COMMUNICATION AFFICHEE ET PUBLICATION

COMMUNICATION AFFICHEE ET PUBLICATION

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RESUME
SUMMARY
LISTE DES ABBREVIATIONS
I. INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
A. Brucella et Brucellose
1. Introduction
2. Données épidémiologiques
a) Situation mondiale
b) Situation en méditerranée
c) Situation en France
3. Pathogénie et aspects cliniques
4. Le genre Brucella
a) Les alpha-proteobacteries
b) Description du genre Brucella
c) Taxonomie et hôte
d) Le génome
e) Antigènes
B. Relation entre Brucella et Ochrobactrum
1. Présentation du genre Ochrobactrum.
a) Description
b) Taxonomie
c) Manifestations cliniques
2. Relation entre Brucella et Ochrobactrum
C. Diagnostic des Brucelloses animales
1. Généralités
2. Diagnostic bactériologique
3. Diagnostic sérologique de Brucella
4. Diagnostic moléculaire
D. Gènes et protéines d’intérêt de l’étude
1. Gène bcsp31
2. Séquence d’insertion IS711 et séquence répétées BRU-RS1, BRU-RS2
3. Protéines membranaires : Omp10, Omp16 et Omp19
4. Protéine périplasmique : BP26
5. Gène pérosamine synthétase (per)
E. But de l’étude
II. RESULTATS
A. Résultats de la 1ère partie : Développement d’un outil de diagnostic du genre Brucella basé sur la PCR temps réel
1. Détection des Brucella par la technique de PCR conventionnelle et en temps réel
a) Choix des cibles
b) Etude d’exclusivité
c) Etude d’inclusivité
d) Limite de détectabilité
e) Répétabilité et reproductibilité
2. Choix et validation de la PCR en temps réel sur des échantillons biologiques
a) Etude préliminaire : échantillons de rates de sangliers et d’animaux expérimentalement infectés
b) Echantillons biologiques d’animaux négatifs
c) Echantillons biologiques d’animaux positifs
d) Analyse de la sensibilité et de la spécificité diagnostique
e) Détermination du seuil de positivité en PCR temps réel
B. Résultats de la 2ème partie : Etude phylogénétique entre le genre Brucella et le genre Ochrobactrum
1. Recherche de la séquence répétée BRU-RS et de la séquence d’insertion IS711 chez Ochrobactrum
2. Détection de séquences homologues à celles des gènes omp10, omp16, omp19 et bp26 de Brucella spp. dans un panel d’espèces d’Ochrobactrum
3. Recherche d’épitopes communs sur un panel d’espèces Ochrobactrum par utilisa-tion d’anticorps spécifiques dirigés contre Omp10, Omp16, Omp19 et BP26 de Brucella spp
III. DISCUSSION
IV. CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
V. MATERIELS ET METHODES
A. Matériel biologique utilisé
1. Souches Brucella
2. Souches Ochrobactrum
3. Bactéries ayant un lien avec Brucella
4. Autres bactéries
5. Echantillons biologiques
B. Techniques bactériologiques
1. Souches Brucella
2. Souches Ochrobactrum
3. Autres bactéries
4. Echantillons biologiques
C. Préparation de l’ADN
D. Amorces et sondes
E. Technique de PCR conventionnelle simple et double amplification
F. Technique PCR en temps réel
1. Technique PCR en temps réel
2. Répétabilité et reproductibilité
G. Sensibilité et spécificité analytique
H. Choix du seuil de détection en PCR temps réel
1. Estimation de la sensibilité et de la spécificité diagnostique
2. Courbe ROC
3. Indice de Youden
4. Comparaison de la moyenne des différence : “le test de t apparié”
5. Comparaison de 2 moyennes observées
6. Comparaison de pourcentages de réponses positives de 2 séries appariées
I. Technique du Southern Blot
J. ELISA
1. Inactivation des bactéries
2. Choix des anticorps
3. Technique ELISA
VI. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
VII. COMMUNICATION AFFICHEE ET PUBLICATION
VIII. ARTICLE
IV. ANNEXE
Annexe 1 : Espèces et biovars de Brucella utilisés dans l’étude
Annexe 2 : Souches Ochrobactrum utilisées dans l’étude
Annexe 3 : Micro-organismes non-Brucella utilisés pour l’étude de spécificité
Annexe 4 : Préparation de milieux de culture
Annexe 5 : Préparation d’ADN génomique par la méthode phénol-chloroforme
Annexe 6 : Protocole d’extraction : kit Macherey Nagel (Genomic DNA from tissue)
Annexe 7 : Protocole d’extraction : kit Roche (High Pure PCR Template Preparation)
Annexe 8 : Protocole d’extraction : kit BioRad (InstaGene Matrix)
Annexe 9 : Protocole d’extraction : kit manuel Qiagen (DNeasy Blood & Tissue)
Annexe 10 : Protocole d’extraction : kit robot Qiagen (MagAttract® DNA Mini M48, BioRobot® M48 workstation)

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