Chromatographie en phase gazeuse : Détermination de la composition en monosaccharides des polysaccharides

Dosage des éléments minéraux : Ionogramme

Spectrophotométrie à flamme pour le dosage du Na+ et K+

Le PHF 104 de flamme à dilution automatique permet le dosage simultané du sodium et du potassium.

Principe

La nébulisation d’un échantillon à travers une flamme entraîne une excitation des atomes et provoque le passage des électrons d’une couche (ou sous couche) à une sous couche immédiatement supérieure. L’électron en revenant à son niveau initial restitue cette énergie sous forme de photon.
Le photon émis par les atomes donne un flux de lumière qui passe au travers d’un filtre interférentiel et qui est ensuite mesuré par un photomultiplicateur.
L’échantillon doit se présenter sous forme d’un aérosol de façon à ce que le solvant s’évapore instantanément dans la flamme.
Les photons émis par l’échantillon interne de lithium ou de potassium évaporé dans la flamme sont envoyés au travers d’un filtre interférentiel sur un photomultiplicateur, générant ainsi une tension de référence. Les photons émis par l’échantillon à doser selon le même procédé, génère une tension de mesure. Les concentrations de sodium, de potassium et de lithium sont affichées en temps réel sur l’appareil.

Description de l’appareil

Il est composé de deux sous-ensembles :
• Le compartiment de flamme, qui est constitué :
– d’un brûleur en acier inoxydable ; la flamme est alimentée par un mélange d’air – gaz ( butane ou propane ). Il est situé dans une cheminée étanche en verre, refroidie par une circulation forcée. La flamme est entourée d’un rideau d’air qui l’abrite de toute impureté.
– d’une cheminée : de forme cylindrique, permet l’évacuation du gaz brûlé.
– d’une chambre de nébulisation : qui est sphérique et qui assure un mélange parfait du gaz, de l’air et de l’aérosol. Cette chambre est fixée sur la plaque latérale droite à l’aide d’un collier magnétique.
– détenteurs air et gaz : la fonction de deux détenteurs d’air et de gaz est d’ajuster le débit de constituants de la flamme et de les réguler.

Mélangeur-diluteur

Le diluteur en continu permet un taux de dilution de l’ordre du 1/200ème de l’échantillon à doser ; Cette partie est constituée :
– d’une pompe péristaltique
– d’un peigne tendeur des tuyaux de pompe
– d’un bloc mélangeur
– d’une évacuation
Colorimétrie pour le dosage du calcium, magnésium et du fer:

Principes du dosage du calcium

Le Ca-kit permet le dosage colorimétrique du calcium total, sans déprotéinisation, dans les solutions à analyser. L’ion calcium avec l’indicateur bleu de méthylthymol (BMT) en milieu alcalin.
L’intensité de la coloration du complexe Ca-BMT, mesurée à 612 nm est proportionnelle à la quantité de calcium présente dans l’échantillon.
L’hydroxy-8-quinoléïne élimine l’interférence du magnésium. Le polyvinylpyrolidone (PVP) élimine l’interférence des protéines.
Principe de dosage du magnésium Mg-kit permet le dosage colorimétrique du magnésium total, sans dépolarisation,
dans la solution à analyser. L’ion magnésium réagit avec la calmagite en milieu alcalin ou donner un complexe de couleur rose.
L’intensité de la coloration mesurée à 520nm est proportionnelle à la concentration en magnésium de l’échantillon.
La présence d’EGTA ( Acide bis-(aminoéthyl)-glycol éther – N, N, N’, N’- tétra acétique) supprime l’interférence du calcium.
La présence du polyvinyl pyrrolidone (PVP)et de TritonR X 100 (système surfactant) empêche le déplacement, par les propriétés du sérum, du maximum d’absorption du complexe Mg-calmagite.

Extractions

Matériel utilisé

Balance de précision type Sartorius ; Eprouvette graduée de 1000 ml ; Rotavapor type 349/2. J Bibby; Bain-marie Watherbath Bm 480; pompe à vide de marque Edward ; Lyophilisateur Drywinner type Heto; Congélateur marque Zanker ; Ballon de 3 litres ; Entonnoir en verre ; Coton ; potence ; Spatule.

Extraction avec l’eau

Décoction à 10 %

Nous avons introduit 250 g de poudre d’écorces de tronc dans un ballon contenant 2,5l d’eau distillée. Pour les feuilles, nous avons fait la décoction avec 20 g de poudre dans 200 ml d’eau distillée. Pour la recette nous avons utilisé 100g de poudre pour 1litre d’eau distillée. Il s’agit d’une décoction à 10 %. L’ensemble a été maintenu en ébullition dans un chauffe ballon pendant 15mn. Après refroidissement, nous avons filtré sur compresse puis concentré le filtrat à l’aide d’un rotavapor sous vide à la température de 55 °C. Nous avons ensuite lyophilisé l’extrait concentré après congélation. La lyophilisation nous a permis d’obtenir des poudres marron, jaunâtre et brune respectivement pour les écorces de tronc les feuilles et la recette. Les poudres obtenues ont été conservées dans des flacons en verre, stériles et hermétiquement fermés.
A 50g, 20g, 100g de poudre respectivement pour les écorces de tronc, les feuilles de Manilkara multinervis, et la recette, ont été introduites dans un erlenmeyer de 1000 ml et macérés dans 500 ml, 200ml, et 1000ml d’eau distillée, sous agitation magnétique, pendant 24 heures. Après filtration sur papier filtre, le filtrat a été concentré au rotavapor sous vide à la température de 50°C. Cette opération a été répétée trois fois successivement. Après concentration au rotavapor, les filtrats ont été lyophilisés. Nous avons obtenu des poudres de couleur marron, verte sombre et brune respectivement pour les écorces de tronc, les feuilles et la recette. Les poudres obtenues ont été conservées dans des flacons en verre, propres, stériles et hermétiquement fermés. Le marc de la filtration a été séché et conservé dans un sachet en plastique.

Extraction avec les solvants organiques à polarité croissante

Nous avons introduit 20 g de poudre dans une cartouche, et nous avons procédé à une extraction avec environ 100ml d’éther de pétrole sous réfrigérant à reflux jusqu’à épuisement. L’extrait recueilli dans un ballon a été concentré à l’aide du rotavapor.
Après concentration, l’extrait a été recueilli dans un flacon en verre propre laissé ouvert pendant 24 heures afin d’éliminer toute trace de solvant. Cette même opération fut reprise avec le dichlorométhane.
Toujours sur la même drogue, la même opération a été reprise avec le méthanol à la différence que cette fois-ci l’extrait a été évaporé à sec puis laissé à l’air libre pendant 24heures puis le résidu a été gratté et recueilli dans un flacon en verre propre, stérile hermétiquement fermé.

Technique

10 mg des extraits ont été dissous dans 1 ml d’un mélange eau – méthanol (1 : 1).
Les extraits méthnoliques ont été dissous dans 1 ml de méthanol. Quant aux extraits apolaires, ils ont été dissous dans 1 ml d’acétate d’éthyle.
A l’aide d’une micropipette de 10 μl, nous avons déposé 10 μl de chaque solution sur la plaque. Les traces du solvant ont été complètement évaporées des dépôts à l’aide d’un séchoir.
Nous avons placé la plaque dans les cuves de développement contenant les systèmes de solvants : Ligroïne – Acétate d’éthyle (1 : 1) pour les extraits DCM et d’éther de pétrole.
La migration du solvant d’élution entraîne les substances contenues dans les extraits de plante à des vitesses variées ; il se forme des tâches caractérisant les substances présentes dans l’extrait. Les plaques ont été retirées des cuves dès que le front du solvant a atteint 8 cm environ. Elles ont été séchées et les substances observées sous une lampe UV à 254 nm, à 366 nm, puis révélées avec le réactif de Godin qui permet de caractériser plusieurs groupes de constituants chimiques.
Les plaques ont ensuite été séchées à l’aide du séchoir jusqu’à révélation des composés (Taches colorées sur font blanc).
Chaque substance a été identifiée par sa fluorescence sous UV, par son facteur de rétention (Rf) dans un système de solvant précis, et par sa couleur après révélation avec les réactifs chimiques.

Préparation de la colonne

Dans une seringue de 10ml nous avons mis au préalable un petit morceau de coton puis du sephacryl jusqu’à la moitié de la seringue soit un volume de 5ml ; puis nous avons laissé la masse de séphacryl se tasser pendant 1heure de temps.

Chromatographie proprement dite

Le filtrat obtenu après l’hydrolyse fut passé dans la petite colonne et recueilli dans un bécher et évaporées à sec dans une étuve réglée à 100°C;
Le résidu a été repris avec quelques gouttes de mélange méthanol : eau (1:1). C’est cette solution qui a été utilisée pour les dépôts sur plaque CCM (à raison de 20μl par dépôt).

Chromatographie en phase gazeuse : Détermination de la composition en monosaccharides des polysaccharides

Elle est utilisée pour l’identification et la détermination quantitative des monosaccharides contenus dans les extraits. La phase mobile est gazeuse, les molécules à analyser sont transformées à l’état gazeux.
Principe : Les monosaccharides sont identifiés par comparaison de leur temps de rétention avec le temps de rétention du standard qui est le mannitol. Les masses des monosaccharides sont obtenus à partir des aires relatives.
Matériel : un chromatographe de type GC 8000 séries, une seringue de 5μl, des flacons de 4 ml, un enregistreur, une imprimante, une étuve, des micropipettes ;
Réactifs : 4HCl-MeOH anhydre, mannitol dans du méthanol (1mg /ml), pyridine, triméthlsilane (TMCS).
Mode opératoire : Dans un premier temps nous avons éliminé les tanins de nos extraits. Pour ce faire, nous avons pesé 100mg d’extrait auquel nous avons ajouté 200mg de poudre de peau, puis nous avons introduit le tout dans un erlenmeyer contenant 10ml d’eau distillée, et nous les avons portés en agitation magnétique pendant une heure de temps. Après nous avons filtré sur papier filtre et lyophilisé les solutions obtenues. Les lyophilisat obtenus ont servi à la méthanolyse.

Méthanolyse 

Principe : La solution de méthanolyse (méthanol/acide chlorhydrique) agit sur les molécules de polysaccharides par rupture des liaisons glucosidiques. On obtient des méthylglucosides en C1 puis des méthylesters glucosides.

Hyperglycémie provoquée par voie orale : (H.P.V.O)

Pour provoquer l’hyperglycémie par voie orale chez les souris, nous avons utilisé le glucose ( Dilué à 10% dans l’eau distillée ) à la dose de 3g/kg de poids corporel.
Cette administration a été faite après un jeun de 18heures. 30mn après la surcharge, nous avons administré nos extraits, car une hyperglycémie passagère atteint sa valeur maximale 30 minutes après l’administration du glucose.

Technique de l’administration par voie orale

Nous avons immobilisé l’animal, la tête surélevée, la bouche ouverte. Ainsi la bouche bien ouverte, une seringue chargée du produit, munie de la sonde gastrooesophagienne est introduite jusqu’à l’estomac, puis nous avons envoyé le produit en poussant le piston de la seringue par le pouce vers l’avant à l’image d’une injection.
Ainsi après l’administration des extraits nous avons procédé à des séries de dosage de glycémie chez ces souris à des intervalles de 30mn, jusqu’à 3 heures. C’est à dire : 30mn, 60mn, 90mn, 120mn, 150mn et 180mn après l’administration des extraits.

Hyperglycémie permanente ou diabète expérimental

La méthode la plus commune est de provoquer, au moyen de médicaments une destruction des cellules β pancréatiques. Les substances les plus employées comme diabétogènes sont l’alloxane et la streptozotocine. (Calleja Suarez J.M., 1990)

Diabète alloxanique

Induction du diabète alloxanique chez les souris

Protocole 

Pour provoquer l’hyperglycémie avec l’alloxane chez 40 souris, elles ont été mises à jeun de 18heures, puis leur glycémie de base a été déterminée. Après nous leur avons administré par voie intra péritonéale de l’alloxane à la dose de 50mg/kg.
Cette dose a été administrée 3fois, à des intervalles de 48heures. Une semaine plus tard après la dernière administration, nous avons déterminé leur glycémie afin de sélectionner les souris diabétiques. Nous avons sélectionné les souris ayant une hyperglycémie.

Hyperglycémie provoquée par voie orale : (H.P.V.O)

Pour provoquer l’hyperglycémie par voie orale chez les souris, nous avons utilisé le glucose ( Dilué à 10% dans l’eau distillée ) à la dose de 3g/kg de poids corporel.
Cette administration a été faite après un jeun de 18heures. 30mn après la surcharge, nous avons administré nos extraits, car une hyperglycémie passagère atteint sa valeur maximale 30 minutes après l’administration du glucose.

Technique de l’administration par voie orale

Nous avons immobilisé l’animal, la tête surélevée, la bouche ouverte. Ainsi la bouche bien ouverte, une seringue chargée du produit, munie de la sonde gastrooesophagienne est introduite jusqu’à l’estomac, puis nous avons envoyé le produit en poussant le piston de la seringue par le pouce vers l’avant à l’image d’une injection.
Ainsi après l’administration des extraits nous avons procédé à des séries de dosage de glycémie chez ces souris à des intervalles de 30mn, jusqu’à 3 heures. C’est à dire : 30mn, 60mn, 90mn, 120mn, 150mn et 180mn après l’administration des extraits.

Technique d’administration des produits chez la souris

Par voie intra-péritonéale

De la main droite saisir la souris et la déposée sur une planchette horizontale pour lui donner une direction, puis brusquement, saisir la tête et le cou par la main gauche avec le pouce et l’index en la mettant en l’air ( en décubitus dorsale), la queue étant coincée par l’auriculaire gauche contre la paume. Introduire l’aiguille horizontalement dans la région de la moitié postérieure de l’abdomen, en dehors de la ligne médiane, et la pousser en avant sur une profondeur de 2 à 3mm; si nous ne rencontrons aucune résistance, pousser l’injection (jusqu’à 1ml); dans le cas contraire retirer un peu l’aiguille.

STANDARDISATION DE LA POSOLOGIE

Nous avons obtenu comme dose moyenne d’administration de la cuillérée à café : 3,92 g et comme d’un sachet nous avons obtenu : 99,88g.
Le volume d’eau de deux verres huit d’eau est de 142ml
Ce qui nous ramène à dire que pour un traitement nous il faut: ( 99,88 X 2 ) soit 199,76 g de drogue pour un traitement qui correspondra à 51 jours.
C’est à la suite de ces mesures que nous sommes parvenus à la détermination de la dose d’administration : 3,92g/j en une prise pour un adulte de 60kg; soit 6,5mg d’extrait par kilogramme de poids.

CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE (CCM)

Les résultats de la CCM sur les extraits de la recette, des écorces de tronc et des feuilles de Manilkara multinervis sont portés dans les tableaux . Chaque substance a été caractérisée par sa fluorescence sous UV, son Rf et la couleur de la tache après révélation par les révélateurs chimiques.

Analyses et discussions

Notre travail a porté sur la standardisation de la posologie donnée par le tradipraticien de la recette, puis sur le screening phytochimique de la recette, des écorces de tronc et des feuilles de Manilkara multinervis.
Nos tests biologiques ont porté sur : l’activité antioxydante des différents extraits polaires de la recette, des écorces de tronc et des feuilles de Manilkara multinervis, l’activité sur la glycémie normale et enfin sur l’activité antihyperglycémiante et l’activité antidiabétique de l’extrait selon la préparation du tradipraticien et du décocté à 10% de la recette.
La revue de littérature nous a permis de faire la systématique de notre plante et d’en dénombrer certaines utilisations de ses différentes parties.
Le screening phytochimique nous a révélé la présence de tanins avec une prédominance des tanins catéchiques, de stérols et triterpènes, d’oses et holosides, de flavonoïdes dans la recette, les écorces de tronc, et les feuilles de Manilkara multinervis.
Les leucoanthocyanes n’ont été observés que dans les feuilles et les catéchols dans la recette et les écorces de tronc.
Les composés réducteurs, les alcaloïdes, les hétérosides cardiotoniques, les hétérosides cyanogéniques, les anthracéniques ont été absents de nos trois drogues.
Les tanins sont des composés polyphénoliques, reconnus pour leur pouvoir de fixation aux protéines avec tendance à l’imperméabilité des couches sous-jacentes.
Leur effet antiseptique et leur propriété de renouvellement des tissus pourraient expliquer l’utilisation des écorces en décoction pour nettoyer les plaies selon Alain et Sylvie EPELBOIN 1983.
Les tanins sont également des composés reconnus pour leur propriété antioxydante, et des études in vivo et in vitro nous ont montrés que les radicaux réactifs contribuent à la destruction des cellules pancréatiques dans le diabète insulinodépendant selon Robinovitch et al.1992.
Les flavonoïdes avec leur activité antioxydante agiraient sur les vaisseaux sanguins et préviendraient les complications du diabète telles que l’athérosclérose selon R.M. Perez en 1998. R.M.Perez 1998, reconnaîtrait aussi une activité hypoglycémiante aux flavonoïdes et aux stérols et triterpènes.
Notre étude réalisée au Département Médecine Traditionnelle (DMT) de l’Institut National de Recherche en Santé Publique (INRSP) de Bamako nous a permis de mettre en évidence la présence des différents groupes chimiques dans les poudres de la recette, des écorces de tronc et celle des feuilles de Manilkara multinervis ainsi que l’évaluation des activités biologiques de nos trois drogues.
Les études phytochimiques ont montré la présence dans les drogues, un certain nombre de groupes chimiques doués d’activité antidiabétique à savoir les tanins, de stérols et triterpènes, des flavonoïdes.
Les dosages en éléments minéraux et en polysaccharides nous ont donné des teneurs considérables dans nos extraits. Ces éléments étant important dans la régulation de la glycémie chez le diabétique.
L’activité antioxydante nous a donné un résultat caractérisé par des spots jaunes sur un fond violet, représente un intérêt non moins considérable dans la prévention de la destruction de cellules pancréatique.
Le test sur la glycémie de base n’ayant pas montré une baisse de la glycémie après administration de l’infusé selon la préparation du thérapeute à la dose de 6,5mg/kg, et vu que le taux de diminution observé avec le décocté à 10% de la recette à la même dose à été de 6,75% au bout de deux heures, nous pouvons dire que nos extraits n’ont pas un effet hypoglycémiant chez le sujet normal.
Le test sur l’hyperglycémie temporaire nous a donné des résultats très remarquables car au bout de 150mn nous avons obtenu des taux d’inhibitions de 53,71% pour l’infusé selon la préparation du thérapeute et 45,24% du décocté à 10% de la recette à la posologie de 6,5mg/kg.
Le test sur le diabète permanent nous a montré une baisse de la glycémie au bout de trois heures avec des taux variant de 39,79% à 56,28% pour respectivement la dose de 13mg/kg et 6,5mg/kg de l’infusé selon la préparation du thérapeute.
Ces résultats favorables justifient l’utilisation de cette recette dans le traitement du diabète.
Il serait judicieux de continuer ce travail dans le but de rechercher d’autres activités.

 

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Table des matières

Chapitre I : Introduction
Introduction
Motivations
Objectifs
• Objectif général
• Objectifs spécifiques
Chapitre II : Travaux antérieurs
1. Rappels sur le diabète
Définition
Facteurs favorisants du diabète
Signes du diabète
Etiologies
Les différentes causes du diabète
Les données cliniques essentielles pour le diagnostic étiologique
Classification du diabète
Biologie ou physiopathologie
Rappel anatomique du pancréas
L’insuline
Définition et biosynthèse de l’insuline
Structure de l’insuline humaine
Mécanisme d’action de l’insuline
Régulation de la sécrétion insulinique
Conséquence de la carence en insuline
Effets de l’insuline
L’hypoglycémie
Définition
Etiologie
Signes cliniques
Traitement
Diabète insulinodépendant (DID)
Diabète non insulinodépendant (DNID)
Complications du diabète
1.7.1 Complications dégénératives
1.7.2 Complications dermatologiques
Complications aiguës
Traitement du diabète
Diététique
Exercices physiques
Insuline
Antidiabétiques oraux
2. Monographie de Manilkara multinervis Dub
Position dans la systématique
Synonymes
Noms vernaculaires
Caractères botaniques
Cycle végétatif
Habitat
Emplois
Chimie
3. Les antioxydants
Définition
Antioxydants naturels
Effets des antioxydants sur certaines pathologies
Méthodes des tests antioxydants
Chapitre III : Travaux personnels
Méthodologie
1. Matériel
Matériel végétal
Matériel de laboratoire
Matériel animal
2. Standardisation de la posologie de la recette
3. Etudes phytochimiques
Réactions de caractérisation
Réactions en tubes
Dosages de certaines substances
4. Extractions
Extraction avec l’eau
Macération avec l’éthanol à 70%
Extraction avec les solvants à polarité croissante
5. Méthodes chromatographiques
Chromatographie sur couche mince (CCM)
Chromatographie sur colonne
Chromatographie en phase gazeuse (CPG)
Préparation de l’extrait à chromatographier
Technique de la CPG
6. Activités biologiques
6.1. Activités antioxydantes
6.2. Test sur la glycémie normale
6.3. Test sur l’hyperglycémie temporaire
6.4. Test sur l’hyperglycémie permanente
Chapitre IV : Résultats
1. Standardisation de la posologie
2. Etudes phytochimiques
Réactions de caractérisation
Dosages
3. Extractions
4. Chromatographie en phase gaz gazeuse
5. Chromatographie sur couche mince
6. Tests biologiques
Activité antioxydante
Activités sur la glycémie de base
Test sur l’hyperglycémie temporaire
Diabète permanant
Chapitre V : Analyses et discussions
Chapitre VI : Conclusion
Bibliograghie
Annexes
Fiche signalitique

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