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Chimie de la molécule et de ses dérivés
Dans un premier temps, nous allons présenter la structure chimique des deux stérols les plus importants dans le contexte de cette thèse : le cholestérol et le coprostanol en lien avec leurs propriétés métaboliques.
Les stérols et la molécule de cholestérol
Il existe de nombreux stérols d’origine animale (le plus courant est le cholestérol) ou végétale appelés alors phytostérols (les plus courants sont le stigmastérol et le β sitostérol). Ce sont des composants biologiques indispensables à la compartimentalisation et donc à la vie cellulaire. La présence d’un groupement hydroxyle sur le carbone 3 du noyau stérane distingue les stérols des autres stéroïdes (figure 1). Le cholestérol (C27H46O) en particulier possède un noyau stérane hydrophobe et rigide couplé à un groupement hydroxyle hydrophile. Ses propriétés physico-chimiques lui confèrent une nature amphiphile et une orientation spécifique adaptée à son intégration dans les membranes cellulaires (Ohvo-Rekilä et al. 2002 ; Róg et al. 2009). En tant que composant principal des membranes cellulaires, il joue un rôle important dans l’organisation, la compartimentalisation et la signalisation cellulaire. Il est de plus un précurseur de plusieurs molécules importantes comme les hormones stéroïdiennes (progestérone, œstrogène, etc.), la vitamine D et les acides biliaires (Li & Chiang 2009 ; Bertolotti et al. 2012). Cependant, un taux de cholestérol sanguin élevé représente un facteur de risque important pour le développement des maladies cardiovasculaires (MCV) (Mendis et al. 2011). Chez l’être humain et les mammifères omnivores, le cholestérol peut provenir de deux origines : endogène par biosynthèse à partir de deux molécules d’acétyl-CoA ou exogène via l’alimentation avec un ratio de 70 :30 environ, ce ratio variant entre individus selon leur prédisposition génétique et l’apport alimentaire en cholestérol (Ikonen 2008).
La molécule de cholestérol, au-delà de son implication dans le développement des MCV, possède un rôle métabolique et physiologique important. Maintenant, nous allons nous intéresser à la molécule de coprostanol, second stérol d’intérêt dans ce projet de thèse.
La molécule de coprostanol
Le coprostanol, un autre stérol possède une composition très proche de celle du cholestérol : C27H48O. Ces deux hydrogènes supplémentaires (figure 1) confèrent des propriétés différentes au noyau stérane qui est moins rigide sans sa double liaison 5-6. Dès la fin du XIXème siècle, Bondzynski et Humnicki ont considéré ce composé comme une réduction du cholestérol par les bactéries de l’intestin des omnivores (Bondzynski & Humnicki 1896). Plus tard, cette hypothèse a été étoffée par le travail de Dorée et Gardner. En effet, ni le cholestérol ni ses dérivés ne sont retrouvés dans les selles d’animaux herbivores, à moins d’être administrés en tant que tels et dans ce cas ils sont retrouvés dans les fèces inchangés (Dorée & Gardner 1908). La conversion du cholestérol en coprostanol par les selles humaines a été reportée dès 1934 (Dam 1934). De plus, cette molécule a été retrouvée dans les fèces de plusieurs mammifères supérieurs notamment les babouins et les porcs (Rosenfeld & Hellman 1971). Le rôle biologique de ce composé n’a pas été identifié à ce jour.
Métabolisme du cholestérol chez l’hôte
Nous allons maintenant entrer dans le détail de l’origine du cholestérol chez l’humain. En fait, le cholestérol provient en moyenne à 70 % de la synthèse endogène et à 30 % de l’alimentation. Nous détaillerons ensuite le transport de cette molécule entre les différents organes et son élimination par la voie entéro-hépatique et l’efflux trans-intestinal.
Synthèse endogène du cholestérol
La biosynthèse de cholestérol prend place principalement dans les hépatocytes et les entérocytes bien que toutes les cellules nucléées du corps soient capables de le synthétiser (Ikonen 2008).
La majorité de ces réactions prennent place dans le réticulum endoplasmique (RE). Le cholestérol est alors associé à des triglycérides et à une apolipoprotéine (apoB100) pour former les VLDL (Very Low Density Lipoprotein), riches en cholestérol. Les VLDL empruntent ensuite le circuit des vésicules de l’hépatocyte pour rejoindre l’appareil de Golgi et être finalement excrétées dans le système circulatoire. Cette circulation a pour but de délivrer le cholestérol aux organes périphériques. En plus du sang, du cholestérol est sécrété par le foie dans le duodénum par l’intermédiaire de la bile.
Bien que cette synthèse représente généralement la majeure partie de l’apport de cholestérol au corps humain, le cholestérol contenu dans l’alimentation rejoint également le pool de cholestérol du corps humain. Celui-ci nous intéresse dans le contexte de l’étude de l’effet du microbiote intestinal sur la cholestérolémie .
Apport exogène et absorption intestinale du cholestérol
Le cholestérol exogène provient de l’alimentation. Chaque jour, le régime alimentaire humain de type occidental apporte de 200 à 600 mg de cholestérol (Charlton-Menys & Durrington 2008 ; Kruit et al. 2006). Lorsque ce cholestérol atteint l’intestin grêle et en particulier sa partie proximale appelée duodénum (figure 3), il rencontre les sels biliaires sécrétés par le foie. Ces molécules vont permettre la solubilisation du cholestérol sous forme de micelles. Les transporteurs protéiques trans membranaires appelés Niemann-Pick C1-like 1 (NPC1L1) présents à la surface apicale des entérocytes vont alors prendre en charge le cholestérol. Bien que les mécanismes précis du transport du cholestérol de la membrane plasmique au RE ne soient pas bien décrits, il semblerait qu’une fois entré dans la cellule, le cholestérol soit rapidement estérifié. Cette réaction est catalysée par l’enzyme acyl-coenzyme A:cholestérol acyltranférase-2 (ACAT2) et permet de rendre le cholestérol plus soluble et donc plus facile à transporter. Il est ensuite associé à des triglycérides et à une apolipoprotéine (apoB48) dans le RE formant ainsi les chylomicrons (CM). Puis, ceux-ci sont sécrétés dans la lymphe en suivant le système endomembranaire de la cellule (Charlton-Menys & Durrington 2008 ; Kruit et al. 2006 ; Ikonen 2008).
Le cholestérol venu de la synthèse dans le foie ou de l’alimentation doit être transporté du foie vers les organes et de l’intestin vers le foie et les tissus périphériques. La molécule étant amphiphile, son transport nécessite des transporteurs particuliers, appelés lipoprotéines qui circulent dans le sang.
Le transport du cholestérol dans l’organisme : les lipoprotéines
Le transport du cholestérol au sein de l’organisme est dû principalement à la circulation dans le sang et dans la lymphe de macromolécules appelées lipoprotéines. Elles sont formées de lipides et d’apolipoprotéines liées de manière non covalente. Leur composition précise varie en fonction de leur origine et de leur rôle. Les VLDL et les CM formées respectivement après la synthèse du cholestérol par le foie et après l’absorption intestinale sont riches en cholestérol. En circulant dans le sang, ces lipoprotéines vont échanger des composés (cholestérol, triglycérides, phospholipides, etc.) avec les organes et les tissus mais aussi entre elles. Les VLDL deviennent des IDL (Intermediate Density Lipoprotein) puis des LDL (Low Density Lipoprotein) lorsque leur quantité de cholestérol devient plus importante que celle des triglycérides. Les CM deviennent quant à eux des CM remnants (CMr). LDL et CMr viennent se fixer sur les récepteurs aux LDL (LDLr) du foie. Ils sont ensuite internalisés et dirigés vers le RE. Le cholestérol et les autres composés intéressants (acides gras et acides aminés) sont recyclés et associés à l’apoprotéine A1 (apoA1) pour former les HDL naissantes (High Density Lipoprotein) (Ikonen 2008). Cependant, en cas de forte concentration sanguine de LDL, celles-ci peuvent subir des modifications (et notamment une oxydation) qui vont provoquer leur dépôt à des sites anormaux comme les artères par exemple. Les LDL ainsi modifiées vont s’accumuler dans la paroi des vaisseaux sanguins et initier la formation de plaques d’athérome. Celles-ci sont les marqueurs de l’athérosclérose. En cas de rupture, elles peuvent provoquer l’obstruction des vaisseaux sanguins ou la formation de caillots menant à l’apparition clinique de l’athérosclérose : les MCV .
Les HDL naissantes sont synthétisées principalement par les hépatocytes mais aussi par les entérocytes. Les tissus périphériques jouent également un rôle important dans le métabolisme du cholestérol et notamment son élimination. En effet, les HDL sont responsables du transport appelé « reverse » du cholestérol, ie des tissus vers le foie. Les HDL naissantes vont aller se charger en cholestérol auprès des tissus. Cet efflux de cholestérol se fait grâce au transporteur ATP-Binding Cassette transporter (ABC) type A1 (ABCA1) exprimé de manière ubiquitaire au niveau des membranes de toutes les cellules. Ils contrôlent l’association du cholestérol à l’apolipoprotéine A1 lors du transfert du cholestérol vers les HDL (Oram & Lawn 2001). Un second transporteur ABC, de type G1 (ABCG1), semble agir en synergie avec ABCA1 pour charger les HDL en cholestérol (Gelissen et al., 2008 et Vaughan et al., 2009). Comme toutes les autres lipoprotéines, les HDL retournent au foie où elles sont reconnues par le récepteur scavenger receptor B-1 (SRB1). Les HDL sont pauvres en cholestérol et peuvent échanger des composants avec les CM et les VLDL grâce à différentes enzymes impliquées dans le métabolisme du cholestérol (Ikonen 2008).
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Table des matières
1. Introduction
2. Revue bibliographique
2.1 Le cholestérol
2.1.1 Chimie de la molécule et de ses dérivés
2.1.2 Métabolisme du cholestérol chez l’hôte
2.2 Le microbiote intestinal
2.2.1 Les caractéristiques du microbiote intestinal
2.2.2 Les animaux axéniques comme modèle expérimental
2.2.3 Influence du microbiote intestinal sur l’hôte
2.3 Activités du microbiote intestinal ayant un impact sur la cholestérolémie de l’hôte
2.3.1 Mise en évidence du lien entre le microbiote intestinal et la cholestérolémie
2.3.2 La transformation des acides biliaires
2.3.3 La transformation du cholestérol en coprostanol
3. Hypothèses et objectifs d’étude
4. Matériels et méthodes
4.1 Isolement et identification de souches réduisant le cholestérol en coprostanol
4.1.1 Isolement des souches commensales
4.1.2 Milieux utilisés pour la culture des souches commensales et l’identification de celles produisant du coprostanol
4.1.3 Identification des souches bactériennes produisant du coprostanol
4.1.4 Identification taxonomique des souches commensales nouvellement isolées
4.2 Les banques génomiques
4.2.1 Construction des banques génomiques
4.2.2 Vérification de la robustesse des banques génomiques
4.3 Criblage fonctionnel des banques génomiques
4.3.1 Mise au point du criblage : Choix du milieu
4.3.2 Criblage des banques génomiques
4.4 Etudes in vivo
4.4.1 Les animaux utilisés
4.4.2 Procédure 1 : Implantation de souches bactériennes produisant du coprostanol dans le tractus gastro-intestinal des souris axéniques
4.4.3 Procédure 2 : Investiguer les effets de la production de coprostanol sur le métabolisme du cholestérol de l’hôte
4.4.4 Méthodes utilisées
5. Résultats
5.1 Isolement de nouvelles souches transformant le cholestérol en coprostanol
5.1.1 Objectifs
5.1.2 Stratégie expérimentale
5.1.3 Résultats
5.1.4 Conclusions et perspectives
5.2 Criblage fonctionnel des deux banques génomiques de Bacteroides sp. D8 et Bacteroides sp. BV pour la production de coprostanol
5.2.1 Objectif
5.2.2 Stratégie expérimentale
5.2.3 Les deux banques construites sont suffisamment robustes pour être criblées
5.2.4 Criblage fonctionnel des banques génomique
5.2.5 Identification de 55 clones potentiellement positifs
5.2.6 Conclusions et perspectives
5.3 Résultats des expérimentations in vivo
5.3.1 Objectifs
5.3.2 Mesure de l’implantation et de la production de coprostanol chez les souris axéniques
5.3.3 Effet de la production de coprostanol par les bactéries du microbiote intestinal sur divers paramètres et notamment la cholestérolémie et le métabolisme du cholestérol
5.3.4 Conclusions et perspectives
6. Conclusion
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