Compréhension des mécanismes impliqués dans l’activité réductrice

BACILLUS CEREUS

Généralités Bacillus cereus est une bactérie pathogène à coloration de Gram positive, de métabolisme aéro-anaérobie facultatif et capable de produire des spores dans des conditions défavorables de croissance. C’est un micro-organisme mobile, en forme de bâtonnet de grande taille (>1.0 µm), parfois en chaînette et aux colonies à l’aspect cireux et opaque sur milieux gélosés. C’est également une bactérie ubiquitaire retrouvée, principalement sous forme de spores, dans un grand nombre d’environnements tels que le sol (Stenfors Arnesen et al., 2008), la surface des végétaux (Kouamé et al., 2013) ou encore l’air ambiant (Lues et al., 2007). B. cereus fut isolé pour la première fois en 1887 par Frankland, G.C. et Frankland, P.F. dans l’air d’une étable au Royaume-Uni. La souche alors isolée appelée ATCC14579 est considérée comme une des souches types du groupe B. cereus et est utilisée comme souche modèle par de nombreux laboratoires. Le caractère pathogène de cette bactérie fut décrit pour la première fois en 1937 après la mort de cochons d’Inde auxquels des suspensions de B. cereus avaient été injectées (Clark, 1937) . C’est en 1950 qu’une étude mit en lien une Toxi Infection Alimentaire Collective (TIAC) et la présence de B. cereus dans une crème à la vanille (Hauge, 1950). Les toxines responsables des symptômes diarrhéiques et émétiques des infections à B. cereus furent respectivement décrites pour la première fois en 1990 et 1995 (Beecher and MacMillan, 1990, Agata et al., 1995). En 2012, un rapport de l’Institut National de Veille Sanitaire (InVS) indique que B. cereus est la deuxième cause de TIAC en France juste derrière Staphylococcus aureus et devant le genre Salmonella (InVS, 2012). Néanmoins, l’incidence réelle de B. cereus en tant que pathogène alimentaire reste difficile à évaluer pour plusieurs raisons. Premièrement les toxi-infections à B. cereus ne sont pas à déclaration obligatoire et sont donc probablement sous estimées dans les décomptes officiels. Deuxièmement la courte durée et la bénignité des symptômes des infections à B. cereus encouragent rarement le malade à consulter un médecin. Enfin les symptômes des infections à B. cereus sont régulièrement associés à tort à des toxi-infections à S. aureus ou à Clostridium perfringens. B. cereus, aussi dénommé B. cereus sensu stricto, fait partie du groupe B. cereus sensu lato. Ce groupe comprend 7 espèces génétiquement proches et différenciées principalement par des caractères phénotypiques tels que des différences physiologiques, morphologiques ou de virulence. Ces 7 espèces sont :
-Bacillus anthracis, non hémolytique et responsable de la maladie du charbon.
-Bacillus thuringiensis, caractérisés par la production d’un cristal parasporal létal pour les insectes.
-Bacillus mycoïdes et Bacillus pseudomycoïdes capables de former des rhizoïdes sur milieux gélosés.
-Bacillus weihenstephanensis, une espèce psychrotolérante capable de croitre à des températures minimales comprises entre 4 et 7°C.
-Bacillus cytotoxicus, une nouvelle espèce récemment décrite (Guinebretiere et al., 2012).
-Bacillus cereus sensu stricto, hémolytique.
Désormais dans la suite de ce manuscrit, l’apellation B. cereus se rapportera toujours à B. cereus sensu stricto. Dans le cas contraire, le nom B. cereus sensu lato sera indiquée. Récemment, des études phylogénétiques basées sur la gamme de température de croissance des différentes souches et espèces du groupe B. cereus sensu lato ont mis en évidence l’existence de sept sous-groupes caractérisés par différentes thermotypes (Guinebretière et al., 2008). Les différents groupes sont présentés dans le Tableau 1. Les groupes I, II, IV et V rassemblent des souches dont les gammes de températures de croissance sont respectivement comprises entre 10 et 43°C, 7 et 40°C, 10 et 45°C et 8 et 40°C. Ces groupes sont intermédiaires. Le groupe VI est plus psychrotrophe avec une gamme de température de croissance comprise entre 7 et 37°C. Les groupes III et VII sont les plus thermophiles avec des gammes de température de croissance comprise respectivement entre 15 et 45°C et 20 et 50°C. Différentes espèces du groupe B. cereus sensu lato peuvent être retrouvées dans plusieurs groupes phylogénétiques. Ainsi B. weihenstephanensis et B. mycoides correspondent au groupe VI. B. pseudomycoides est retrouvé dans le groupe I. B. anthracis se retrouve uniquement dans le groupe III tandis que B. cytotoxicus correspond au groupe VII. B. cereus sensu stricto se retrouve à la fois dans les groupes II, III, IV et V tandis que B. thuringiensis est observé dans les groupes II, III, IV, V et VI. Dernièrement il a été constaté que la séquence du gène de ménage  panC permet d’affecter précisément une souche de B. cereus sensu lato à son groupe phylogénétique (Guinebretiere et al., 2010).

Les toxines diarrhéiques

   L’hémolysine BL (Hbl) est la première des trois entérotoxines décrite chez B. cereus. C’est une protéine composée de trois sous unités (composants lytiques L2 et L1 ainsi que la protéine de liaison B) et capable de former des pores transmembranaires dans des cellules d’épithélium intestinal de lapin (Beecher and MacMillan, 1990). L’entérotoxine non hémolytique (Nhe) se présente sous la forme d’un complexe protéique comprenant les protéines NheA, NheB et NheC. Ce complexe protéique est capable de former des pores dans la membrane plasmique des cellules épithéliales, ce qui entraine une perturbation de l’intégrité des membranes et donc une lyse cellulaire (Fagerlund et al., 2008). Des similarités entre les composants de Nhe et Hbl suggèrent une origine commune entre les gènes hbl et nhe.La cytotoxine K (CytK) est une protéine à structure en tonneau β de 34 kDa également capable de former des pores dans les membranes des cellules épithéliales. Cette protéine est nécrotique, hémolytique et cytotoxique pour l’épithélium intestinal (Hardy et al., 2001).

Le stress acide

   B. cereus est confronté à de nombreux environnements à pH acide que ce soit dans les aliments comme les tomates (pH 4.1) (Beuchat and Mann, 2008) ou encore les jus de pomme (pH 4) (Ryu and Beuchat, 1998), dans certains sols (pH proche de 4) (Neumann and Martinoia, 2002, Rousk et al., 2009) ou dans l’estomac de son hôte. La croissance de B. cereus est rapidement affectée par les pH acides. La limite basse de pH pour laquelle une croissance de B. cereus peut être observée est de 4.3 bien que cette valeur soit variable selon la souche bactérienne considérée (Kramer and Gilbert, 1989). Les effets observés après exposition de cellules de B. cereus à des pH acides comprennent une diminution du taux de croissance et de la biomasse finale des cultures ainsi qu’une augmentation du temps de latence (Biesta-Peters et al., 2011). Ces effets varient selon la souche utilisée, la molécule acidifiante utilisée ainsi que le taux de croissance initial. Dans ce dernier cas, il a été observé que des cellules végétatives de B. cereus cultivées en chemostat à pH 5.5 étaient plus sensibles à des chocs acides de 20 minutes à pH 4 pour des taux de croissance de l’ordre 0,4 à 0,6 h-1 comparé à un taux de croissance de 0,1 h-1 (Thomassin et al., 2006). Les effets du pH acide sur la cellule bactérienne sont multiples. Le stress acide survient quand les acides organiques faibles, présents dans le milieu environnant, sous forme non dissociée et non chargée traversent la membrane plasmique bactérienne par diffusion simple (Cotter and Hill, 2003). Du fait du pH, théoriquement plus alcalin du cytoplasme cellulaire, ces acides organiques vont se dissocier en anions et protons H+. Ces nouvelles molécules sont chargées et ne peuvent désormais plus retraverser la membrane plasmique par diffusion simple. L’excès de proton H+ engendré va entrainer une acidification continue du cytoplasme bactérien déclenchant ainsi un stress acide (Mols and Abee, 2011a). Les acides forts ne peuvent pas traverser la membrane plasmique par diffusion. Néanmoins en diminuant le pH externe, ils augmentent le ΔpH (différence entre le pH externe et le pH interne). Cette augmentation de ΔpH conduit à une augmentation de l’entrée de protons H+ dans le cytoplasme et donc à son acidification (Beales, 2004). La diminution du pH cytoplasmique est préjudiciable à l’intégralité des activités cellulaires et les conséquences de ce stress sont multiples : altération des fonctions des enzymes glycolytiques, perturbations de la chaîne de transport des électrons et production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), déclenchement de stress oxydants secondaires… Toutes les macromolécules sont affectées par le stress acide (i) les protéines cytoplasmiques peuvent être dénaturées, (ii) les acides nucléiques peuvent être dégradés suite à la rupture des liaisons osidiques reliant le ribose ou le désoxyribose à la base azotée (iii) la structure des membranes bactérienne est altérée (Audia et al., 2001, Cotter and Hill, 2003, Mols and Abee, 2011b, Mols and Abee, 2011a, Quivey et al., 2001).

Systèmes de réparation de l’ADN

   Suite à un stress acide, l’ADN subit des pertes de bases puriques et pyrimidiques par rupture de la liaison glycosidique. Il a été démontré que le système UvrA-UvrB est impliqué dans la réparation des dommages causés à l’ADN suite à différents stress (Lage et al., 2003). Le complexe UvrA-UvrB détecte les modifications de conformation ou de structure de l’ADN endommagé et se fixe sur la région à réparer. Cette fixation entraine la dissociation d’UvrA qui est remplacé par la protéine UvrC. Cette dernière protéine va exciser la région de l’ADN endommagé avant d’être évacuée par UvrD. La région supprimée par UvrC est alors resyntétisée par une ADN polymérase sous sa forme non endommagée (Hanna et al., 2001). Chez Methylobacterium dichloromethanicum la mutation d’uvrA augmente la sensibilité aux pH acides (Kayser et al., 2002). De la même manière, le gène recA, codant pour une protéine impliquée dans la recombinaison homologue semble également être impliqué dans la réponse au stress acide chez H. pylori (Thompson and Blaser, 1995). Chez B. cereus il a été démontré que le système UvrA-UvrB ainsi que la protéine RecA étaient surexprimés après exposition des cellules à de l’acide peracétique (Mols et al., 2010a). Ces résultats suggèrent l’implication de ces systèmes dans la résistance au stress acide de B. cereus.

Homéostasie du pH interne

   Le pH interne est un facteur physico-chimique primordial de la cellule bactérienne qui va impacter un nombre important d’activités cellulaires. En conséquence, le pH interne d’une cellule est finement régulé. Selon les microorganismes, la valeur physiologique du pH interne est différente. Les bactéries acidophiles ont un pH interne compris entre 6,5 et 7, les bactéries neutrophiles entre 7,5 et 8 et les bactéries alcalophiles entre 8,4 et 9 (Booth, 1985). Lors du passage de la bactérie dans un milieu acide le ΔpH existant entre le pH externe et le pH interne va générer un gradient de pH favorisant l’entrée de protons H+ dans le cytoplasme par diffusion passive. Ces protons vont diminuer le pH intracellulaire. Selon le microorganisme considéré une baisse plus ou moins forte du pH interne peut être tolérée de façon à diminuer le gradient de pH existant tout en restant compatible avec la poursuite des activités cellulaires.Par exemple, chez Steptococcus bovis le pH interne passe de 7,8 à 5,6 selon le pH de son milieu de culture (Russell, 1991). Cette observation est similaire pour Lactococcus lactis où le pH interne peut varier de 7,24 à 5,19. A l’inverse le pH interne de Listeria innocua reste toujours proche de 7 quelque soit le pH externe (Siegumfeldt et al., 2000). Dans le cas de B. cereus le pH interne est égal à 7,1 quand la bactérie est cultivé à pH 7 et diminue jusqu’à une valeur de 6,2 quand les cellules sont cultivées à pH 5,5 (Senouci-Rezkallah et al., 2011). Toute diminution du pH interne au delà de ces valeurs minimales pourrait être préjudiciable aux activités cellulaires de la cellule bactérienne. Une régulation efficace et précise de la concentration des protons H+ intracellulaire est donc nécessaire. Ces régulations sont médiées par des protéines membranaires comme les F1F0 ATP synthases ainsi que par des systèmes de transport membranaire spécifiques de la décarboxylation de certains acides aminés.

Arginine déïminases

   Les systèmes type arginine déïminases (ADI) sont des protéines qui convertissent l’arginine en citrulline. La citrulline est ensuite métabolisée en ornithine qui va être rejetée en dehors de la cellule via un antiport arginine/ornithine. Ces réactions génèrent en parallèle du CO2, de l’ATP et deux molécules d’ammoniac (NH3) (FIGURE 10). Le NH3 produit est une molécule qui va contrer les effets acidifiants des protons présents dans la cellule en les consommant pour former des ions ammonium (NH4+) ce qui va conduire à l’alcalinisation du cytoplasme. De plus, l’ATP formé au cours de la réaction pourra être utilisée par les F1F0 ATPases pour expulser des protons en dehors du cytoplasme (voir section I.II.3), comme cela a été démontré chez L. monocytogenes (van de Guchte et al., 2002). Les systèmes de types arginine déïminase sont retrouvés chez de nombreux microorganismes comme les bactéries lactiques, les espèces du genre Bacillus, ou encore celles du genre Pseudomonas (Ding et al., 2012, Lu,2006). Ces systèmes se composent de trois enzymes : l’arginine déïminase, l’ornithine transcarbamylase, et la carbamate kinase, codés respectivement par les gènes arcA, arcB et arcC. Le rôle du système ADI dans la résistance au stress acide des bactéries a été mis en évidence chez L. monocytogenes et Streptococcus sanguis par des mesures d’activité enzymatique à des pH de plus en plus faible, allant jusqu’à 3.5, et qui montraient une augmentation de l’activité des trois enzymes du système ADI à mesure que le pH diminuait. Ces résultats ont été confortés par l’obtention de mutants de ce système qui étaient plus sensibles au stress acide que les bactéries sauvages (Curran et al., 1995, Ryan et al., 2009). Chez B. cereus, il a été démontré que le gène arcA, codant pour l’arginine déïminase, était surexprimé après exposition des cellules à des chocs acides non létaux (pH 5,4) ainsi que chez des cellules cultivées à pH 5,5 par rapport à celles cultivées à pH 7 (Mols et al., 2010b, Senouci-Rezkallah et al., 2011). Ces données suggèrent que les systèmes ADI sont impliqués dans la survie de B. cereus au stress acide.

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Table des matières

CONTEXTE DE L’ETUDE ET OBJECTIFS
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1 : BACILLUS CEREUS
1.1: Généralités
1.2: Phylogénie du groupe Bacillus cereus sensu lato
1.3: Cycle de vie
1.4: Présence dans l’aliment
1.5: Pouvoir pathogène
1.6: Toxines de B. cereus
1.6.a: La toxine émétique
1.6.b: Les toxines diarrhéiques
1.7: Adaptations de B. cereus au tube digestif humain
2: ADAPTATIONS AU PH ACIDE
2.1: Le stress acide
2.2: La réponse générale aux stress
2.2.a: Les facteurs σ
2.2.b: La régulation de σB
2.2.c: Le régulon σB
2.3: Systèmes de réparations
2.3.a: Systèmes de réparation de l’ADN
2.3.b: Protéines chaperonnes et protéolyse
2.4: Homéostasie du pH interne
2.4.a: Les F1F0 ATP synthases
2.4.b: Autres transporteurs
2.4.c: Systèmes de décarboxylations
2.5: Production de molécules alcalines
2.5.a: Arginine déïminases
2.5.b: Agmatine déïminase
2.5.c: Uréases
2.6: Modifications membranaires
2.7: Adaptations métaboliques
2.7.a: Respiration aérobie
2.7.b: Respiration anaérobie
2.7.c: Fermentation des acides mixtes
2.7.d: Métabolisme et stress acide
2.8: La fermentation butanediolique
2.8.a : Généralités
2.8.b: Origine des différents isomères du 2,3 BD
2. 9 La réponse de tolérance à l’acide (ATR)
3 ADAPTATIONS AUX VARIATIONS DE POTENTIEL D’OXYDO-REDUCTION (EH)
3.1 Le potentiel d’oxydo-réduction
3.2 Exemples de Eh dans quelques aliments et environnements
3.3 Variations de Eh dans les milieux biologiques
3.4 Adaptations des bactéries aux variations de Eh
3.5 l’activité réductrice des bactéries
3.6 Les groupements thiols
3.7 Les domaines thiorédoxines
3.8. Les Thiols disulfide oxydo-réductases (TDORs) chez les bactéries à coloration de Gram positive
3.8.a Le système BdbD / BdbC
3.8.b ResA
3.8.c CcdA
3.8.d Schéma récapitulatif
MATERIELS ET METHODES
1 Souches et milieux de culture utilisées
2 Précultures
3 Croissance en batch régulés et non régulés
4 Mesure du Eh
5 Chocs acides et thermiques
6 Détermination de la concentration en métabolites
7 Calcul de l’activité enzymatique de l’acétoïne réductase
8 Dosage des thiols exofaciaux
9 Filtration et expériences utilisant les bloquants des thiols
10 Marquage fluorescent des thiols exofaciaux à la surface des cellules bactériennes
11 Extraction des protéines membranaires
12 Analyse par spectrométrie de masse
13 analyses In silico
14 Obtention de spores en culture bi-phasiques
15 Cytométrie en flux
RESULTATS
CHAPITRE 1 : INFLUENCE DU EH ET DU PH SUR L’ACTIVITE REDUCTRICE, LE METABOLISME DU GLUCOSE ET L’ATR DE BACILLUS CEREUS
1 Objectif de l’étude
2 Stratégie d’étude
3 Reducing activity, glucose metabolism and acid tolerance response of Bacillus cereus grown at various pH and oxydo-reduction potential levels
4 Présentation synthétique des résultats et conclusions de l’étude 
5 Fermentation butanediolique et stéréoisomères de 2,3 BD produits en milieux chimiquements définis
5. 1 Dosage du 2,3 BD produit en milieu synthétique AOAC par B. cereus ATCC14579
5.2 Stéréo-isomérie du 2,3 BD produit par B. cereus
5.3 Dosage de l’activité acétoïne réductase
CHAPITRE 2 : IMPLICATIONS DES THIOLS EXOFACIAUX DANS L’ACTIVITE REDUCTRICE DE B. CEREUS
1 Objectif de l’étude
2 Implication of exofacials thiols groups in the reducing activity of Bacillus cereus
3 Conclusion principales et discussion de l’étude
CHAPITRE 3 : SEPARATION DES SPORES GERMEES ET NON GERMEES DE B. CEREUS PAR CYTOMETRIE EN FLUX
1 Introduction à l’article
2 A non destructive method to separate germinated and non germinated spores of Bacillus cereus using flow cytometry
3 Principaux résultats de l’étude
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES
1 Discussion générale et perspectives
1. 1 Impact du Eh sur l’ATR et sur l’adaptation croisée et les paramètres de croissance de B. cereus
1. 2 Adaptations métaboliques de B. cereus à pH 5.5
1. 3 Régulation de la voie du 2,3 BD
1.4 Rôles supposés de la voie du 2,3 BD
1.4.a Rôle dans l’homéostasie du pH
1.4.b Rôle dans l’homéostasie du Eh
1.4.c Rôle dans le stockage d’énergie
1.4.d Rôle dans les interactions Plante/Microorganismes du sol
1.5 Implication des thiols exofaciaux dans l’activité réductrice de B. cereus
1.6 Les protéines impliquées dans l’activité réductrice de B.cereus
1.7 Détection des thiols exofaciaux à la surface des spores de B. cereus
RÉFÉRENCES

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