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Force : une absence de consensus
Il semble établi dans la littérature C-AFM que la rupture azote-or se situe entre 0.5 et 0.7 nN pour des amines primaires, et que cette valeur est susceptible d’augmenter lorsque l’azote est inclus dans un cycle (bipyridine) jusqu’à un facteur 3. Sa mobilité entraîne une dépendance de la force avec le degré de coordination de l’atome d’or ainsi que sa géométrie au moment de la rupture, induisant différents canaux de conductance d’élevée (H) pour une force comprise entre 1.5 et 1.8 nN, à faible (L) à 0.8 nN. De façon assez troublante, l’article de Gaub révèle dans des expériences de contrôles réalisées sur PEG couplé à l’adénosine (nucléotide représenté dans le tableau, fonctionnalisation à l’EDC – 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) et couplé à la thymidine (nucléotide ne présentant aucune amine primaire) que seule l’amine primaire de l’adénosine interagit avec l’or, interaction qu’il quantifie à 170 pN [57]. D’une part, la liaison N-Au pour les amines primaires rompt à une valeur qui diffère de plus d’un facteur 4 avec les valeurs avancées en C-AFM. D’autre part, lorsqu’inclus dans un cycle, leur expérience semble montrer que l’azote ne présente aucune interaction, ce qui contredit à nouveau les valeurs avancées en C-AFM sur la bipyridine.
Implication du solvant : Un raffinement supplémentaire est apporté par la même équipe [6] où une valeur de force à 145 pN est avancée à pH 8. Une étude en fonction du pH est également conduite [57] et montre une sensibilité de la liaison N-Au à la protonation de l’amine primaire. Le pKa d’une amine primaire se situant autour de 8-9, ces auteurs ne rapportent aucune interaction à pH 5.5 où la forme NH+3 ne présentant pas de paire d’électrons disponible ne peut former de liaison un atome d’or, et une augmentation des interactions à pH 8.5. L’auteur précise que cette valeur de force est cohérente avec de précédentes calculs DFT estimant l’énergie de la liaison Au-N à 32-42 kJ/mol pour une distance de liaison de 0.3 nm, ce qui correspond à une force d’environ 185 pN [59], [60]. A nouveau, l’absence de contribution des azotes inclues dans le cycles au niveau de l’adénosine (au nombre de trois) est assez troublant en regard des forces, parfois supérieures à 1.5 nN, obtenues sur la bipyridine (BPY) dans les expériences C-AFM, et confirmées par trois équipes ayant elles-mêmes observé des forces de rupture à 1.5 nN sur les jonctions S-Au. A notre connaissance, aucune étude ne fait état d’une estimation par spectroscopie de force d’une ou plusieurs barrière(s) d’activation énergétique par variation de la vitesse de charge.
Conclusion : Les valeurs de cette étude montrent qu’aucun consensus au niveau de la rupture N-Au n’est établi. Sa valeur dans le cas d’une amine primaire est inférieure à la rupture Au-Au, car la liaison est de nature donneur-accepteur et est de fait moins robuste que la liaison partiellement électrostatique/covalente S-Au, ou métallique Au- Au. Des paramètres tels que les constantes de raideurs peuvent être écartés dès lors que les études sur jonction S-Au ont déjà montré une stabilité de la liaison sur une large gamme de leviers. De même, les vitesses de charge sondées semblent indiquer une indépendance de la mesure à ce facteur. La contribution du solvant est en revanche à prendre en compte. La capacité de l’amine primaire à former de faibles liaisons hydrogènes en milieu aqueux, inexistantes en solvant organique aprotique pourrait suggérer une sensibilité de la force de rupture au solvant. L’hypothèse d’un réarrangement de la cage d’eau à proximité des groupements amines au moment de la rupture est à considérer. Cette hypothèse serait également en accord avec les résultats pour la jonction S-Au sur laquelle a priori, le passage solvant protique/aprotique n’avait que peu d’impact sur la valeur de force. Des expériences réalisées à la fois en milieu protique et aprotique, avec variation de pH devraient nous permettre de vérifier l’implication du solvant et la reproductibilité de ces valeurs. A notre connaissance, aucune étude ne fait état d’une estimation par spectroscopie de force d’une ou plusieurs barrière(s) d’activation énergétique par variation de la vitesse de charge.
Implication du groupement carboxylique : L’acide carboxylique est un des groupements terminal du peptide. La seule référence répertoriant cette interaction avec l’or en C-AFM [46] rapporte une force de rupture à 0.6 ± 0.1 nN pour une conductance à 10−3G0 dans le tetradecane. Cette étude constitue la seule sur cette liaison à notre connaissance.
Cas particulier des peptides
Dans les phénomènes de transport en régime tunnel cohérent et hors-résonance, il a été montré que la résistance R d’une jonction dépend exponentiellement de sa dimension selon l’axe de transport, autrement dit de la longueur de chaîne pour une jonction moléculaire, selon [61] : R = R0 exp S (III.1).
où R0 est une résistance de contact effective contenant les informations sur la nature du contact électrode-molécule formé, est le facteur de structure ( = 0.85 °A−1 sur alcanedithiol [4]), dépendant du type de liaisons dans la molécule et des groupements fonctionnels et S la longueur de la molécule. La dépendance de la conductance avec les dimensions de la molécule étant établie, les jonctions de dithiols ou diamines comprenant plus de 8 carbones sont rarement étudiées, car les courants mesurés sont alors très faible. Néanmoins, nous rapportons dans des mesures réalisées sur decanedithiol ayant donné une conductance de G = 5.7 10−6G0, soit pour une tension de 0.1 V avec G0 = 77.5 μ S un courant de 44.2 pA [19]. Le niveau de bruit électronique de notre installation en C-AFM sur la gamme de mesure [0-10] nA est inférieur 10 pN, et sur le STM à 15 pA pour un gain de 109. Pour les jonctions soufre-or, 10 carbones suffisent à s’extraire de bruit électronique d’un facteur 4. Cela correspond pour le decanedithiol à une longueur soufre à soufre de 1.49 nm. Ces longueurs de transport sont atteintes pour un polypeptide de 4 acides aminés, ce qui contraint notre étude.
Cependant, des études ont pourtant révélé qu’il était possible de mesurer la conductance d’un polypeptide de 12 acides aminés sur une séquence H(EL)5C (H : histidine, E : acide glutamique, L : lysine, C : cystéine) [7]. Ces plateaux de conductance, observés à 1.7 nS sur la figure III.4, un ordre de grandeur comparable à celui de l’heptanedithiol, à un pH de 2, n’étaient plus présent à pH neutre. Les mesures de dichroïsme circulaire ont permis d’apporter une explication à ce constat : à pH 2, le polypeptide présentait une structure alpha-hélicoïdale tandis qu’à pH neutre, la structure était majoritairement en enroulement aléatoire partiellement déplié. En hélice , la dimension du peptide se réduit à 2.2 nm. Il a été donc suggéré que la structure avait une influence sur le mode de transport, et qu’en configuration hélicoïdale, le transfert électronique s’opérait via des mécanismes de saut d’électron (hopping) par l’intermédiaire des groupements amides. Ainsi, des dimensions de peptide supérieures à 2 nm sont caractérisables à condition qu’une structure favorisant le transport à plus courte échelle puisse avoir lieu.
Préparation des substrats
Les surfaces sont préparées par dépôt thermique d’or (99.999 % de pureté) sur des feuillets de mica clivés, dans un évaporateur sous un vide secondaire (PFEIFFER PLS 500). Des épaisseurs de dépôt de 100 nm ± 15 peuvent être ainsi obtenues à une vitesse dépôt de 1 Å/s et une pression de P = 2.10−6 à 9.10−6 mbar durant le dépôt. L’épaisseur est contrôlée par une microbalance à quartz Maxtek (TM- 400).
L’avantage du mica est multiple : des surfaces planes peuvent être obtenues par simple clivage des feuillets de mica, et le dépôt d’or pouvant croître dans la continuité du plan du mica, il ne nécessite pas une couche intermédiaire de chrome. Les surfaces subissant un traitement thermique lors de leur nettoyage, l’absence de chrome empêche une contamination de la couche d’or par diffusion de chrome dans celle-ci. Avant l’étape de fonctionnalisation, les échantillons sont nettoyés par ozonolyse (UV/O3), rincés à l’éthanol absolu, séchés sous jet d’azote, puis recuits à la flamme. Cette dernière étape permet d’élargir les domaines d’or (111) par réarrangement des plans atomiques et réduction des défauts de surface.
Pointes STM/TERS
En STM-BJ, les dimensions de l’apex conditionnent en grande partie la reproductibilité du contact atomique. De faibles rayons de courbure sont préférables. Néanmoins par commodité, les pointes sont généralement conçues par clivage manuel, et travaillées jusqu’à ce que des plateaux à G0 reproductibles soient obtenus. Pour les mesures de topographie STM et TERS en revanche, un contrôle fin de l’apex est nécessaire. En STM de faibles rayons de courbure garantissent une meilleure résolution. En TERS, la pointe doit permettre l’exaltation du champ électrique local par la création d’un plasmon de surface polarisé.
Pour ce type d’expérience, les pointes sont conçues par dissolution électrochimique sur un montage à deux électrodes. Un fil d’or de 0.25 mm de diamètre est plongé dans une solution 50 :50 de HCl à 37 % et d’ethanol absolu. Dans ces proportions, une faible rugosité de surface au niveau de l’apex est attendue [69], [70]. Un anneau de platine cerclant la pointe est placé à l’interface air/liquide, de sorte à ce que la dissolution se produise au niveau du ménisque capillaire formé par la solution autour du fil. Des potentiels compris entre 1.5 et 2.4 V produisent des pointes de rayon de courbure inférieurs à 100 nm [69]. Le courant mesuré décroît au fil de la dissolution jusqu’à chuter à zéro. Les temps de coupure obtenus, généralement autour de 500 secondes, sont un premier indicateur de la qualité de la pointe.
Pointes C-AFM
Les pointes AFM utilisées sont des pointes commerciales multi-levier en nitrure de silicium composées de 4 leviers triangulaires et une poutre pour les MLCT/MSCT, et deux leviers triangulaires pour les DNP10. De sorte à réaliser une jonction électrique en C-AFM, elles sont ensuite métallisées par pulvérisation cathodique( Pfeiffer, PLS 500). Un première couche adhésive de chrome est déposée par évaporation thermique à 0.3 Å/s, soit une épaisseur entre 7 et 15 nm (P=2.10−6- 9.10−6 mbar). L’or est ensuite déposé par pulvérisation à un taux de 7-8 nm/min jusqu’à 60 nm/min pour les dépôts plus importants. Des épaisseurs de 30 nm sont obtenues. L’épaisseur de dépôt d’or a été choisit pour permettre un recouvrement optimal de toute la surface sans néanmoins modifier drastiquement la constante de raideur des leviers par une variation trop importante de masse.
La difficulté d’établir un contact électrique reproductible nous a également mené à travailler sur des épaisseurs de dépôt plus importantes (60, 80, 100 jusqu’à 200 nm). La continuité du contact électrique sur l’ensemble du levier jusqu’au support de pointe n’est contrôlé qu’au moment de la mesure. Egalement, étant donné la faible surface des leviers, la composition de la surface ne peut être contrôlée par XPS. Elle est donc obtenue par l’analyseur X de notre SEM-FEG.
Traitement des courbes de force
Les fichiers de courbe de force présentent deux types de données : la déflexion du levier D (nm), la déflexion du levier convertie en force F (pN). Sans calibration préaV. lable, la déflexion du levier lors de l’acquisition se présente en Volt, qui est la mesure directe en sortie de photodiode. La mesure du facteur de sensibilité, correspondant à la pente de la partie répulsive dans son domaine linéaire permet d’obtenir la conversion V/nm. Par la détermination de la fréquence de résonance du levier via la mesure du bruit thermique (énergie dissipée du levier oscillant dans le milieu en fonction de la fréquence des oscillations) la constante de raideur du levier en N/m est obtenue. La déflexion en nm peut alors être convertie en pN.
Traitement des courbes de conductance
La signature en conductance d’une jonction moléculaire est marquée par une plateau de courant constant. Parfois, la longueur du plateau (>0.1 nm) associée à une statistique favorable (1 courbe sur 2) suffisent à fournir un nombre de points suffisants pour contribuer dans un histogramme, ce qui dispense d’un traitement numérique de sélection. Nous avons constaté dans nos expériences que cette occurrence était faible, et la grande majorité des courbes ne présente aucun plateau. La nature des courbes et leur origine sera discutée dans la section résultats.
Pour le STM dédié aux mesures de contact atomique/moléculaire, un programme labview ainsi que son extension matlab développée lors de précédents travaux permettent de sélectionner manuellement les courbes présentant des plateaux de conductance.
L’histogramme est construit à partir de cette sélection. Pour les mesures en C-AFM, le logiciel Nanoscope ne dispose d’aucune routine intégrée. Un programme a donc été développé et est présenté dans ce qui suit.
Représentation en cartographie Force-Distance
Le critère de force la plus probable dépend en réalité de l’ensemble dans lequel il est prélevé. En reprenant l’histogramme VI.1 (d) couplé à la distance de rupture présenté sur la figure VI.2, nous remarquons que de nouvelles distributions apparaissent et dépendent de l’intervalle en distance dans lequel elles sont prélevées.
En effectuant un découpage des forces tenant compte de critères sur le nombre d’interactions et la distance à laquelle elles interviennent, il devient possible d’extraire une force d’interaction reproductible d’un jeu de données à l’autre, et potentiellement attribuable au peptide.
Évaluation du seuil de discrimination spécifique/non-spécifique
L’attribution d’une force d’interaction au peptide se fera suivant une distinction entre les événements spécifiques et les événements non-spécifiques. L’événement nonspécifique comprend l’ensemble des interactions qui ne peuvent être attribuées à une interaction cible et donc connue. Il s’agit d’un terme emprunté aux expériences de spectroscopie de force dans les systèmes ligand-récepteur où une distinction devait être faite entre les interactions correspondant à une reconnaissance des deux fragments, des interactions où cette reconnaissance n’avait pas eu lieu (fragment non accessible ou bloqué, interaction avec le substrat ou un contaminant). Dans notre cas, la non spécificité fait référence aux interactions non marquées par la présence d’un dépliement histogrammes projetés. La cartographie révèle que la dispersion apparente est liée aux événements adhésifs inférieurs à 5 nm. du linker PEG. Cette distinction permet l’exclusion d’événements sur deux critères : une force et une distance minimale d’interaction. Le critère sur la force minimale dépend directement du bruit d’oscillation libre. Il est fixé à fmin = Nstdfb pN, où stdfb est la largeur à mi-hauteur du bruit mesurée à chaque cycle, et N correspond à un entier, pris généralement à 5. Les valeurs obtenues pour fmin sont de l’ordre de la dizaine de pN. Le seuil de discrimination en distance en revanche nécessite une évaluation.
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Table des matières
I Techniques de champ proche
I.1 Principe de la spectroscopie de force
I.2 Forces d’interaction
I.3 Mesures de conductance
II Modèles associés au champ proche
II.1 Élongation de l’agent de couplage
II.2 Modèles dynamique de la rupture de liaison
II.3 Transport électronique en molécule unique
II.3.1 Régime diffusif : modèle de Drüde-Boltzman
II.3.2 Régime ballistique : modèle de Landauer – Büttiker
III Étude bibliographique
III.1 Liaison Soufre-Or
III.1.1 Une rupture controversée
III.1.2 Conductance
III.1.3 Force : un consensus probable à 1-1.5 nN
III.2 Liaison Azote-Or
III.2.1 Conductance
III.2.2 Force : une absence de consensus
III.3 Cas particulier des peptides
IV Méthodes expérimentales
IV.1 Choix du peptide
IV.2 Préparation des substrats
IV.3 Préparation des sondes
IV.3.1 Pointes STM/TERS
IV.3.2 Pointes C-AFM
IV.3.3 Pointes AFM fonctionnalisées
V Méthodes statistiques et numériques
V.1 Traitement des courbes de force
V.1.1 Pré-traitement
V.1.2 Détection des ruptures
V.1.3 Classement
V.1.4 Représentation
V.1.5 Discussion
V.2 Traitement des courbes de conductance
V.2.1 Pré-traitement
V.2.2 Filtrage
V.2.3 Reconstruction des plateaux
VI Caractérisation mécanique de l’interaction Peptide/Or
VI.1 Un problème de représentation
VI.1.1 Représentation par histogramme
VI.1.2 Représentation en cartographie Force-Distance
VI.1.3 Évaluation du seuil de discrimination spécifique/non-spécifique .
VI.2 Forces de rupture
VI.2.1 Caractérisation des forces de rupture en milieu tamponné
VI.2.2 Discussion
VI.2.3 Caractérisation des forces de rupture en milieu promoteur d’hélice
VI.2.4 Expériences de contrôle
VI.2.5 Discussion
VI.3 Caractérisation du spectre de force
VI.3.1 Spectre DFS de l’interaction Biotine/Streptavidine
VI.3.2 Spectre DFS de l’interaction Peptide/Or
VI.3.3 Discussion
VI.4 Caractérisation de l’élongation
VI.4.1 Biais liés à l’estimation de LK
VI.4.2 Exemple sur PEG(18)-Biotine/Streptavidine
VI.4.3 Comparaison avec le système PEG(18)-Peptide
VI.5 Conclusion
VI.5.1 Forces de rupture en milieu tamponné
VI.5.2 Spectroscopie de force dynamique
VI.5.3 Ajustement des réponses en force
VII Caractérisation électrique de l’interaction Peptide/Or 129
VII.1 Jonction Or-Or
VII.1.1 Configuration STM
VII.1.2 Configuration C-AFM
VII.2 Jonction Or-1,8-octanedithiol-Or
VII.3 Jonction Or-Peptide-Or
VII.3.1 Conductance
VII.3.2 Mesures couplées
VII.4 Conclusion
VIII Mise en oeuvre de la spectroscopie TERS sur rotaxanes
VIII.1 Signature vibrationnelle en champ proche
VIII.1.1 Approche photothermique : AFM-IR
VIII.1.2 Spectroscopie Raman locale : Surface Enhanced Raman Spectroscopy (SERS)
VIII.1.3 Spectroscopie Raman locale : Tip Enhanced Raman Spectroscopy (TERS)
VIII.2 Mise en oeuvre sur système de référence
VIII.3 Imagerie et spectroscopie TERS d’un rotaxane géant
VIII.3.1 Molécule étudiée
VIII.3.2 Imagerie STM
VIII.3.3 Obtention d’un spectre TERS
VIII.3.4 Conclusions et perspectives
Annexes
A Caractérisations complémentaires
A.1 Spectre DRX
A.2 Pointes AFM
A.3 Pointes STM
B Programmes Matlab
B.1 Traitement des courbes de force
B.1.1 Programme principal
B.1.2 Fonctions
B.2 Traitement des courbes de conductance
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