Soutenance mémoire
Introduction
Le mot « probiotique » a été pour la première fois utilisé comme un antonyme au mot « antibiotique ». Il dérive du Grec et signifie « pour la vie » (Hamilton-Miler et al., 2003 ; Vasiljevic et Shah, 2008). Le concept des probiotiques a été proposé par Metchinikoff, un lauréat du prix Nobel en 1908. Il a été étonné par la très longue durée de vie des paysans Bulgares et a ensuite étudié leur mode de vie ainsi que leurs habitudes alimentaires. Ces paysans utilisaient de très grandes quantités de produits laitiers fermentés. Metchnikoff a postulé que les pathogènes présents dans l’intestin humain produisaient des molécules toxiques qui affaiblissent progressivement le corps. Les bactéries lactiques présentes dans le lait aigre défendent avec succès le corps des enteropathogènes présents (Valsiljevic et Shah, 2008).La principale description des probiotiques citée par Fuller (1992), les a définies en tant que « complément alimentaire microbien vivant qui affecte avantageusement l’animal hôte en améliorant son équilibre microbien intestinal ». Par contre, cette définition a été beaucoup plus applicable sur les animaux que les êtes humains. Une autre définition est généralement utilisée « les probiotiques sont des cultures uniques ou mixtes de microorganismes vivants qui pourraient avoir une incidence bénéfique sur l’hôte en améliorant les caractéristiques de la microflore indigène » (Holzapfel et al., 1998).L’Organisation mondiale de la Santé (OMS) et l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (FAO) ont donné une définition officielle des probiotiques qui sont des « micro-organismes vivants qui, lorsqu’ils sont ingérés en quantité suffisante, exercent des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels » (ONNUA/OMS, 2002).Certaines bactéries ont démontré des propriétés probiotiques, comprenant principalement des bactéries lactiques productrices d’acide lactique (Lactobacilli, Streptococci, Enterococci, Lactococci, Bifidobacteria), Bacillus, la levure Saccharomyces, et Aspergillus comme champignon (Shah, 2004). Ces groupes probiotiques trouvent une large application de nos jours à cause des produits synthétisés grâce à leur intervention ainsi que les propriétés antimicrobiennes et antioxydantes dont elles disposent (Shah, 2004).
Les cultures probiotiques sont exploitées commercialement comme un outil de développement de nouveaux produits fonctionnels. Il a été estimé la présence de 70 probiotiques dans les produits consommables dans le marché mondial (Shah, 2004). La consommation de probiotiques au sein des produits laitiers dans l’Amérique du nord, l’Europe et le Japon a augmenté de 12% depuis 2005. Les produits probiotiques sont devenus populaire au Japon, plus de 53 types de produits contenant des probiotiques ont inondé le marché international (Vasiljevic et Shah, 2008). Les bactéries lactiques produisent un nombre important de substances antimicrobiennes y compris les acides organiques, le peroxyde d’hydrogène, bactériocines et bactériocines-like. Les bactériocines sont des substances peptidique ou protéique, ayant une activité inhibitrice contre les souches bactériennes sensibles. Ces biomolécules confèrent un système de défense important à l’encontre d’autres microorganismes. Les bactériocines diffèrent des antibiotiques habituels car ils sont synthétisés ribosomiquement alors que les antibiotiques sont généralement des métabolites secondaires. Aussi, les antibiotiques inhibent les microorganismes par différents mécanismes comme l’inhibition de la synthèse du peptidoglycane, l’inhibition de la synthèse protéique ou en bloquant les promoteurs, etc., mais les bactériocines agissent généralement sur la membrane cellulaire en créant des pores et provoquant par la suite la fuite des ions K+, Na+ et les autres constituants cellulaires (Shah, 2004).
Caractéristiques physiques, chimiques et organoleptiques
Le lait de chamelle est de couleur blanche, en raison notamment de la structure et de la composition de sa matière grasse, relativement pauvre en β-carotène (Sawaya et al., 1984). Il est légèrement sucré, avec un goût acide, parfois même salé (Abdel-Rahim, 1987) et/ou amère (Ramet, 2003). Cette variabilité dans le goût est liée au type de fourrage ingéré ainsi qu’à la disponibilité en eau (Yagil et Etzion, 1980; Wangoh et al., 1998).Le pH du lait camelin se situe autour de 6,6 et l’acidité est de l’ordre de 15° Dornic. Sa densité oscille entre 0,99 et 1,034 avec une viscosité moyenne de 2,2 centipoises et un point de congélation variant de -0,53 à -0,61°C (Hassan et al., 1987). Les fluctuations qui existent dans les valeurs des constantes physicochimiques rapportées par différents auteurs sont liées aux teneurs variables des différents composants de ce lait (Mehaia et al., 1995 ; Wangoh et al., 1998), elles mêmes dépendantes des facteurs mentionnés plus haut : alimentation, rang et stade de lactation.Les teneurs en protéines et en matière grasse varient respectivement de 2,5 à 4% et de 1,1 à 4,6% (avec une fréquence élevée à des taux supérieurs à 3%), alors que la teneur en lactose fluctue entre 2,5 et 5,6%. Les concentrations élevées observées pour ce dernier nutriment expliqueraient la saveur parfois sucrée du lait de chamelle rapportée par plusieurs auteurs (Gnan et Shereha, 1986 ; Bayoumi, 1990).La teneur en eau du lait camelin, qui varie selon son apport dans l’alimentation, atteint son maximum pendant la période de sécheresse. En effet, il a été montré que la restriction en eau alimentaire des chamelles se traduit par une dilution du lait : un régime riche en eau donne un lait ayant un taux de 86% alors que dans un régime déficient, celui-ci s’élève à 91% (Yagil et Etzion, 1980 ; Faye et Mulato, 1991). Au niveau quantitatif, si la composition en macroéléments (Na, K, Ca, Mg…) est relativement similaire à celle du lait bovin, le lait camelin se caractérise néanmoins par des taux plus élevés en oligo-éléments (Yagil et Etzion, 1980 ; Sawaya et al., 1984 ; Elamin et Wilcox, 1992; Bengoumi et al., 1994 ; Mehaia et al., 1995 ; Gorban et Izzeldin, 1997).Le lait de chamelle se singularise par sa richesse relative en vitamines B3 (niacine) et en vitamine C. Même si des variations importantes (de 25 à 60 mg/l) de la teneur de cette dernière dans les laits camelin sont rapportés (Farah, 1993), il n’en demeure pas moins que des teneurs autour de 36 mg/l sont signalées (Farah et al., 1992) ; soit en moyenne 3 fois plus élevées que celles présentes dans le lait bovin, qui ne dépassent pas 22 mg/l (Mathieu, 1998). Cette caractéristique est particulièrement intéressante, car elle permet au lait de cette espèce, par son apport important en cette vitamine, de répondre aux besoins nutritionnels, aussi bien du jeune chamelon que des populations locales, qui vivent dans un environnement où l’apport en ce type de vitamine est particulièrement limité (Siboukeur, 2007).Farah (1993) signale que le lait camelin contient des teneurs plus faibles en vitamines A et E et en certaines vitamines du groupe B (vitamine B2, B5 et B9).
Une source de bactéries lactiques
Le lait referme inévitablement une microflore dont la nature et l’importance sont conditionnées par l’état sanitaire de l’animal, les conditions de traite, la température, la durée de conservation etc…Sous des conditions rigoureuses de collecte, sa charge ne dépasse cependant pas 5.103 germes /ml (Larpent et al., 1997). Si la microflore du lait bovin a fait l’objet de nombreuses études, cela est loin d’être le cas du lait camelin où quelques travaux seulement lui sont consacrés. L’une des raisons principales de cette carence est la relative absence des moyens matériels et humains (laboratoires, chercheurs…) tout près des lieux de collecte ce qui éviterait à recourir à la congélation ou à l’utilisation d’agents antimicrobiens, comme c’est généralement le cas des études physicochimiques. L’étude réalisée par Barbour et al (1984) met en évidence l’inhibition des bactéries pathogènes par le lait camelin. Al-Mohizea et al (1994), en s’appuyant sur la numération de quatre groupes de micro-organismes (la flore aérobie totale, les psychrotrophes, les coliformes et bactéries sporulantes) déduisent que la qualité hygiénique du lait camelin est satisfaisante. Yagil et al (1994) soutiennent que la pasteurisation du lait de chamelle n’est pas indispensable si tous les dromadaires du troupeau sont en bonne santé. L’activité antimicrobienne du lait de chamelle, due à la présence des protéines protectrices citées précédemment (Lysozyme, lactopéroxydase, lactoferrine…), serait responsable de cet état (Barbour et al., 1984). Dans ce contexte, d’autres auteurs ont montré l’effet inhibiteur du lysozyme extrait et purifié à partir du lait camelin, sur Escherichia coli et Micrococcus lysodeikticus en le comparant à celui de l’ovalbumine (Durhaiman, 1988).Dans le même ordre d’idée, l’efficacité de l’activité des protéines protectrices du lait de chamelle contre Lactococcus lactis subsp. cremoris, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium et rotavirus, a été également signalée (El-Sayed et al., 1992). Par ailleurs, on reconnaît depuis longtemps aux bactéries lactiques, la propriété de produire des substances antagonistes tels que les acides organiques (acide lactique et acide citrique), le peroxyde d’hydrogène et des protéines antimicrobiennes (Klaenhammer et al., 1994). Il est important de signaler que les acides aminés libres et les autres composés azotés non protéiques (NPN) dont le taux est plus élevé que dans le lait bovin, sont facilement dégradés par les microorganismes, particulièrement la flore bifidogène connue pour ses exigences en matière de facteurs de croissance. En effet, des travaux portant sur quatre espèces (Bifidobacteriu breve ; B. bifidum ; B. longum et B.angulatum), rapportent que le lait camelin est un excellent milieu de culture, naturel, pour les bifidobactéries. En outre, le stockage de ce lait à 4°C n’affecte pas leur viabilité et leur activité protéolytique est plus forte que dans le lait bovin. A cet effet,ces mêmes auteurs préconisent, l’utilisation de la poudre de lait camelin comme milieu de préculture de cette flore à haut potentiel nutritionnel et thérapeutique (AbuTarboush et al., 1997).
Bactéries lactiques
Les bactéries lactiques acidifiantes sont un groupe de bactéries à Gram-positif qui sont dépourvues de cytochromes et préfèrent les conditions anaérobiques, fastidieuses, productrices d’acide lactique et tolèrent l’acidité, strictement fermentatives. Elles sont non mobiles et ne produisent pas de spores. Ce groupe comporte les formes rondes (Lactobacilli et Carnobacteria) et les cocci (Streptococci). Différentes espèces de bactéries lactiques acidifiantes (comme les genres Steptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Enterococcus, Vagococcus, Lactobacillus, Carnobacterium) se sont adapté afin de croitre dans différentes conditions environnementales. On les rencontre dans le tractus gastrointestinal de différents animaux, produits laitiers, le sol et sur la surface de certaines plantes (Ring et Gatesoupe, 1998). Bien que les bactéries lactiques acidifiantes ne soient pas dominantes comparant à la flore intestinal normal, plusieurs essais ont été entrepris pour induire leur dominance artificielle (Verschuere et al., 2000). Basé sur leur métabolisme carbohydraté, les bactéries lactiques acidifiantes sont divisées en deux groupes distincts. Le groupe homofermentaire qui utilise le chemin de EmbdenMeyerhof-Parnas (Glycolytique) pour transformer la source de carbone principalement en acide lactique. Le groupe hétérofermentaire quant à lui produit des quantités équimolaires de lactate, CO2, l’éthanol ou l’acétate à partir du glucose exploitant la voie phosphocétolase. Le groupe homofermentaire comprend Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus, Streptococcus. L’hétérofermentaire regroupe quant à lui Leuconostoc, Weisella (Vasiljevik et Shah, 2008)
Spectre d’activités antibactériennes
Les surnageants exempts de cellules DU10 donnent des halos d’inhibition autour des souches pathogènes indicatrices. Le diamètre d’inhibition le plus large obtenu est de 25 mm contre Listeria monocytogenes et L. innocua.Les résultats obtenus indiquent la capacité de Lactobacillus plantarum DU10 à inhiber les bactéries à Gram positif et à Gram négatif. Adeniyi (2006) avait utilisé le surnageant de culture de souches Lactobacillus pour prouver leurs efficacités contre les germes impliqués dans les infections urinaires. Similairement, la plantaricine 423 (Van Reenen,1998), et la plantaricine LP84 (Suma,1998) montrent une activité inhibitrice contre les souches pathogènes comme S. aureus et B. subtilis.La plantaricine 35d produite par la souche Lb. plantarum avait une forte action bactériocinogène contre S. aureus et L. monocytogenes (Messi et al., 2001). Lash (2005) avait décrit une bactériocine produite par Lb. plantarum ATCC 8014 qui inhibait S. aureus, E. coli, L. innocua et P. aeruginosa. Valenzuela (2008) avait décrit un peptide antimicrobien qui inhibe des bactéries pathogènes comme B. cereus, E. coli et S. enterica. Gong et Xie avaient reporté une Plantaricine MG produite par Lb. plantarum KLDSI 0391 qui inhibait plusieurs pathogènes à savoir L. monocytogenes, S. aureus, S. thyphimurium et E. coli. Xie (2011) quant à lui avait décrit une bactériocine active contre les souches de Lactobacillus, Listeria, Streptococcus et Pediococcus. La plantaricine LD1 produite par la souche Lactobacillus plantarum LD1 inhibait non seulement les souches apparentées mais aussi les autres souches à Gram positif et à Gram négatif comme S. aureus, P. aeruginosa, S. typhi comme décrit par Gupta (2014). La plantaricine Y produite par Lb. plantarum 510 reporté par Chen (2014), avait montré une forte activité antimicrobienne contre L. monocytogenes BCRC 14845.Le surnageant exempte de cellules de Lb. plantarum DU10 donnait des zones claires autour des souches pathogènes indicatrices. Le plus grand diamètre d’inhibition est de 25 mm et a été obtenu contre les souches Listeria monocytogenes et Listeria innocua
|
Table des matières
1. Introduction
2. Analyse bibliographique
2.1. Caractéristiques du lait de chamelle
2.1.1. Caractéristiques physiques, chimiques et organoleptique
2.1.2. Une source de bactéries lactiques
2.2. Bactéries lactiques
2.2.1. Classification des bactéries lactiques
2.2.1. Voies métaboliques
2.3. Composés antimicrobiens
2.3.1. Acides organiques
2.3.2. Peroxyde d’hydrogène
2.3.3. Composés phénoliques
2.3.4. Acides gras
2.3.5. Dioxyde de carbone
2.3.6. Diacétyle (2,3-butanedione)
2.3.7. Antibiotiques
2.3.8. Bactériocines
2.3.8.1. Classification
2.3.8.2. Génétique des bactériocines
2.3.8.3. Biosynthèse des bactériocines
2.4. Lactobacillus plantarum comme modèle
2.4.1. Classification
2.4.2. Diversité génétique
2.4.3. Production de bactériocines
2.4.4. Rôle dans l’industrie agroalimentaire
2.5. Effets préventifs et curatifs des probiotiques
3. Matériel et méthodes
3.1. Collecte du lait de chamelle
3.2. Isolement, purification et identification des bactéries lactiques
3.2.1. Caractérisation phénotypique
3.2.1.1. Gram et morphologie
3.2.1.2. Production de catalase
3.2.1.3 Tests d’identification biochimique
3.2.2. Caractérisation moléculaire
3.2.2.1. Extraction et Purification de l’ADN génomique
3.2.2.2. Electrophorèse sur gel d’agarose
3.2.2.3. PCR des génomes collectés
3.2.2.4. Séquençage du produit PCR des souches
3.2.2.5. Soumission de la séquence à GenBank
3.3. Propriétés probiotiques de la souche sélectionnée
3.3.1. Activité gélatinase
3.3.2. Activité hémolytique
3.3.3.Tolérance à la bile
3.3.4. Capacité à réduire le cholestérol
3.3.5. Résistance à l’acidité
3.3.6. Production d’exopolysaccharides (EPS)
3.3.7. Spectre d’activité antibactérienne
3.4. Purification des bactériocines
3.4.1. Préparation de l’extrait bactériocinogénique
3.4.2. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS
3.4.3. Détermination du poids moléculaire par MALDI-TOF/MS
3.4.4. Détermination du N-terminal
3.5. Action de différents facteurs sur la production de la bactériocine
3.5.1. Effet de la température,
3.5.2. Effet du pH
3.5.3. Effet des enzymes
3.6. Optimisation des conditions de biosynthèse des bactériocines
3.6.1. Effet de la température
3.6.3. Effet du pH
3.6.3. Effet de la salinité
3.8.4. Effet du surfactant Tween 80
4. Résultats et discussions
4.1. Caractéristiques physico chimiques du lait collecté
4.2. Identification des souches
4.2.1. Obtention des isolats purs
4.2.2. Identification phénotypique
– Genre Lactococcus
– Genre Lactobacillus
4.2.3. Identification moléculaire
4.3. Caractéristiques de la souche sélectionnée
4.3.1. Caractérisation phénotypique
4.3.2. Tests d’identification biochimique
4.3.3. Antibiogramme
4.4. Propriétés probiotiques de la souche sélectionnée
4.4.1. Activité gélatinase et hémolytique
4.4.2. Tolérance à la bile
4.4.3. Capacité à réduire le cholestérol
4.4.4. Résistance à l’acidité
4.4.5. Production d’exopolysaccharides (EPS)
4.4.6. Spectre d’activités antibactériennes
4.5. Purification des bactériocines
4.6. Poids moléculaire des bactériocines
4.6.1. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide
4.6.2. Détermination du poids moléculaire par MALDI-TOF/MS
4.7. Séquençage du N-terminal
4.8. Action de différents facteurs sur la production de la bactériocine
4.8.1. Effet de la température
4.8.2. Effet du pH
4.8.3. Effet des enzymes
4.9. Optimisation des conditions de biosynthèse des bactériocines
4.9.1. Effet de la température
4.9.2. Effet du pH
4.9.3. Effet du NaCl
4.9.4. Effet du surfactant Tween
5. Conclusion
6. Références bibliographiques
7. Annexes
Télécharger le rapport complet
