Chromatographie liquide à haute performance (CLHP)

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Genre Billburttia

Billburttia est un genre endémique de Madagascar et comprend deux espèces : B. capensoïdes et B. vaginoides [9]. Ces deux espèces ont été initialement classées dans le genre Peucedanum [15] avant d’être transférées dans le genre Billburttia.

Espèce Billburttia capensoides

Description

Billburttia capensoides (figure 6) est un arbuste glabre, variant de 0,5 à 2 m. Ses rameaux, érigés, ramifiant au niveau des inflorescences ont de couleur rougeâtre ou bleu verdâtre. Ses feuilles caulinaires, persistantes ont 1 à 2 pennée ; les folioles terminales sont linéaire elliptique à elliptique ; les nervures principales et latérales se développent de même manière ; les pétioles sont engainantes sur presque toute sa longueur. Son inflorescence terminale est composée d’ombelles ou composées de panicules d’ombelles ; bractées et bractéoles nombreuses, linéaires oblongues et inégales. Les fleurs sont nombreuses et petites. Les sépales sont réduites ; 5 pétales jaunes verdâtre à sommet réfléchi vers l’intérieur, 5 étamines libres à anthère dosrifixe. Ovaire infère est terminé par deux styles courts, deux loges. Les fruits sont faiblement aplatis dorsalement, glabres, cotes médian et latéral proéminent, ailes peu développés.
Figure 6: Billburttia capensoïdes (photographie de RAKOTONANDRASANA Stephan)
C’est une espèce des formations rocheuses rencontrée sur les hautes terres, au-dessus de 1000 m d’altitude, entre les massifs d’Andringitra et d’Arivonimamo (figure 7). Elle tolère les espèces introduites et résiste aux feux.

Les composés phénoliques

Définition

Les composés phénoliques des végétaux correspondent à un vaste ensemble de molécules qui ont toutes en commun un noyau benzénique (aromatique) portant un ou plusieurs hydroxyles libres ou engagés dans une autre fonction.
Ce sont des molécules issues du métabolisme secondaire et qui sont à la fois du règne animal et du règne végétal notamment des angiospermes.
Ils interviennent dans différents aspects de la vie de la plante, ils sont ainsi impliqués dans la physiologie de la plante, dans les mécanismes de défenses de la plante (abiotiques) ou encore dans la coloration des fleurs. Par ailleurs ils sont bénéfiques pour l‘homme vis-à-vis de certaines maladies de par leur action sur le métabolisme humain et leur propriété antioxydante [17].
Ils peuvent être engendrés par deux voies métaboliques : la voie du shikimate, la plus courante, qui conduit entre autre à la formation des acides phénoliques, flavonoïdes; et la voie des polyacétates qui est à l‘origine de composés polycycliques tels que les coumarines et les quinones [18].

Classification des composés phénoliques

Il existe plusieurs classes de composés phénoliques selon le squelette carboné (tableau I)

Coumarines

Les coumarines (figure 8) sont des substances naturelles composées de neuf atomes de carbone possédant le noyau benzo (2H)-1-pyran-2-one. Ce composé dériverait de la cyclisation de l’acide cis cinnamique oxygéné en C-2 [19].

Classification des coumarines

Les coumarines sont substituées par un hydroxyle ou plus sur les six positions disponibles. La majorité des coumarines sont substituées en C-7 par un hydroxyle.
Les coumarines sont classées en cinq catégories selon la nature des substituants sur leurs structures (tableau II) [20] [21].

Chromatographie

Définition

C’est une méthode de séparation des constituants d’un mélange liquide ou gazeux en des différents constituants. Elle a pour but d’identifier et d’isoler les composés d’un mélange [22][W3].

Types de chromatographie

Chromatographie sur couche mince

La chromatographie sur couche mince (CCM) correspond à la chromatographie liquide (la phase mobile est un liquide précisément un solvant) pour laquelle la phase stationnaire se présente sous la forme d’une couche plane de faible épaisseur. La phase mobile se déplace le long d’une plaque chromatographique (plaque de gel de silice) [23] [24]. La CCM est un outil précieux pour l’analyse chimique. Elle est très simple à utiliser.

Chromatographie sur colonne

La Chromatographie sur colonne est aussi appelée Chromatographie Liquide à basse Pression. Cette chromatographie est basée sur le même principe que la CCM, sauf que la silice est placée dans une colonne et non sur une plaque. La chromatographie sur colonne sert à séparer des produits. C’est la méthode standard de purification dans un laboratoire de chimie organique. Deux types de chromatographie sur colonne existent:
Chromatographie par gravité: elle utilise des particules de silice de 70 à 200 µm et le solvant s’écoule au goutte-à-goutte. Cette technique est désuète car elle demande une plus grande quantité de silice et de solvant.
Chromatographie éclair (“flash”): elle nécessite des particules de silice de 35 à 70 µm et le solvant s’écoule sous pression d’air comprimé (utilisation de la pompe à vide). [25].
Cette technique est employée dans la purification en chimie organique.

Chromatographie d’adsorption en phase inverse

La chromatographie en phase inverse est une méthode visant à séparer les constituants d’un mélange en fonction de leur polarité et les composés polaires sont collectés en premier à l’inverse d’une séparation par chromatographie classique [W4].
La phase stationnaire est apolaire, elle est constituée de petites particules de silices greffées de fonctions chimiques, le plus souvent de chaines alkyles à 8 ou 18 atomes de carbone [26].

Chromatographie liquide à haute performance (CLHP)

Chromatographie liquide à haute performance (CLHP) [27] est une forme de chromatographie en phase liquide utilisée pour séparer des composés en mélange dans une solution [W5]. Son utilisation est plus complexe. Elle nécessite davantage de précautions mais a apporté une grande amélioration dans de nombreux domaines, notamment au niveau du seuil de détection et de la résolution. Un système de CLHP classique comprend les éléments suivants:
Un système de pompage (simple ou multiple) pour déplacer la phase mobile à haute pression
Un injecteur (manuel ou automatique) pour introduire, dans le système à haute pression, l’échantillon solubilisé dans un solvant adéquat et exempt de particules en suspension (risque de boucher la colonne),
Une colonne contenant la phase stationnaire. Celle-ci est de granulométrie très fine, c’est d’ailleurs ce qui permet le gain de résolution mentionné plus haut. Ceci explique la nécessité de recourir à des pressions très importantes (et à des matériaux résistant à ces pressions !) pour « forcer » le passage de la phase mobile à travers ce solide finement poreux en un temps raisonnable,
Un détecteur à ultraviolet,
Une interface permettant de visualiser les signaux enregistrés par le détecteur.
Détecteur UV-Visible
En CLHP, la détection UV/Visible est le mode de détection le plus utilisé pour l’analyse des produits naturels possédant un ou plusieurs chromophores. Il est possible de suivre une analyse à plusieurs longueurs d’ondes simultanément, et d’enregistrer les spectres d’absorption de chaque composé élué par la phase mobile. De plus, ce mode de détection est rapide, reproductible, sensible et non destructif [28].

Antioxydants

Définition

Un antioxydant peut être défini comme toute substance capable, à concentration relativement faible, d’entrer en compétition avec d’autres substrats oxydables et ainsi retarder ou empêcher l’oxydation de ces substrats. Ce sont des éléments protecteurs qui agissent comme capteurs de radicaux libres. L’utilisation des molécules antioxydantes de synthèse est actuellement remise en cause en raison des risques toxicologiques potentiels. De nouvelles sources végétales d’antioxydants naturels sont actuellement très recherchées pour remplacer les antioxydants d’origine synthétique [29] [30].

Test de l’activité antioxydante

Principe du test au 1,1-diphényl-2-picrylhydrazyle (DPPH) [31]: le composé chimique DPPH possède un électron non apparié sur un atome du pont d’azote. Du fait de cette délocalisation, les molécules du radical ne forment pas des dimères et restent dans leur forme monomère relativement stable à température ordinaire. La délocalisation provoque aussi la couleur bleue violette bien caractéristique de la solution de DPPH. La mesure de l’efficacité d’un antioxydant se fait en mesurant la diminution de la coloration bleue due à une recombinaison des radicaux DPPH par spectrophotométrie à 518 nm [32]. En présence des piégeurs de radicaux libres, le DPPH (1,1-diphényl-2-picrylhydrazyle) de couleur violette est réduit en 1,1-diphényl -2-picrylhydrazine de couleur jaune.

Antifongique

Les antifongiques tirent leur nom du latin fungus qui signifie champignons. Ce sont donc des médicaments capables de traiter les mycoses, c’est-à-dire les infections provoquées par des champignons microscopiques et levures. Les techniques de référence pour la détermination de la sensibilité aux antifongiques s’appuient sur la méthode de microdilution en milieu liquide. L’unité de référence est la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) : elle correspond à la plus faible concentration inhibant la pousse du pathogène, et est exprimée en µg/ml.

Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire

La Résonance magnétique nucléaire (RMN) est une technique d’analyse spectrale qui permet de déterminer la structure chimique des molécules organiques. Tous les atomes ne sont pas visibles par RMN. Pour être « observé », leur noyau doit posséder un moment magnétique de spin. C’est seulement le cas des isotopes 1H, 13C, 15N et 17O des atomes de proton, carbone, azote et oxygène les plus abondants dans les molécules biologiques [33]. La RMN consiste à soumettre un échantillon à un champ magnétique. Ce dernier permet de faire résonner les atomes de la molécule contenu dans l’échantillon. Les différentes fréquences de résonance des atomes sont consignées dans un graphique permettant de déterminer la structure de la molécule. Il existe plusieurs types de spectres RMN.
RMN MONODIMENSIONNELLE
Spectre RMN du proton (1H)
Le spectre RMN du proton est une méthode utilisée dans la détermination structurale des composés organiques. Il fournit de nombreuses informations :
– L’intégration des signaux qui permet de déterminer le nombre de protons correspondant à un signal donné ;
– La multiplicité des pics fournit des informations sur le nombre de protons portés par les carbones voisins (singulet, doublet, triplet, quadruplet, multiplet)
– Le déplacement chimique (δ ppm) des signaux permet d’identifier les groupements et les fonctions contenus dans la molécule grâce à la comparaison de leur déplacement chimique à ceux des tables de référence
– La constante de couplage entre les pics (J en Hz) permet de déterminer la position des protons les uns par rapport aux autres.
Spectre du carbone découplé (13C)
Le spectre RMN du 13C met en évidence les carbones de la molécule. Différentes informations sont aussi obtenues à partir de ce spectre :
– Le nombre de pics détermine le nombre de carbones dans la molécule à condition qu’il n’y ait pas chevauchement de pics
– Le déplacement chimique (δ ppm) des pics permet d’identifier des groupements et fonctions de la molécule en les comparants à ceux des tables de référence.
Distortionless Enhancement by Polarization Transfer (DEPT)
Ce spectre permet de différencier les carbones quaternaires, les méthines ; les méthylènes et les méthyles.
RMN BIDIMENSIONNELLE
RMN bidimensionnelle est une technique qui permet de montrer les corrélations plus complexes existant entre des noyaux qui possèdent un spin nucléaire [34]. La corrélation entre les noyaux possédant un spin nucléaire peut être séparée en deux types : corrélation homonucléaire et corrélation hétéronucléaire.
Corrélations homonucléaires
– COSY : ce spectre fournit des informations sur les couplages homonucléaires 2J et 3J (protons séparés par deux ou trois liaisons) entre les protons voisins et ceux qui sont adjacents.
– NOESY: cette technique permet d’observer, dans l’espace, les corrélations entre protons (effets Overhausser) d’une même molécule.
Corrélations hétéronucléaires
– HSQC : ce spectre montre les corrélations entre les carbones et les protons directement liés entre eux. Toutefois, il ne permet pas d’observer les déplacements chimiques des atomes de carbones quaternaires.
– HMBC : cette technique répond aux problèmes précédemment posés, puisqu’elle permet la détection des couplages longue distance et la déduction des carbones quaternaires couplés aux protons [35].

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Table des matières

INTRODUCTION
PARTIE I : GENERALITES
I.1. Famille APIACEAE
I.1.1. Intérêt économique de la famille APIACEAE
I.1.2. Travaux antérieurs sur la famille APIACEAE
I.2. Genre Billburttia
I.3. Espèce Billburttia capensoides
I.3.1. Description
I.3.2. Classification botanique
I.4. Les composés phénoliques
I.4.1. Définition
I.4.2. Classification des composés phénoliques
I.4.3. Coumarines
I.4.4. Classification des coumarines
I.5. Chromatographie
I.5.1. Définition
I.5.2. Types de chromatographie
I.5.2.1. Chromatographie sur couche mince
I.5.2.2. Chromatographie sur colonne
I.5.2.4. Chromatographie d’adsorption en phase inverse
I.5.2.5. Chromatographie liquide à haute performance (CLHP)
I.6. Antioxydants
I.6.1. Définition
I.6.2. Test de l’activité antioxydante
I.7. Antifongique
I.8. Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire
Partie II : MATERIELS ET METHODES
II.1. Matériels végétal
II.2. Méthodes
II.2.1. Criblage phytochimique
II.2.2. Extraction
III.4.2.2. Extraction liquide-liquide
II.2.3. Tests d’activités
II.2.5. Fractionnement, isolement et purification
II.2.4.1. Chromatographie sur couche mince (CCM)
II.2.4.2. Chromatographie sur colonne
II.2.4.3. Chromatographie Liquide à Haute Performance (HPLC)
II.2.6. Détermination structurale
Partie III : RESULTATS ET DISCUSSIONS
III.1. Criblage phytochimique
III.2. Résultats des extractions
III.3. Tests d’activités
III.3.1. Test antioxydant
III.3.2. Test antifongique
III.4. Fractionnement, isolement et purification
III.4.1. Chromatographie sur couche mince
III.4.2. Chromatographie sur colonne
III.4.2.3. Chromatographie sur colonne flash en phase normale de l’extrait chloroformique
III.4.2.4. Chromatographie sur colonne flash en phase inverse du lot F23 38
III.4.3. Chromatographie Liquide à Haute Performance (CLHP) semipréparative des lots LF 282 et LF
III.5. Détermination structurale des produits
III.5.1. Identification structurale du produit LF1494-1
III.5.2. Identification du produit LF1494-5
III.6. Résultats des tests biologiques
CONCLUSION
REFERENCES

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