Caractéristiques de la structure tertiaire des protéines

Caractéristiques de la structure tertiaire des protéines

La structure tertiaire d’une protéine correspond à sa structure tridimensionnelle d’ensemble, assemblage dans l’espaces des hélices α , feuillets β et autres éléments de la structure secondaire. Dans des conditions physicochimiques définies (par exemple, à l’intérieur d’une cellule), une protéine a normalement une structure tridimensionnelle fixée. Il faut noter que cette structure (en solution) n’est pas totalement rigide : la chaîne polypeptidique subit des mouvements thermiques et est susceptible de se déformer lors d’interactions avec d’autres molécules .

Quelles sont les bases énergétiques qui conduisent une protéine à prendre une structure tridimensionnelle bien définie ? Comme on l’a vu plus haut, en dehors des ponts disulfures qui jouent également un rôle dans la structure tridimensionnelle des protéines, la plupart de ces interactions sont de nature non covalentes. La plupart des types d’interactions non covalentes peut y jouer un rôle. En théorie, la simple connaissance de la structure primaire apportant la nature des acides aminés et leur enchaînement pourrait permettre de calculer ces interactions et de prédire ces structures. En pratique, bien que les progrès dans ce domaine soient constants [21], la détermination théorique ab initio d’une structure de protéine sans références expérimentales reste encore impossible de par la complexité du système. Les interactions non covalentes permettent toutefois d’expliquer quelques règles générales sur le repliement des protéines [2]. C’est ainsi que « l’intérieur » d’une protéine (c’est-à-dire la partie qui n’est pas accessible au solvant) consiste presque entièrement en résidus apolaires (les acides aminés aliphatiques et aromatiques). En revanche, la « surface » d’une protéine (c’est-à-dire les parties en contact avec le solvant) est constituée essentiellement des résidus polaires ou chargés, comme des lysines et des arginines. Ce partage est une conséquence des interactions hydrophobes  qui conduisent les résidus ayant des chaînes latérales apolaires à interagir entre eux plutôt qu’avec le solvant. En revanche, les résidus polaires peuvent former facilement des liaisons hydrogènes avec le solvant et sont donc plus susceptibles d’être localisés à la surface d’une protéine. La formation des liaisons hydrogènes intramoléculaires contribue essentiellement à la formation des éléments structuraux secondaires . La plupart des protéines présentent une structure plutôt globulaire, globalement sphérique [6]. On doit noter que cette structure tridimensionnelle est relativement stable et évolue seulement progressivement en fonction des conditions du milieu (pH, température, force ionique, etc.). Toutefois, au delà d’une certaine limite, la structure est brutalement altérée : la protéine est dénaturée et perd pratiquement toujours sa fonction.

Méthodes classiques pour l’étude de la structure tertiaire des protéines

Pour comprendre l’architecture d’une protéine en détail, l’idéal est de pouvoir déterminer la position exacte de chaque atome de sa structure. Deux méthodes sont particulièrement adaptée à cela : la cristallographie aux rayons X et la résonance magnétique nucléaire (RMN).

Cristallographie aux rayons X

Une protéine est trop petite pour être observée directement par microscopie optique puisque sa taille ne suffit pas à diffuser de la lumière dans les longueurs d’onde du « visible ». En revanche, les distances interatomiques dans une protéine (environ 1,5 Å) sont du même ordre de grandeur que la longueur d’onde des rayons X. La diffusion de rayons X par les atomes d’une protéine est donc possible. Dans un cristal régulier, les protéines forment un arrangement périodique, suivant des axes de l’espace tridimensionnel, de cellules unitaires définies comme étant le plus petit élément représentant le cristal entier. Des translations suivant les axes d’une cellule unitaire permettent de reconstituer l’ensemble du cristal. Chaque atome d’une protéine a donc exactement la même position dans toutes les cellules unitaires. Le cristal est ainsi composé de plans d’atomes. Ces plans d’atomes, ou plutôt les nuages d’électrons correspondants, produisent un motif de diffraction lors de l’irradiation du cristal avec des rayons X [22]. Le motif de diffraction contient les informations sur la position de tous les atomes de la cellule unitaire. Il est donc possible par l’analyse de ce motif de calculer les angles de diffraction ainsi que les distances interatomiques pour reconstituer la structure moléculaire.

L’avantage principal de cette technique est sa haute résolution. Bien que la procédure de traitement des données soit relativement complexe, la cristallographie aux rayons X permet d’obtenir des informations très précises sur la structure moléculaire des protéines, souvent à résolution atomique (≤ 1,2 Å) [23]. A des résolutions encore plus élevées (≤ 0,8 Å), les atomes d’hydrogène deviennent visibles et les atomes ne peuvent plus être considérés comme des sphères à cause de la déformation des nuages électroniques. Une telle visualisation des électrons permet de déterminer la distribution des charges et la polarisation des liaisons [24]. On obtient ainsi une image très détaillée de la structure d’une protéine.

Toutefois, la technique présente des inconvénients. En premier lieu, il est souvent difficile d’obtenir des cristaux avec une taille suffisante pour la cristallographie. Il est donc nécessaire de produire des quantités non négligeables de protéine pour trouver des conditions optimales de cristallisation. Il faut également disposer de plusieurs cristaux identiques car ils sont souvent dégradés en présence des rayons X (par chauffage ou par des radicaux libres). On peut s’interroger sur la possibilité d’obtenir des informations dynamiques à partir d’une structure forcément statique (le cristal). La réponse dépend surtout de la nature de la dynamique en question : s’il s’agit d’une dynamique sans mouvements à grande échelle, il est possible de caractériser des événements dynamiques. Par exemple, il est possible d’étudier une voie métabolique en piégeant des états intermédiaires. On peut également soit piéger des espèces non stables [25], soit utiliser des méthodes à résolution temporelle [26]. En revanche, les mouvements à grande échelle sont pratiquement toujours bloqués dans le cristal.

Spectroscopie RMN

La spectroscopie RMN est la deuxième méthode principale pour l’étude de la structure tridimensionnelle des protéines. Elle est basée sur l’absorption de la radiation à fréquence radio par des noyaux atomiques. Les niveaux d’énergie de spin des noyaux sont séparés dans un champ magnétique (effet Zeeman). Sous l’effet d’une radiofréquence, chaque noyau d’une molécule va résonner à une fréquence spécifique (fréquence de Larmor). Chaque noyau d’une protéine a sa propre fréquence de Larmor, qui dépend de l’environnement local du noyau (par exemple protection par des champs magnétiques locaux). Un spectre RMN contient ainsi des pics correspondants aux résonances de tous les noyaux de l’échantillon, chacun avec une fréquence (caractérisée par le déplacement chimique δ) caractéristique de son environnement chimique. De plus, la surface sous un pic est proportionnelle au nombre des noyaux résonnant à cette fréquence, ce qui permet de quantifier les résidus identifiés et caractérisés.

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Table des matières

Partie I : Introduction générale
I.1 Interactions non covalentes dans les protéines
I.1.1 Interactions ioniques
I.1.2 Interactions de type dipolaire
I.1.2.1 Interactions ion-dipôle
I.1.2.2 Interactions dipôle-dipôle
I.1.2.3 Dipôles induits
I.1.2.3.1 Interaction ion-dipôle induit
I.1.2.3.2 Interaction dipôle-dipôle induit
I.1.2.3.3 Interactions de van der Waals
I.1.3 Liaisons hydrogènes
I.1.4 Interactions hydrophobes
I.1.5 Conclusions
I.2 Structure des protéines
I.2.1 Structure primaire
I.2.2 Structure secondaire
I.2.2.1 Caractéristiques de la structure secondaire
I.2.2.2 Méthodes spectroscopiques pour l’étude de la structure secondaire
I.2.2.2.1 Dichroïsme circulaire
I.2.2.2.2 Spectroscopie infrarouge (IR)
I.2.2.2.3 Spectroscopie de fluorescence
I.2.3 Structure tertiaire
I.2.3.1 Caractéristiques de la structure tertiaire des protéines
I.2.3.2 Méthodes classiques pour l’étude de la structure tertiaire des protéines
I.2.3.2.1 Cristallographie aux rayons X
I.2.3.2.2 Spectroscopie RMN
I.2.4 Structure quaternaire
I.2.4.1 Caractéristiques de la structure quaternaire des protéines
I.2.4.2 Méthodes classiques pour l’étude de la structure quaternaire des protéines et des macroassemblages
I.2.4.2.1 Chromatographie d’exclusion stérique
I.2.4.2.2 Diffraction aux petits angles (SAXS)
I.2.4.2.3 Microscopie électronique
I.3 Interactions protéine-ligand
I.3.1 Introduction aux interactions non covalentes protéine-ligand
I.3.2 Méthodes d’études des interactions protéine-ligand
I.3.2.1 Méthodes thermochimiques
I.3.2.1.1 Analyse calorimétrique par dosage isotherme (ITC)
I.3.2.1.2 Analyse calorimétrique différentielle (DSC)
I.3.2.2 Méthodes spectroscopiques
I.3.2.2.1 Fluorimétrie
I.3.2.2.2 RMN
I.3.2.2.3 Résonance de plasmons de surface
I.3.2.3 Autres méthodes
I.3.2.3.1 Electrophorèse capillaire d’affinité
I.3.2.3.2 Dialyse à l’équilibre
I.4 Etudes des complexes non covalents par spectrométrie de masse
I.4.1 Généralités de l’electrospray des protéines
I.4.2 Etudes des complexes protéine-ligand par spectrométrie de masse
I.4.2.1 Observation du complexe
I.4.2.2 Détermination des constantes d’interaction
I.4.3 Etudes structurales des complexes protéiques par spectrométrie de masse
I.4.3.1 Mesure de masse des complexes protéiques
I.4.3.2 Etude de la structure des complexes protéiques
I.4.3.3 Etude de la dynamique structurelle des complexes protéiques
I.5 Conclusion
I.6 Bibliographie
Partie II : Etude des complexes protéine-ligand intacts par spectrométrie de masse
II.A Déconvolution des interactions spécifiques et non spécifiques
II.A.1 Remarques générales
II.A.2 Abstract
II.A.3 Introduction
II.A.4 Experimental
II.A.4.1 Materials
II.A.4.2 Mass spectrometry
II.A.4.3 Deconvolution model
II.A.5 Results and discussion
II.A.6 Conclusions
II.A.7 References
II.B Influence des paramètres expérimentaux sur les constantes de dissociation
II.B.1 Introduction
II.B.2 Interaction entre CK et ses ligands dans différents tampons
II.B.2.1 Etats de charge
II.B.2.2 Interaction CK-ADP ou CK-ATP dans différents tampons
II.B.3 Interaction CK-ligand à différents pH
II.B.4 Comparaison des constantes obtenues par différents techniques
II.B.5 Conclusions
II.B.6 Bibliographie
Partie III – Développement de méthodes pour l’étude de la structure des protéines
III.A Fragmentation des protéines entières dans la cellule ICR par dissociation par capture d’électrons
III.A.1 Introduction
III.A.2 Matériel et méthodes
III.A.3 Fragmentation de l’ubiquitine
III.A.4 Fragmentation de la myoglobine
III.A.5 Conclusions
III.A.6 Bibliographie
III.B Modification des protéines par le diéthylpyrocarbonate (DEPC)
III.B.1 Introduction
III.B.2 Réactivité du DEPC
III.B.2.1 Identification des peptides modifiés
III.B.2.2 Identification des sites de modification
III.B.2.3 Modifications non spécifiques
III.B.3 Etude des protéines par modification chimique : approche « bottom-up »
III.B.3.1 Modification de la myoglobine intacte par le DEPC
III.B.3.2 Identification des sites de modification par l’approche « bottom-up »
III.B.4 Etude des protéines par modification chimique : approche « top-down »
III.B.4.1 Identification des sites de modification par une approche « top-down »
III.B.4.2 Détermination du pourcentage de modification
III.B.5 Comparaison des différents états structuraux des protéines par modification différentielle
III.B.5.1 Dénaturation et modification de la CK entière
III.B.5.2 Comparaison des peptides modifiés entre les deux formes
III.B.6 Conclusions
III.B.7 Bibliographie
Partie IV : Conclusion

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