Colonisation digestive par entérobactéries productrices de carbapénémase dans un modèle murin

Le microbiote digestif est un ensemble complexe de micro-organismes. A l’état de base, il confère une résistance à la colonisation par des bactéries entéro-pathogènes (1) ou multi-résistantes aux antibiotiques (2). L’administration d’antibiotiques modifie la composition du microbiote intestinal, et représente un facteur de risque de colonisation par des bactéries résistantes aux antibiotiques, telles que les Entérobactéries Productrices de Carbapénémase (EPC). La prescription de beta lactamines présentant une forte activité anti-anaérobie est un facteur de risque de colonisation par EPC (3). Il existe une résilience du microbiote après antibiothérapie, avec une tendance vers un retour à l’état de base (4). Le délai entre l’administration d’antibiotique et l’exposition à l’EPC semble donc être un facteur important pour expliquer la survenue d’une colonisation. Cependant, ce délai est difficile à étudier précisément dans les études épidémiologiques chez l’Homme, la date d’exposition à l’EPC étant habituellement imprécise.

Le microbiote joue également un rôle dans la réponse immunitaire : localement en supportant l’immunité muqueuse, mais aussi à distance en modulant l’immunité systémique (5). Le microbiote digestif semble jouer un rôle dans la réponse de l’hôte suite à une pneumopathie. Une antibiothérapie préalable aggravait la pneumopathie à Streptococcus pneumoniae, mais une transplantation de microbiote fécal améliorait le pronostic (6). Par ailleurs, la présence de certains taxons bactériens comme les SFB (Segmented Filamentous Bacteria) au niveau digestif a été associée à un bon pronostic chez des souris ayant subi une instillation intra-nasale de Staphylococcus aureus (7). Les objectifs de ce travail de thèse étaient de : (i) mettre au point un modèle murin de colonisation digestive par EPC, (ii) déterminer l’existence d’une fenêtre de susceptibilité à la colonisation par EPC encadrant l’administration d’antibiotiques, (iii) évaluer la réponse de l’hôte suite à une infection pulmonaire par Pseudomonas aeruginosa en cas de colonisation digestive par EPC.

Revue de la littérature

Microbiote digestif

Fonction et diversité 

Chez l’homme
Le microbiote digestif humain est composé de bactéries, champignons et virus. Le développement de techniques de métagénomique ciblées sur l’ADNr 16S a permis de mieux décrire le microbiote bactérien humain. En effet, un grand nombre d’espèces sont non cultivables ou difficilement cultivables.

La composition du microbiote varie le long du tube digestif. Dans l’estomac, la concentration en bactéries est très faible, de l’ordre de 103 UFC/mL de liquide gastrique, pour un volume de 250 mL (8). En effet, l’acidité gastrique (pH = 1,5) inhibe la croissance de la plupart des espèces bactériennes. Cependant, certaines bactéries peuvent résister dans un milieu acide, comme Helicobacter pylori qui est responsable de gastrites chroniques. La plupart des autres bactéries mises en évidence par des techniques de séquençage nouvelle génération appartiennent à la sphère oropharyngée : Bacteroidetes (Porphyromonas, Prevotella), Firmicutes(Streptococcus), et Fusobacteria (Fusobacterium) (9). Le temps de transit dans l’estomac d’un système de traceur magnétique chez des sujets sains a été estimé à 1 heure (10).

Le microbiote digestif varie en fonction de l’âge. Des modifications majeures se produisent durant les premiers mois de vie, puis la composition du microbiote digestif tend à se stabiliser. Dans l’étude TEDDY, des prélèvements de selles de 903 enfants étaient réalisés entre 3 mois et 46 mois d’âge (15). L’alpha-diversité (une mesure du nombre d’espèces différentes co-existant dans un milieu donné) augmentait rapidement entre 3 mois et 20 mois. Durant les 20 premiers de mois de vie les phyla Actinobacteria et Proteobacteria diminuaient progressivement, ce qui était compensé par une augmentation des Firmicutes. Le facteur principal modifiant le microbiote était l’allaitement, associé à une augmentation des espèces de Bifidobacterium. Le mode d’accouchement intervenait également, avec plus de Bacteroides chez les enfants nés par voie basse par rapport à la césarienne. Les facteurs environnementaux (présence de frères et sœurs, présence d’animaux à domicile) intervenaient dans l’accélération de la maturation du microbiote.

Une autre étude ayant analysé tous les mois le microbiote de 17 enfants nés à terme confirmait les résultats précédents (16). En effet, les Enterobacteriaceae (appartenant aux Proteobacteria) diminuaient rapidement dans les premiers mois de vie, alors que l’abondance relative des Lachnospiraceae et des Ruminococcaceae (appartenant aux Firmicutes) s’élevait (Figure 2).

Les bactéries représentent 99 % du microbiote digestif, mais on peut également noter la présence d’Archaea (0,8 % du microbiote) et de champignons (0,1 %) (12). Les Archaea sont des organismes unicellulaires. La plupart des espèces d’Archaea identifiées chez l’homme sont méthanogènes, comme Methanobrevibacter smithii. La prévalence de M. smithii dans la population est de 75 % (17), mais le rôle potentiel des Archaea en pathologie humaine est peu étudié. Les Archaea méthanogènes utilisent du dihydrogène (H2) pour réduire le dioxyde de carbone (CO2) en méthane (CH4), ce qui diminue la pression partielle gazeuse dans le côlon en consommant 4 moles de H2 et 1 mole de CO2 pour produire 1 mole de CH4 (18). Les Archaea méthanogènes sont dépendantes des espèces bactériennes productrices de H2, telles que les Ruminococcus et les Desulfovibrio. La physiologie des gaz présents le long du tube digestif est détaillée dans la Figure 3. Auparavant, les techniques permettant l’étude de la production de gaz le long du tube digestif étaient invasives, mais actuellement des capsules pouvant être ingérées et dotées de capteurs ont été développées (19).

Les champignons ne représentent que 0,1 % du microbiote digestif, mais à la suite d’une antibiothérapie ce pourcentage peut être multiplié par 40 (20). Les principaux genres détectés sont Saccharomyces et Candida. La présence de levures est corrélée positivement avec la présence d’Archaea du genre Methanobrevibacter (21), probablement en lien avec les régimes alimentaires riches en carbohydrates. Des liens entre champignons et développement de maladie de Crohn, ou d’un syndrome du côlon irritable ont été évoqués (20). De plus, bactéries et champignons interagissent de multiples façons au niveau digestif, notamment en favorisant l’adhésion ou la formation de biofilm (22) .

Il existe également un virome digestif : la concentration en particules pseudo-virales est de 10⁹/g de selles. La plupart d’entre elles correspondent à des bactériophages, des virus capables de moduler la composition en bactéries du tube digestif en les infectant. La composition du virome digestif est liée à l’alimentation et à des facteurs  environnementaux (23). Il existe un équilibre entre composition en bactéries et composition en bactériophages.

Le microbiote intestinal porte des fonctions métaboliques. Une des fonctions principales du microbiote digestif chez l’homme est d’utiliser les polysaccharides qui n’ont pas pu être digérés par les enzymes de l’hôte (amidon résistant, β-glucanes, pectines, cellulose, inuline). Les Bacteroidetes font partie des bactéries capables de dégrader des carbohydrates non digestibles. Par exemple, 18 % du génome de Bacteroides thetaiotaomicron est dévolu à la métabolisation des polysaccharides (24). Parmi les Firmicutes, les Ruminococcaceae et les Lachnospiraceae sont également capables de jouer un rôle dans la dégradation des polysaccharides complexes (25). De plus, la majeure partie des espèces produisant du butyrate, un acide gras à chaîne courte, font partie de ces deux familles de Firmicutes. D’autres acides gras à chaîne courte comme l’acétate, ou le propionate sont produits par des bactéries au niveau du côlon à partir d’une alimentation riche en fibre. Quatre-vingt quinze pour cent (95 %) des acides gras à chaîne courte produits sont rapidement absorbés (26), et oxydés pour produire de l’énergie. En effet, 70 % de l’énergie nécessaire aux colonocytes provient du butyrate (26). Les principales bactéries capables de produire du butyrate, soit à partir du glucose soit à partir du lactate, sont les genres Eubacterium, Anaerostipes, et Faecalibacterium (27).

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Table des matières

1. Introduction
2. Revue de la littérature
2.1. Microbiote digestif
2.1.1. Fonction et diversité
2.1.2. Techniques d’étude du microbiote
2.1.3. Effet d’une antibiothérapie
2.1.4. Résilience du microbiote
2.2. Acteurs de la réponse immunitaire
2.2.1. Cellules épithéliales
2.2.2. Cellules de l’immunité innée
2.2.3. Lymphocytes B
2.2.4. Lymphocytes T
2.2.5. Métabolites digestifs
2.2.6. Ligands bactériens
2.3. Axe Intestin Poumon
2.3.1. Interactions entre intestin et poumons
2.3.2. Infection pulmonaire et microbiote digestif
2.3.3. Microbiote pulmonaire
2.4. Colonisation digestive par des bactéries résistantes aux antibiotiques
2.4.1. Entérobactéries Productrices de Carbapénémase (EPC)
2.4.2. Modèles animaux de colonisation
2.4.3. Colonisation par des bactéries multi-résistantes chez l’Homme
2.5. Stratégies de restauration du microbiote digestif
2.5.1. Probiotiques
2.5.2. Transplantation de Microbiote Fécal (FMT)
2.5.3. Transplantation de filtrats stériles de microbiote fécal
2.6. Objectifs de la thèse
3. Matériel et Méthodes
3.1. Souches bactériennes et animaux
3.1.1. Souches bactériennes
3.1.2. Modèle murin
3.2. Procédures
3.2.1. Colonisation digestive
3.2.2. Infection pulmonaire et sacrifice
3.2.3. Colite au DSS
3.3. Méthodes d’analyse
3.3.1. Bactériologie
3.3.2. Perméabilité pulmonaire
3.3.3. Cytométrie en flux
3.3.4. Métagénomique ciblée sur l’ADNr 16S
3.3.5. Mise au point d’une qPCR Muribaculaceae
3.3.6. Métabolomique
3.3.7. Métabolites du tryptophane
3.3.8. Inférence fonctionnelle à partir de métagénomique ciblée
3.3.9. Analyse statistique
4. Résultats
4.1. Caractérisation des souches cliniques d’EPC utilisées
4.1.1. Souche KPL0.1
4.1.2. Souche KPL0.2
4.2. Modèle murin de colonisation à EPC
4.2.1. Résistance à la colonisation par EPC liée au microbiote digestif
4.2.2. Localisation de la colonisation à EPC le long du tube digestif
4.2.3. Altération du microbiote digestif associée à l’antibiothérapie et à la colonisation par EPC
4.2.4. Existence d’une fenêtre de susceptibilité à la colonisation par EPC encadrant l’administration de clindamycine
4.2.5. Vérification de l’absence d’effet délétère d’une colonisation par EPC
4.3. Impact de la colonisation à EPC sur la pneumopathie à P. aeruginosa
4.3.1. Impact de la colonisation à EPC sur la sévérité de la pneumopathie
4.3.2. Effet de la transplantation de microbiote fécal
4.3.3. Effet de la transplantation de filtrats stériles de selles
4.3.4. Analyse par cytométrie en flux des populations cellulaires pulmonaires et spléniques
4.3.5. Analyse métagénomique de la composition du microbiote digestif
4.3.6. Analyse métabolomique
4.3.7. Métabolites du tryptophane
4.3.8. Inférence fonctionnelle à partir de métagénomique ciblée
5. Discussion et perspectives
6. Bibliographie
7. Annexes

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