Caractérisation biochimiques et moléculaires des haloperoxydases dépendantes du vanadate chez l’algue

Définition et propriétés physico-chimiques des halogènes

   Le fluor (F), le chlore (Cl), le brome (Br), l’iode (I) et l’astate (At), situés dans la 17ème colonne du tableau périodique, forment le groupe des halogènes et possèdent sept électrons dans leur couche électronique la plus externe. Plus on monte dans la classification périodique (de At vers F), plus l’atome d’halogène est petit et électronégatif (Greenwood et Earnshaw, 1997). L’astate étant le seul halogène artificiel, il ne sera pas mentionné par la suite. La forme élémentaire des halogènes naturels est toujours la molécule diatomique (F2, Cl2, Br2, et I2) qui est toxique, extrêmement oxydante et très réactive chimiquement. Les halogènes atteignent leur configuration électronique la plus stable par le gain d’un électron, formant ainsi un ion négatif appelé halogénure. Les halogènes peuvent également être liés de façon covalente à un carbone. L’iode étant le plus gros des halogènes, la liaison covalente carbone-iode est la plus faible, conduisant à des composés organiques iodés plus instables (Greenwood et Earnshaw, 1997).

Les composés inorganiques halogénés

   La croûte terrestre contient ~550 ppm de fluor (majoritairement sous forme de CaF2, Na3AlF6 et Ca5(PO4)3F) ce qui fait de lui le treizième élément le plus commun sur terre. Il se trouve largement répandu dans les minéraux et les roches sédimentaires. Dans les océans, le fluor, présent à ~1.2 mg/l, constitue un élément mineur (Spotte et Bidwell, 1985 ; Greenwood et Earnshaw, 1997). Sur terre, on retrouve environ quatre à cinq fois moins de chlore (soit ~120 ppm) que de fluor. Le chlore est majoritairement retrouvé dans les océans, sous forme de chlorure (NaCl), à une concentration de ~19 g/l (soit ~550 mM) (Spotte et Bidwell, 1985 ; Greenwood et Earnshaw, 1997). Le brome et l’iode sont présents à de très faibles quantités sur terre (respectivement ~2.5 ppm et ~0.45 ppm soit ~300 et ~1,200 fois moins que le fluor). Ils se trouvent essentiellement, dans l’océan, sous forme d’anions, avec des concentrations de ~65 mg/l (soit ~1 mM) pour le brome, un élément mineur, et de ~50 µg/l (soit ~0.5 µM) pour l’iode, un élément trace (Spotte et Bidwell, 1985 ; Greenwood et Earnshaw, 1997). Parmi les halogènes, l’iode existe majoritairement dans l’eau de mer sous les formes inorganiques dissoutes, d’iodates (IO3-) (< 0.20 à 0.50 µM) et d’iodures (I-) (< 0.01 à 0.25µM), mais aussi en plus faible quantité sous forme d’iode moléculaire (I2), d’acide hypoiodeux (HOI), d’iode particulaire et de composés organiques iodés variés (pour revues, Wong, 1991 ; Carpenter, 2003). Tandis que la concentration totale d’iode dissout, d’environ 0.50 µM, reste relativement stable, faisant de cet élément un biointermédiaire typique, la balance IO3-/I- peut subir des variations en fonction de la profondeur ou de la localisation géographique. Les concentrations en iodure, plus élevées dans la couche euphotique, peuvent ainsi représenter plus de 50 % de l’iode inorganique total (soit 0.25 µM) (pour revue, Wong, 1991). Dans l’océan, les composés inorganiques halogénés sont classés en deux catégories : les formes inorganiques « non réactives » et les formes inorganiques « réactives ». Les formes inorganiques « non réactives » (halogénures X- et iodates IO3-) peuvent être transformées, par photochimie ou par l’intermédiaire d’une enzyme, en composés inorganiques « réactifs » (HOX, X2 et X3-). Ces dernières peuvent alors réagir avec la matière organique et former des composés organiques halogénés (Greenwood et Earnshaw, 1997).

Formation des composés organiques halogénés naturels

   Les composés organiques halogénés naturels sont formés à partir de deux types de mécanismes : physico-chimiques ou catalytiques.
1) Processus physico-chimiques
• La formation de monohalométhane (CH3X) se fait principalement par méthylation d’un halogénure (X-). Ceci est réalisable grâce à des composés sulfurés (sulfonium) agissant comme donneurs d’ions CH3+ , tel que le diméthyl-b-propiothétine, le S-adénosylméthionine ou le chlorure de méthionine méthyl sulfonium (Urhahn et Ballschmiter, 1998 ; pour revue, Ballschmiter, 2003).
• Des sources photochimiques de CH3I ont été mises en évidence dans l’océan de surface (Urhahn et Ballschmiter, 1998; pour revue, Ballschmiter, 2003). En effet, la photolyse de la matière organique dissoute forme des radicaux méthyles (CH3•) et l’oxydation de l’iodure par différents oxydants, tel que le radical hydroxyle (OH•), entraîne la formation du radical iode (I•) ; ainsi CH3I peut être produit par recombinaison radicalaire des radicaux méthyle et iode (Moore et Zafiriou, 1994 ; Happell et Wallace, 1996).
• Une substitution d’halogénures sur un composé d’origine biogénique peut être possible soit par un mécanisme radicalaire faisant intervenir l’énergie lumineuse, soit par un échange ionique d’halogénures (pour revue, Ballschmiter, 2003).
2) Processus catalytiques : Malgré le grand nombre de composés organiques halogénés identifiés, les mécanismes catalysant l’incorporation des atomes d’halogènes sur les composés organiques sont peu ou mal compris. Cependant, l’élucidation de certaines voies de biosynthèse met en évidence que ces composés peuvent être produits, de façon directe ou indirecte, par des enzymes (McCormick, 1997 ; Kirner et coll., 1998 ; pour revues, Murphy, 2003 ; van Pée et Unversucht, 2003 ; van Pée et Zehner, 2003).
• Parmi les enzymes « halogénantes », trois sont d’origine strictement bactérienne :
– Les perhydrolases (Itoh et coll., 2001 ; Kawanami et coll., 2002 ; De Mot et coll., 2003) sont susceptibles de produire des composés organiques halogénés de façon indirecte, sans aucune spécificité de substrat ou regiospécificité. En présence d’acide carboxylique et de peroxyde d’hydrogène, elles produisent du peracide qui peut oxyder un halogénure (chlorure, bromure ou iodure) en acide hypo-halogéneux. Cet agent halogénant réagit dans un second temps avec un composé carboné pour former des composés organiques halogénés (R-X) (Figure 3-A) (Hofmann et coll., 1998).
– Les « halogénases » dépendantes du FADH2 possèdent, quant à elles, une spécificité de substrat et une regiosélectivité (Dairi et coll., 1995 ; Zehner et coll., 2000 ; Sanchez et coll., 2002). Ces enzymes sont actives en présence de FADH2, d’halogénures (chlorure ou bromure) et d’oxygène (Figure 3-B) (Keller et coll., 2000).
– La fluorinase, enfin, convertit par substitution nucléophile l’ion fluorure et le Sadénosylméthionine en 5′-fluoro-5′-désoxyadénosine (Figure 3-C) (O’Hagan et coll., 2002).
• Deux autres types d’enzymes ont été identifiées chez des procaryotes et des eucaryotes :
– Les halogénures méthyltransférases produisent des monohalométhanes (CH3X), chez les champignons (Harper et Hamilton, 1988 ; Wuosmaa et Hager, 1990 ; Saxena et coll., 1998), les algues marines (Wuosmaa et Hager, 1990 ; Itoh et coll., 1997 ; Ohsawa et coll., 2001a) et les plantes halophiles (Wuosmaa et Hager, 1990 ; Attieh et coll., 1995 ; Saini et coll., 1995 ; Ni et Hager, 1998). Ces enzymes catalysent la synthèse de CH3X à partir de Sadénosylméthionine et d’halogénures (chlorure, bromure ou iodure) (Figure 4). Des activités de méthylation d’halogénures dépendantes du S-adénosylméthionine sont également détectées chez des bactéries (Amachi et coll., 2001).
– Les haloperoxydases, présentes dans la majorité des embranchements du règne vivant (Hewson et Hager, 1980 ; pour revues, van Pée, 1996 ; Neidleman et Geibert, 1986), semblent être les enzymes impliquées dans l’halogénation d’un nombre important de composés organiques.

Mécanisme d’oxydation des halogénures

   Le mécanisme d’action pour l’oxydation des halogénures, qui semble similaire entre la vCPO et les vBPOs, est de type « bi-bi ping-pong » (Cleland, 1973 ; Everett et coll., 1990b), où le peroxyde d’hydrogène serait le premier substrat, suivi de l’halogénure. Bien que ce mécanisme ne soit pas complètement résolu, le schéma représenté en figure 11 est actuellement le plus vraisemblable (Hemrika et coll., 1999 ; pour revue, Butler et coll., 2001). Durant la réaction catalytique, le vanadate, dont l’état d’oxydation (+5) ne change pas, fonctionne comme un acide de Lewis (de Boer et coll., 1988b ; Hormes et coll., 1988 ; Arber et coll., 1989 ; Kusthardt et coll., 1993). La fixation du peroxyde d’hydrogène (H2O2) sur le vanadate constitue la première étape du cycle catalytique des vHPOs (Figure 11, étape 1 A-D). Pour ce faire, l’histidine catalytique (His404 dans la vCPO et His496 dans la vBPO) doit être déprotonée (van Schijndel et coll. 1994). Le groupement hydroxyle du vanadate formant avec ce résidu histidine une liaison hydrogène polarisée est alors plus nucléophile et serait activé pour attaquer le premier substrat, le peroxyde d’hydrogène. Chez la vCPO de C. inaequalis un intermédiaire peroxo-enzyme actif se forme durant la réaction catalytique (Messerschmidt et coll., 1997). La structure de la vCPO native liée au peroxyde d’hydrogène révèle une distorsion bipyramidale tétragonale du vanadate (Figure 12). Sous cette forme, le groupement hydroxyle disparaît et le peroxyde d’hydrogène se lie au vanadate dans le même plan que le résidu histidine (His496 dans la vCPO) impliqué dans la liaison covalente avec le vanadate (Figure 12) (Messerschmidt et coll., 1997). Un ensemble de réactions, décrites dans le schéma (Figure 11, étape 1 A-D), expliquerait la formation de la liaison du peroxyde d’hydrogène au vanadate. L’intermédiaire peroxovanadium (+5) assure ensuite l’oxydation de l’halogénure (Messerschmidt et coll., 1997). En solution, le peroxovanadium (+5) ou le diperoxovanadium (+5) n’oxyde pas les halogénures (Clague et Butler, 1995). Chez les vHPOs, ce sont donc des résidus de l’enzyme qui vont assurer l’activation de l’intermédiaire peroxovanadium. Dans la structure de la vCPO, la lysine (Lys353), qui forme l’une des plus fortes liaisons hydrogène avec l’un des deux atomes d’oxygène du peroxovanadium, est considérée comme étant le résidu permettant l’activation du peroxovanadium pour l’oxydation des halogénures (Figure 11, étape 2) (Hemrika et coll., 1999). La liaison hydrogène entre cette lysine et le peroxovanadium entraînerait une polarisation de la liaison oxygène-oxygène formée par le peroxyde d’hydrogène. Ainsi, un des atomes d’oxygène serait protoné (Figure 11, étape 2 A) (dans le cas de la vCPO) et pourrait subir l’attaque nucléophile de l’halogénure (Figure 11, étape 2 B). La rupture de la liaison oxygène-oxygène du peroxovanadium permettrait la formation de l’acide hypo-halogéneux (Figure 11, étape 2 C, D) (Hemrika et coll., 1999).

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Table des matières

INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE 
I- Les composés halogénés 
A) Définition et propriétés physico-chimiques des halogènes
B) Les composés inorganiques halogénés
C) Les composés organiques halogénés
D) Le cycle biogéochimique des halogènes
E) Formation des composés organiques halogénés naturels
1) Processus physico-chimiques
2) Processus catalytiques
II- Les haloperoxydases dépendantes du vanadate 
A) Définitions et généralités sur les haloperoxydases
1) Réactions chimiques et détections d’activités haloperoxydases
2) Classification des différents types d’haloperoxydases
B) Caractérisations des haloperoxydases dépendantes du vanadate
1) Analyses biochimiques
2) Caractérisations moléculaires
3) Résolutions de structures cristallines
C) Mécanisme d’action des haloperoxydases dépendantes du vanadate
1) Architecture du site actif
2) Mécanisme d’oxydation des halogénures
3) Spécificité pour les halogénures
4) Sélectivité et regiosélectivité vis-à-vis de composés organiques
5) Mécanisme de sulfoxidation
D) Origine et évolution des haloperoxydases dépendantes du vanadate
1) Homologie entre les vCPOs et les vBPOs
2) Similitudes entre les vHPOs et les phosphatases
E) Rôles biologiques putatifs des vHPOs
1) Toxicité et rôles biologiques des composés halogénés
2) Détoxication du peroxyde d’hydrogène
3) Adhésion – Pontages oxydatifs dans la paroi
4) Absorption d’halogénures
PROBLEMATIQUES ET OBJECTIFS DE LA THESE 
MATERIEL ET METHODES D’ETUDE 
I- Matériel végétal 
II- Préparation des éliciteurs oligo-alginates 
III- Elicitation des sporophytes de L. digitata 
IV- Dosage des espèces activées de l’oxygène par chimioluminescence
V- Méthodes biochimiques 
VI- Analyse des haloperoxydases purifiées en spectrométrie de masse
VII- Caractérisation moléculaire 
RESULTATS 
Chapitre 1 : Identification et caractérisation des activités vHPOs chez L. digitata 
I- Purification des activités vHPOs chez L. digitata
II- Propriétés biochimiques et immunologiques des vHPOs purifiées
III- Localisation des activités vHPOs, in vivo, chez L. digitata
VI- Article 1
Chapitre 2 : Caractérisation moléculaire des vHPOs purifiées chez L. digitata– couplage avec une approche protéomique 
I- Bromoperoxydases putatives chez L. digitata
II- Approche protéomique : stratégie de séquençage de novo des vHPOs
III- Identification moléculaire des activités vBPOs et vIPO chez L. digitata
Chapitre 3 : Evolution des vHPOs et spécificité biochimique 
I- Les vHPOs chez L. digitata : des familles multigéniques
II- Evolution des vHPOs chez les algues marines
III- Structure du site actif et spécificité pour les halogénures
IV- Article 2
Chapitre 4 : Rôles des vHPOs : un lien entre le métabolisme halogéné et les mécanismes de défense ? 
I- Résultats
II- Discussion
CONCLUSIONS – PERSPECTIVES 
I- Les vHPOs : des enzymes clé du métabolisme halogéné chez L. digitata
II. Les vHPOs : des enzymes impliquées dans le stress oxydant et les mécanismes de défense
III. Modélisation de la structure tridimensionnelle de la vIPO : vers une compréhension du mécanisme d’action des vHPOs
IV. Evolution des vHPOs : vers une spécificité de ces enzymes pour l’oxydation des halogénures ?
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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