SAAFA-76-MRRRCH
Caractérisation moléculaire des souches de Staphylococcus aureus isolées à partir de denrées alimentaires
Staphylococcus aureus
Les Staphylocoques ont été découverts dans le pus par Pasteur en 1880. En 1883, Ogston a créé le nom de «Staphylocoque » pour décrire ces grains (kokkos) groupés en amas irréguliers à la façon d’une grappe de raisin (staphylos). En 1884, Rosenbach a obtenu des cultures pures de ces bactéries. Il a scindé le genre Staphylococcus en deux groupes selon que les colonies étaient blanches ou dorées (Avril et al., 1992). Plus de 50 espèces et sous-espèces ont été décrites au début du 21ième siècle dont 17 identifiées chez l’homme. Le S. aureus apparait sous forme de cocci Gram positif de 0,5 à 1μm de diamètre, souvent regroupées par quatre ou en petits amas (grappes). Ce sont des bactéries immobiles, non sporulées et habituellement non capsulées. Elles sont aéro-anaérobies, cultivables facilement sur les milieux ordinaires. S. aureus peut également être cultivé en milieu sélectif salé (Chapman). Les colonies observées après 24 heures d’incubation sont lisses, opaques, convexes et présentent un bord net ; la pigmentation jaune à jaune-orangée n’est pas toujours apparente. Sur gélose au sang, les colonies sont souvent β-hémolytiques. Dans le domaine alimentaire, l’identification de S. aureussur gélose Baird-Parker enrichie au jaune d’œuf et au tellurite de potassium permet la révélation d’une part de la lécithinase par la présence d’un halo d’éclaircissement du jaune d’œuf et d’autres part la réduction du tellurite (colonies noires). De rares souches capsulées produisent des colonies d’aspect luisant pouvant devenir coulantes après plusieurs jours de conservation sur milieu gélosé. Globalement, l’espèce S. aureus peut être différenciée des autres staphylocoques par la présence de la coagulase, DNAse, catalase et par la fermentation du mannitol (Avril et al., 1992). I.1.2. Habitat II s’agit de germes ubiquitaires, les staphylocoques sont des bactéries commensales de la peau et des muqueuses de l’homme et des animaux (Quinn et al., 2011 ; Nagase et al.,2001). Chez l’homme, les staphylocoques en particulier les espèces S. aureus et S. epidermidis, font partie de la flore résidente cutanée de nombreux individus qui sont des «porteurs asymptomatiques». Ils jouent un rôle important dans l’équilibre physico- CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 5 chimique de la peau et constitue une barrière de colonisation, empêchant l’implantation de bactéries de la flore transitoire (Hirsh et al., 2004 ; Wylie et al., 2005). Cependant, l’habitat préférentiel de S. aureus chez l’homme est la muqueuse nasale. Il existe 3 statuts de portage nasal de S. aureus : Environ 20% de la population est porteuse de manière permanente (porteurs persistants), environ 60% sont porteurs de manière intermittente, avec des souches qui varient au cours du temps, et 20% ne sont pratiquement jamais porteurs (Eveillard, 2007). La distinction entre porteurs permanents et intermittents est importante. En effet, les porteurs permanents ont une densité bactérienne plus élevée et un risque plus important d’infection. De plus, les techniques de typage moléculaire ont montré que les porteurs persistants sont souvent colonisés avec la même souche alors que les porteurs intermittents sont colonisés, à différents moments, avec des souches génétiquement différentes (Vandenbergh et al., 1999). Les mécanismes impliqués dans le portage nasal sont encore mal compris. Ils font intervenir des facteurs liés à l’hôte, des facteurs bactériens et des facteurs environnementaux (Kluytmans et al., 1997 ; Nouwen et al., 2001). Les S. aureus sont présents également sur les membranes muqueuses du tractus respiratoire ainsi que le tractus urogénital et comme flore transitoire dans le tractus digestif (Quinn et al., 2011). Ces bactéries survivent et prolifèrent du fait de leur particulière résistance aux conditions hostiles de l’environnement, tels que la dessiccation (ils survivent plusieurs mois dans des produits pathologiques desséchés), aux variations de température (ils résistent 2 h à 55° C, voire 1 h à 60° C), au choc osmotique (salinité de l’eau) et résistent encore mieux en milieux albumineux (Breche et al., 1988). Ils sont largement disséminés dans l’environnement, retrouvés dans le sol, les poussières (l’air), l’eau et dans certains produits alimentaires (laitages, conserves salées) (Bronner et al., 2004).
Position taxonomique et classification
Selon la classification de Garrity et al. (2007) ; Le genre Staphylococcus appartient au phylum des Firmicutes constitué de quatre classes : Clostridia, Mollicutes, Bacilli, Togobacteria. La classe des Bacilli est constituée de deux ordres: Bacillales et Lactobacillales, dont chacun est divisé en quatre familles; Staphylococcaceae constitue la 4ème famille des Bacillales, celle-ci comprend un seul genre: Staphylococcus (GC% 30-39%). Le genre Staphylococcus occupe une place très importante en pathologie humaine et animale. La taxonomie du genre Staphylococcus a subi plusieurs remaniements successifs grâce au développement du séquençage d’ARNr 16S, on distingue plus de quarante espèces de Staphylococcus (Alomar, 2007). Un certain nombre d’entre elles sont trouvées chez l’homme, d’autres sont présentes chez les animaux ou dans les aliments (viandes, produits laitiers, etc…) (Avril et al., 1992 ; Quinn et al., 2011). Parmi les espèces retrouvées chez l’homme, trois espèces occupent une place privilégiée : S. aureus, S. epidermidis et S. saprophyticus, les autres sont rarement impliquées en pathologie humaine. Le genre Staphylococcus est séparé en deux groupes sur la base de la présence de la coagulase (Alomar, 2007). Le groupe des Staphylococcus à coagulase négative avec 33 espèces dont la majorité ne présente pas de risque sanitaire telles que Staphylococcus xylosus Staphylococcus lentus, Staphylococcus sciuri isolés de lait ou de fromage (Morea et al., 1999 ; Blaiotti et al., 2004). D’autres espèces telles que Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus sont impliquées dans les infections nosocomiales (Freney et al., 1999).
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Table des matières
Liste des abréviations
Liste des tableaux
Liste des figures
Liste des annexes
Introduction
Chapitre I : Etude bibliographique
I.1.Staphylococcus aureus
I.1.1.Généralité
I .1.2.Habitat
I.1.3.Position taxonomique et classification
I.1.4. Résevoir
I.2. L’espèce Staphylococcus aureus : agent pathogène
I. 2.1. Caractères morphologiques
I.2.2. Caractères biochimiques
I.2.3. Caractères culturaux
I.2.4. Pouvoir pathogène de S. aureus
I.2.4.1. Facteurs de virulence
I.2.5. Types d’infections
I.2.5.1. Infections suppuratives
I.2.5.2. Infections toxiques staphylococciques
I.3. Notion génétique de S. aureus
I.3.1. Génome
I.3.2. Support génétique de la virulence
I.4. Éléments génétiques mobiles chez S. aureus
I.4.1. Bactériophages
I.4.2. Ilots de pathogénicité
I.4.3. Transposons
I.4.4. Plasmides
I.5. Resistance aux antibiotiques des S. aureus
I.5.1. Origine de l’antibioresistance
I.5.2. Mécanismes de l’antibiorésistance
I.5.2.1. Résistance à la pénicilline
I.5.2.2. Résistance à la méticilline
I.5.2.3. Résistance aux aminosides
I.5.2.4. Résistance aux glycopeptide
I.5.2.5. Résistance aux Macrolides, Lincosamides, Streptogramine (MLS
I.5.2.6. Résistance aux fluoroquinolones
I.5.2.7. Autres résistances
I.6. Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM
I.6.1. SARM d’origine hospitalière
I.6.2. SARM d’origine communautaire
I.6.3. Les SARM d’origine animale
1.6.3. 1.Génotype et phénotype de résistance aux antibiotiques des LA-MRSA
I.6.4.Cassette SCCmec
Chapitre II : Matériel et méthodes
II-1. Objectifs
II-2. Lieu de l’étude
II-3. Nature des échantillons
II-4. Méthodologie
II-4.1. Méthode de prélèvement
II-4.1.1.Viande fraiche
II-4.1.2. Lait de vache cru
II-4.1.3. Lait de vache pasteurisée conditionné
II-4.1.4.Pâtisseries
II-4.1.5. Plats cuisinés
II-4.2. Transport et conservation des échantillons
II-4.3. Traitement des échantillons
II-4.4. Préparation des échantillons
II-4.4.1. Prise d’essai, suspension mère
II-4.4.2. Recherche des Staphylococcus aureus
II-4.4.2.1. Isolement
II-5. Identification des souches de Staphylococcus aureus
II-5.1. La spectrométrie de masse MALDI-TOF
II.6. Etude de la sensibilité aux antibiotiques
II.6.1. Test de criblage des SARM sur gélose à l’oxacilline
II-6.2. Antibiogramme selon le comité de l’antibiogramme de la société française de
microbiologie (CA-SFM
II-7. Détermination des concentrations minimales inhibitrices
II-8. Recherche moléculaire des gènes
II-8.1. L’extraction de l’AND
II-8.2. Extraction par l’appareil QIAGEN
II-8.3. Polymerase Chain Réaction (PCR) en temps reel
II-8.4. Recherche moléculaire des gènes de résistance
II-8.5. Le typage des cassettes staphylococcal mec chromosomique
II-8.6. Recherche moléculaire des gènes de virulence
II-8.7. Recherche moléculaire des sous-types de la cassette SCCmec IV
Chapitre III : Résultats et discussion
III-1. Prélèvements
III-2. Cultures des prélèvements
III-3. Identification de Staphylococcus spp à partir des cultures positives
III-4. Identification de l’espèce S. aureus
III-4.1. Identification par Galerie API stph
III-4.2. Identification et typage par MALDI-TOF-MS
III-5. Répartition des souches de S. aureus selon la nature des prélèvements
III-6. Test de sensibilité aux antibiotiques
III-7. Détermination des supports génétiques de la résistance
III- 7.1. Détection moléculaire des gènes codant pour les genes mecA et mecC
III-7.2. Typage moléculaire des cassettes SCCmec
III-8. Détermination des supports génétiques de la virulence
Conclusion
Références bibliographiques
ARTICLES SCIENTIFIQUES
ANNEXES
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