16 carreaux que constitue la cellule de Thoma correspond au nombre de cellules par microlitre de lait. Puis, on ramène le résultat obtenu en cellules par millilitre de lait (Marchal, 1976).
Mode opératoire
On colle la lamelle sur la lame (en humectant les deux bords de la lame avec un chiffon humide) puis on pose une goutte entre lame et lamelle après avoir éliminé les 3 à 4 premières gouttes de mélange. La lame est observée après 10 minutes de repos sous le microscope (grossissement x10 ou x40). On compte toutes les cellules situées dans les 16 carreaux et les cellules situées sur les lignes, soient ceux qui sont sur la ligne de gauche et sur la ligne du haut et pas ceux qui sont sur la ligne de droite et sur la ligne du bas, soit l’inverse (Marchal, 1976).
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Table des matières
Remerciements
Abréviation
Résumé
Abstract
Introduction
I.1. Généralité sur le lait de vache
I.1. 1. Production laitière en Algérie et son évaluation.
I.1.2. Données sur le lait cru
I.1.2.A. Définition du lait cru :
I.1.2.B. Microbiologie du lait cru
I.1.2.C. Contrôle du lait cru.
I.1.2.C.1. Numérotation des caractères physiques du lait cru.
I.1.2.C.2. Contrôle de la stérilisation et la pasteurisation
I.1.2.C.3. Contrôle globale de la qualité bactériologique du lait
I.1.2.C.3.a. Epreuve au bleu de bromothymol
I.1.2.C.3.b. Dosage du Degré Dornic
I.1.2.C.3.c. Technique de mise en évidence d’une succession de la population microbienne dans le
lait (Larpent, 1997)
I.2. Généralité sur les mammites
I.2.1. Définition
I.2.2. Anatomie
I.2.3. Symptomatologie de la mammite
I.2.3.1. Données générales
I.2.3.2. Diagnostic
I.2.3.2.A. Clinique
Description des mammites
Mammites non caractéristiques
Mammite suraiguë
Mammite aiguë
Mammite chronique
Mammite subclinique
Mammites caractéristiques
Mammites (colibacillaires)
Mammites gangréneuses
Mammite sèches ou mammite « d’été »
Mammites à Nocardia
Mammites en élevage
Motif d’appel
L’analyse épidémiologique du cheptel.
Epidémiologique
I.2. 4. Etiologie des mammites
I.2.4.1. Bactérienne
I.2.4.1.A. Les germes major
A.1. Escherichia coli
A.2. Staphylococcus aureus
A.3. Streptococcus uberis :
I.2.4.1.B. Les germes mineurs
B.1. Staphylococcus à coagulase négative (SCN)
B.2. Les mycoplasmes
B.3. Arcanobacterium pyogenes
I.2.4.1.C. Les contaminants du lait
C.1. Virus
C.2. Levures et algues
Quand faut-ils s’inquiéter ?
Mammites cliniques nombreuse et/ou graves
Conséquences technico-économiques des mammites cliniques
Changement de la composition du lait causé par les mammites
Alimentation, troubles métaboliques et mammites
Traitement des mammites
I.3. Traitement des mammites clinique pendant la lactation
Traitements hors lactation :
I.4.. Incidence des mammites bovines
Incidence médicale
Incidence sanitaire
Incidence économique
Prévention des mammites
I.5. Généralité sur Staphylococcus aureus :
I.5.1. Historique et nomenclature
Taxonomie
I.5.2. Caractères bactériologiques
Facteur de virulence de Staphylococcus aureus
Pouvoir pathogène de Staphylococcus aureus
Modèle de mammites à S. aureus
I.5.3. Résistance au Antibiotiques
Résistance naturelle
Résistance acquise
Résistance à la meticilline
Mécanisme à la résistance à la méticilline
II. Matériel et méthodes
II.1. Présentation de l’élevage :
II.1.1. Zone d’étude (périmètres retenue dans l’étude) :
II.1.2. Données descriptives
Personnel
Traite
Méthodes
Période de l’étude
Les documents
Prélèvements
Les quartiers prélevés
Réalisation des prélèvements
Conservation des prélèvements
Analyse des échantillons
II.2. Test CMT (California Mastitis Test)
Méthode de prélèvement aseptique de lait de quartier (Fig. 10)
Méthode de référence des analyses: isolement et identification
CMT (California Mastitis Test) ou Test au Teepol
Quand réalise-t-on un CMT ?
Mesure de conductivité du lait
Concentration cellulaire individuelle (CCI)
II.3. Comptage des cellules somatiques
Comptage des cellules somatiques
Comptage cellulaire de Tank (CCT)
II.4. Analyse physicochimique
II.5. Analyses Bactériologie
Pré-identification des souches
Souches de Staphylococcus aureus
Isolement des souches Staphylococcus aureus
II.5.1. Identification des souches Staphylococcus aureus
L’identification a été basée sur les critères suivants
Test Pastorex (Test d’agglutination au latex)
II.5.2. Typage moléculaire des souches de Staphylococcus aureus
Première phase
Extraction de l’ADN bactérien
Amplification de l’ADN
Recherche du gène GyrA et gène de mecA
Recherche du gène pvl
Typage moléculaire du gène agr (accessory gene regulator)
Préparation du gel d’électrophorèse
Deuxième phase
II.5.3. Identification par MALDI-TOF
Extraction de l’ADN bactérien:
Méthodes de génotypage
II.5.4. PCR de typage du gène spa (Amplification du gène spa codant pour Staphylococcus aureus
protéine A)
Objectif
Extraction d’ADN
Révélation par électrophorèse
C. Purification
D. Séquençage de l’ADN bactérien:
E. Réaction de séquence
II.5.5. PCR de typage MLST (Multilocus Sequence Typing of Staphylococcus aureus) 71
II.5.6. Détection des facteurs de virulence chez Staphylococcus aureus par PCR en temps réel
II.5.7. Souches des entérobactéries
Isolement des entérobactéries
Pré-identification souches des entérobactéries
Identification des souches des entérobactéries
Antibiogrammes par diffusion des disques
II.5.8. Souches de Streptococcus sp
Isolement des souches de Streptococcus
Pré-Identification des souches de Streptococcus
Identification des souches de Streptococcus
III. Résultats
III.1. L’examen clinique
III.2. Le test CMT
III.3. Evolution du comptage cellules somatiques de tank
III.4. Les paramètres physico-chimiques
III.5. Résultats des analyses bactériologiques
III.6. Résultats de l’étiologie bactérienne des cas de mammites diagnostiqué
III.7. Résultats de l’identification des espèces de Staphylococcus. sp
III.8. Résultats de l’antibiogramme des souches de l’espèce S. aureus
III.9. Résultats du typage moléculaire de l’espèce S. aureus
Résultats de la première phase
Résultats de la deuxième phase
III.10. Identification par MALDI TOF des S. aureus
III.11. Typage spa
III.12. Typage MLST
III.13. Production de toxines
III.14. Résultats de l’identification des isolats bactériens impliqués dans les cas de mammite diagnostiqués
III.15. Résultats de l’antibiorésistance des bactéries Gram négative
III.16. Résultats de l’identification des espèces de Streptococcus. spp
Discussion
Conclusion
Références bibliographiques
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