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Classification des composés phénoliques
Les composés phénoliques sont l‟une des trois grandes classes de métabolites secondaires des plantes. Leur biosynthèse comprend la voie des phénylpropanoïdes pour la construction squelette carboné C6-C3 (acides hydroxycinnamiques), voire C6-C1 (acides hydroxybenzoïques), et celle des flavonoïdes pour la construction du squelette tricyclique de type C6-C3-C6 (tableau 1). Les flavonoïdes composent la principale classe de composés phénoliques. Leurs groupements OH phénoliques, ainsi que le groupement OH occupant la position C3 de certaines sous-classes (flavanols, flavonols, anthocyanidines), sont fréquement méthylés, glycosylés par une variété de sucres neutres (ex. : D-glucose, L-rhamnose), voire acylés par un résidu d‟acide gallique des oligomères et des polymères par la formation des liaisons C4-C6 et C4-C8. Les proanthocyanidines ainsi formées constituent la famille des tanins dits « condensés » pour les distinguer des tanins dits « hydrolysables » (gallotannins et ellagitannins) dérivés de l‟acide gallique. Le terme « polyphénols » est souvent pris dans son acceptation la plus large des « composés phénoliques », bien que certains (acides hydroxycinnamiques et hydroxybenzoïques) ne présentent en fait qu‟un seul cycle phénolique (Fardet et al. 2013).
La diversité des polyphénols dans les grains des mils
Les céréales sont des plantes cultivées principalement pour leurs graines utilisées dans l’alimentation de l’homme et des animaux domestiques, souvent moulues sous forme de farine, mais aussi en grains et parfois sous forme de plante entière (fourrages). En alimentation humaine ce sont surtout le blé, le riz et secondairement le maïs qui sont utilisés aujourd’hui. L’orge sert surtout en brasserie pour la fabrication du malt. Certaines céréales secondaires sont remises au goût du jour avec le retour à une agriculture biologique, comme l’épeautre, le seigle ou l’avoine (Alais & Linden 1997). Le mil est une céréale cultivée depuis plus de 3500 ans dans tout le Sahel (Gambie, Mali, Niger, Nigeria, Sénégal et le Tchad) et les pays tropicaux d‟Afrique de l‟Ouest. Originaire du Niger et du Mali, sa culture s‟est diffusée en Afrique équatoriale puis vers l‟Inde, notamment grâce à une adaptation génétique à différents climats, un des facteurs clés de la domestication et de la diffusion des plantes cultivées (Saïdou et al. 2009). En Algérie sa culture est surtout répandue au Sud-Ouest du pays. Dans la région d‟Adrar, il était anciennement cultivé partout dans les oasis de différentes régions (Touat, Gourara et Tidikelt) (Rahal Bouziane, 2006).
« Mil » est un terme générique qui désigne plusieurs espèces dont les grains servent dans l‟alimentation humaine et animale. Le plus souvent, le terme réfère toutefois à une variété particulière ; le mil perlé, une céréale qui appartient à la famille des Poaceaes (ex gramineae), tribu des Paniceae or c‟est la variété la plus répandue à travers le monde. Elle est également appelée : Pennisetum americanum, Pennisetum typhoides, mil à chandelle ou mil pénicillaire (Maire 1952). En Amérique du Nord, on la retrouve surtout sous sa forme décortiquée ou alors moulue en farine (Caballero et al. 2003). Le mil à chandelle reste la principale source d‟énergie de millions de personnes du fait qu‟il représente le pilier de la sécurité alimentaire au Sahel. C‟est une des cultures vivrières les plus importantes de la région, avec deux autres céréales le sorgho et le riz (Saïdou et al. 2009). Il constitue la source quotidienne d‟environ 495 kcal pour chaque citoyen (FAOSTAT 2004). Au Niger, deuxième pays producteur d‟Afrique après le Nigeria, le mil couvre par exemple plus de 65 % de la surface cultivée et constitue près des trois quarts de la production céréalière du pays (Saïdou et al. 2009).
En Inde, le mil occupe la quatrième place après le riz, le blé et le sorgho (Wybrecht et al. 2002). De nombreux efforts ont été consentis pour déterminer la répartition des composés phénoliques dans les différentes parties de la graine de mil, en utilisant des analyses chimiques et histochimiques. Les polyphénols ne sont pas répartis également d‟une façon homogène dans le grain, mais plutôt sont principalement concentrés dans les couches extérieures, à savoir la couche d’aleurone, la testa et le péricarpe, qui forment les principaux composants de la fraction de son. Les examens histochimiques du grain de mil indique que près de 60% des polyphénols du mil sont concentrés dans le tégument qui représente environ 12% de la masse de grain. Les composés phénoliques se trouvent sous forme libre, soluble conjuguée et liée insoluble. Selon Hilu et al. (1978), la majorité des composés phénoliques présents dans le mil existent sous la forme de glycosides, alors que Subba Rao & Muralikrishna (2002) ont signalé l’acide férulique est l‟acide phénolique lié majeur (18,60 mg / 100 g) et l‟acide protocatéchique est l‟acide phénolique libre majeur (45,0 mg / 100 g) du mil. Les composés phénoliques de mil sont stables à la chaleur, mais sensibles au pH et sont largement instables dans des conditions alcalines (Chethan & Malleshi 2007).
La séparation des polyphénols par chromatographie liquide de haute performance (HPLC) a montré que les analytes étaient des dérivés de l’acide benzoïque (acide gallique, acide protocatéchique et l‟acide p-hydroxybenzoïque) et l’acide cinnamique (acide p-coumarique, acide syringique, acide férulique et acide trans-cinnamique) et un flavonoïde (quercétine). Les dérivés de l’acide benzoïque représentaient environ 85% des composés phénoliques totaux (Chethan et al. 2008). En plus de ces composés phénoliques, la spectrométrie de masse a montré la présence de naringénine, kaempferol, lutéolineglucoside, phloroglucinol, Apigenin, (+) – catéchine / (-) – épicatéchine, trans-feruloylmique Acide, dimère de la prodélolinidine (epi / gallocatechins, 2GC), daidzeine, gallates de catéchine, trimères et tétrogrammes de catéchine (Shobana et al. 2009).
Effets immunomodulateurs et anticancéreux des polyphénols
Les éventuels bénéfices que pourraient apporter les polyphénols à la santé humaine intéressent particulièrement deux domaines : la phytothérapie – puisque l‟explication de l‟efficacité supposée de nombreuses plantes médicinales repose en tout ou partie sur la présence de composés phénoliques dans ces plantes – et l‟hygiène alimentaire, du fait que de nombreuses études indiquent que les polyphénols pourraient diminuer le risque de survenue d‟un certain nombre de pathologies, en particulier celles liées au vieillissement et aux lésions oxydatives (cancers, maladies cardiovasculaires ou neurodégénératives) (Leong & Shui 2002).
Les maladies auto-immunes comprennent une série de maladies systémiques telles que la polyarthrite rhumatoïde et le lupus systémique érythémateux qui sont souvent associés à des morbidité et mortalité (Wernick & Campbell 2000). L’inflammation et les dommages infligés aux propres tissus orchestrés par une réponse cellulaire et / ou humorale de l’hôte est la caractéristique de tous les syndromes auto-immunes. Les auto-anticorps, les réponses immunitaires spécifiques à médiation cellulaire, et le réseau de cytokines indépendant de cellules T sont les principaux acteurs de la pathogenèse de telles maladies auto-immunes telle l‟arthrite rhumatoïde (Firestein 2003). Cette hyperaction du système immunitaire peut être régulée par un mécanisme dit immunomodulation. Cette dernière correspond au processus de modification d’une réponse immunitaire de manière positive ou négative par l’administration d’un médicament ou d’un composé (Tzianabos 2000). Récemment, plusieurs composés dérivés de plantes, tels que les triperines et les triptolides, ont été jugés immunosuppresseurs et sont maintenant largement utilisés dans le traitement de l’inflammation et maladies auto-immunes (Lu et al. 2011).
L’acide p-coumarique est un polyphénol omniprésent dans les céréales comme les mils, le maïs, l’avoine, le blé et les fruits et légumes comme les pommes, raisins, oranges, tomates, pommes de terre et épinards (Konishi et al. 2003). Il a été démontré que l’acide p-coumarique a un effet protecteur contre plusieurs pathologies comme l’athérosclérose (Zang et al. 2000), la carcinogenèse (Hudson et al. 2000) et contre les dommages causés par les UV aux tissus oculaires (Lodovici et al. 2009), et contre la lésion neuronale dans la maladie de Parkinson (Vauzour et al. 2010). Par ailleurs de nombreux travaux ont démontré que l‟acide p-coumarique a un effet anti-ulcère (De Barros et al. 2008), antimicrobien (Jeong- Yong et al. 1998), anti-plaquettaire (Luceri et al. 2007), anti-mutagène (Ferguson et al. 2003), et des activités anti-inflammatoires (Luceri et al. 2004).
L‟inflammation et le stress oxydatif sont à l’origine de plusieurs pathologies tel le cancer (Todoric et al. 2016; Prasad et al. 2016). Les cellules cancéreuses sont connues par leur capacité à s‟échapper à l‟apoptose. Les études impliquant le contrôle de l’apoptose dans le traitement du cancer, ont utilisé différentes stratégies concernant l’initiation, la progression et/ou l’invasion ; les trois étapes principales de la carcinogenèse. Cependant, le développement de la résistance tumorale et des effets secondaires indésirables des thérapies ciblées impliquent la nécessité de s‟orienter vers de nouvelles stratégies de traitement avec une moindre toxicité. Les polyphénols naturels ont de nombreux avantages potentiels pour la santé humaine (Obrenovich et al. 2010). La relation entre les polyphénols naturels, l’apoptose et le cancer a été identifiée par des études qui ont démontré la capacité de ces composés à agir comme agents chimiopréventifs et / ou chimiothérapeutiques contre le cancer (Kelloff et al. 1994; Stoner & Mukhtar 1995; Jang et al. 1997). Les polyphénols, en plus de leur activité antioxydante et parmi de nombreux mécanismes potentiels, tel la régulation de l’expression des gènes impliqués dans la survie et la prolifération cellulaire (Kang et al. 2011), induisent des différents programmes de mort cellulaire (Giovannini & Masella 2012), ou inhibent la matrice des métalloprotéinases (Katiyar 2006) et le facteur de croissance endothélial vasculaire (Oak et al. 2005), contrecarrant ainsi l’angiogenèse et affectant le développement des métastases.
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Table des matières
Introduction
Revue bibliographique
I.Polyphénols
I.1. Généralités
I.2. Classification des composés phénoliques
I.2.1. Les flavonoïdes
I.2.2. Les non-flavonoïdes
I.3. La diversité des polyphénols dans les grains des mils
I.4. Effets immunomodulateurs et anticancéreux des polyphénols
II.La réponse immunitaire
II.1.Introduction
II.2. Les cellules immunocompétentes
II.2.1. Origine
II.2.3. Les lymphocytes T : rôle central dans la réponse immunitaire
II.3 L‟activation des lymphocytes T
II.3.1. Les récepteurs des cellules T
II.3.2. L‟activation des lymphocytes T par le TCR
II.3.3. La transduction du signal via le TCR
III. Ostéosarcome
III.1.Physiologie du tissu osseux
III.1.1. Généralités
III.1.2. Les fonctions physiologiques du tissu osseux
III.1.3. Composition du tissu osseux
III.1.4. Le remodelage osseux
III.2. Les tumeurs osseuses primitives
III.3. Epidémiologie des ostéosarcomes
III.4.Localisations des ostéosarcomes
III.5. Anomalies cytogénétiques et épigénétiques dans les ostéosarcomes
IV.L’apoptose
IV.1. Les morts cellulaires : définitions et caractéristiques
IV.2. Caractéristiques de l‟apoptose
IV.2.1. Critères morphologiques
IV.2.2. Critères biochimiques
IV.3. Les différentes voies de l’apoptose
IV.4. Rôle du calcium dans la régulation de l’apoptose
V.Objectifs généraux de la thèse
Etude expérimentale
I.Pouvoir antioxydant des polyphénols de mil
I.1. Préparation du matériel biologique végétal
I.2. Détermination du taux d‟humidité
I.3. Préparation des extraits polyphénoliques
I.4. Dosage des polyphénols
I.5. Dosage des flavonoïdes
I.6. La quantification des polyphénols par HPLC dans les grains de mil, cultivar Bechna
I.7. Pouvoir antioxydant in vitro de mil : test de DPPH
II. Effet immunomodulateur des polyphénols et des lipides de mil
II.1. Détermination de la composition en acides gras par chromatographie en phase gazeuse (CPG)
II.2. Isolement des lymphocytes T
II.3. Test de transformation lymphoblastique (TTL)
II.4. Préparation des échantillons pour Western blot
II.5. Détection des MAP kinases par Western blot
II.6. Détermination de l‟expression des ARNm par RTqPCR
II.7. Mesure de la signalisation calcique
III. Effet anticancéreux des polyphénols du mil
III.1. Culture cellulaire et traitements
III.1.1 Lignées cellulaires et entretien
III.1.2. Traitements PGPC, p-CA et 5-FU
III.1.3. Traitements avec les inhibiteurs
III.2. Mesure de la prolifération cellulaire
III.3. Marquage Annexin V et 7AAD
III.4. Détermination de l‟expression des ARNm par RTqPCR
III.5. Western blot
III.5.1. Extraction et dosage des protéines
III.5.2. Migration et transfert
III.5.5. Immunoblotting et révélation
III.5.6. Arrachage d‟anticorps et réutilisation de la membrane
III.6. Etude du cycle cellulaire sur cellules fixées par Cytométrie de flux
II.Analyse statistique
Résultats & dicussions
I.Pouvoir antioxydant des extrais polyphénoliques de grains de mil
I.1. Détermination du taux d’humidité
I.2. Rendements des extractions
I.3. Détermination de la teneur en polyphénols totaux
I.4. Détermination de la teneur en flavonoïdes
I.5. Le profil phénolique des grains du mil, cultivar Bechna
I.6. Pouvoir antioxydant: test DPPH antiradicalaire
I.7. Discussion
II.Les effets immuno-modulateurs de l’extrait polyphénolique et lipidique des grains de mil, Pennisetum glaucum, cultivar Bechna
II.1. La composition en acides gras des grains du mil, cultivar Bechna
II.2. PGPC et PGL diminuent la prolifération des lymphocytes T
II.3. PGL et PGPC diminuent l’activation de ERK1 / ERK2 induite par PMA
II.4. PGL et PGPC diminuentl‟expression d‟IL-2 dans l’ARNm
II.5. PGL et PGPC induisent des augmentations de [Ca2+]i dans les cellules T spléniques
II.5. Discussion
III. Effet anticancéreux de l’extrait polyphénolique des grains de mil, Pennisetum glaucum, cultivar Bechna
III.1. Viabilité cellulaire
III.2. Induction de l‟apoptose par PGPC et p-CA
III.3. Détection des protéines apoptotiques
III.4. Effet du PGPC sur l‟augmentation du Ca2+ intracellulaire dans les cellules U2OS
III.5. Effet de PGPC sur les voies de signalisation impliquées dans la prolifération des cellules U2OS
III.6. Analyse de la distribution du cycle cellulaire
III.7. Cyclines et CDK analyse d’expression
III.8. Discussion
Conclusion
Références bibliographiques
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