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Structure et Morphologie
Contrairement aux autres procaryotes, les mycoplasmes n’ont aucune paroi cellulaire car ils sont incapables de synthétiser du peptidoglycane ou ses précurseurs. Ils sont donc sensibles aux chocs osmotiques, aux détergents, aux alcools ainsi qu’aux anticorps en présence de complément. Ils sont immobiles et aérobies ou anaérobies facultatifs. Ce sont les procaryotes les plus petits et les plus simples que l’on connaît capable d’autoréplication. Caractérisés par leur extrême pléomorphisme ; les mycoplasmes sont des cellules de très petite taille (300μm) et d’une relative fragilité due à l’absence de paroi. Leur structure simple est celle d’une bactérie dépourvue de paroi ; comprenant un noyau procaryote, un cytoplasme bourré de granulations de ribosomes et une membrane tri-lamellaire de structure classique. La membrane en trois feuillets contient des lipides en grande quantité des glucides, des glycolipides et des protéines. On note la présence d’une structure terminale « tip » chez certains mycoplasmes qui joue un rôle dans l’adhérence et la mobilité [10]. Les mycoplasmes présentent un grand pléomorphisme : il existe des formes allongées fusiformes ou filamenteuses.
Les mycoplasmes peuvent être responsables d’infections respiratoires et génitales. Des complications obstétricales, néonatales et extra-génitales ont été décrites [11]. Dans le cadre de la présente étude, nous nous contenterons des mycoplasmes urogénitaux. Les mycoplasmes fréquemment isolés dans le tractus génital, et potentiellement pathogènes, sont M. hominis, U. urealyticum et M. genitalium [2].
Métabolisme glucidique
Certains mycoplasmes utilisent le glucose comme source de carbone et d’énergie. Le produit final de la dégradation est le plus souvent de l’acide lactique pyrrolique et acétique en très faible quantité [12].
Métabolisme lipidique
Tous les mycoplasmes ont un besoin accru en cholestérol non estérifié. Il peut être remplacé par d’autres stérols par exemple le stigmastérol. Il conditionne la stabilité osmotique de la cellule, joue donc un rôle structural et nécessaire aux échanges à travers la membrane [12].
Métabolisme protidique
Les mycoplasmes ne sont pas protéolytiques en général, seules quelques espèces liquéfiant la gélatine peuvent liquéfier également le sérum coagulé ou la caséine [12]. Excepté Mycoplasma pneumoniae et Ureaplasma urealyticum, les mycoplasmes dégradent l’arginine avec production d’ammoniaque. Cette propriété constitue leur source majeure d’énergie et un moyen biochimique d’identification. Seul Ureaplasma possède une uréase et dégrade l’urée. C’est la propriété la plus caractéristique deUreaplasma.
Caractères antigéniques
La composition antigénique des mycoplasmes est très mal connue. Les immunogènes des mycoplasmes sont des antigènes de surface localisés sur la membrane cytoplasmique. Ils sont pour la plupart thermolabiles et sensibles aux enzymes protéolytiques. Sur le plan de l’immunité, les mycoplasmes sont peu immunogènes ; les anticorps neutralisants qui inhibent les cultures ou ceux décelés par immunofluorescence seraient responsables de l’immunité mais n’empêcheraient pas la persistance du germe dans l’organisme.
Dans les infections, la présence d’anticorps spécifiques est rare et leur titre est peu élevé, maximum 1/8, d’où leur faible utilisation du point de vu diagnostic [13]. Un mycoplasme possède plusieurs constituants antigéniques dont certains sont spécifiques [14]. Actuellement 14 sérotypes sont connus pour Ureaplasma urealyticum et 7 pour Mycoplasma hominis. Des études tendent à montrer que certains sérotypes seraient plus pathogènes que d’autres et seraient reliés à une certaine pathologie. Le sérotype 4 de Ureaplasma urealyticum a été rencontré lors d’urétrites non gonococciques masculines et les sérotypes 3, 6, 11 et 13 ont été retrouvés lors d’avortements. Mycoplasma pneumoniae présente 2 types d’antigènes qui sont les glycolipides membranaires et les antigènes protéiques parmi lesquels l’adhésine, qui constitue l’antigène immuno-dominant. Il possède un seul sérotype, et entraîne une immunité protectrice partielle.
Epidémiologie
La présence des mycoplasmes chez l’homme varie selon de nombreux paramètres parmi lesquels le sexe et l’âge.
De l’adolescence à la puberté, c’est à partir de ce moment de la vie que les mycoplasmes réapparaissent au niveau des voies génitales : les échanges par contact sexuel augmentent la fréquence des sujets colonisés.
Chez l’adulte homme, Ureaplasma urealyticum est isolé de l’urètre et Mycoplasma hominis du prépuce alors que chez la femme, ces deux germes sont rencontrés au niveau du vagin et plus rarement au niveau de l’endocol [11].
Fréquence d’isolement
Cette fréquence est surtout notée pour les mycoplasmes urogénitaux. Mycoplasma hominis est rencontré à l’état saprophyte dans le tractus génital chez 38% des hommes et 45% des femmes. Ureaplasma urealyticum fait partie de la flore urogénitale dans 40-70% des cas mais prédomine chez la femme. Cependant, il peut parfois être isolé chez 60% des hommes et 80% des femmes issus d’une population à risque suivie ou en consultation d’IST [15].
Les taux d’infection avec manifestation clinique et les taux de portage ainsi que les co-infections avec d’autres agents responsables d’IST varient selon les populations, les études et le sexe : de 1 à 4 % et de 1 à 6,4 % en population générale respectivement pour les hommes et les femmes [10], de 15 à 20 % chez les hommes ayant des urétrites non gonococciques [16]. La prévalence de Mycoplasma génitalium chez les populations à haut risque est de 4 à 38 % dans les centres d’IST [10]. Une méta-analyse des prévalences chez les femmes à haut risque d’IST montre une prévalence allant de 0 à 42 % [17]. Les femmes considérées comme à haut risque d’IST étaient celles consultant un centre d’IST, celles ayant des signes cliniques urogénitaux, celles consultant un centre de planning familial pour grossesse et celles identifiées comme travailleuses sexuelles. Cet important intervalle de prévalence s’explique par différents facteurs :
Clinico-biologiques (mode d’expression, pathologie, co-infection),
Epidémiologiques (géographique, conduite sexuelle, type de recrutement, mode de calcul des prévalences)
Technique (type de PCR). Les prévalences de ces différentes études sont décrites dans le Tableau II. L’émergence de Mycoplasma génitalium a pu le faire comparer à un ʺnouveau chlamydiaʺ de par l’importance de sa prévalence chez les femmes [18].
Facteurs favorisants
Les critères de sélection des malades ont d’emblée écarté tous les sujets à risque si l’on sait qu’en Afrique les conditions socio-économiques précaires pourraient constituer des facteurs de susceptibilité aux infections. Pour les infections urogénitales le seul facteur commun déterminant reste le niveau de l’activité sexuelle. Une étude réalisée par Taylor et Robinson rapporte la fréquence des mycoplasmes en fonction du nombre de partenaires sexuels des individus [19].
Transport des échantillons
Les mycoplasmes étant très sensibles à la dessiccation, il faut utiliser des milieux de transport adaptés. Le meilleur moyen serait de l’ensemencer directement sur le milieu de culture mais cela n’étant pas toujours évident, le milieu saccharose-phosphate (2 SP) enrichi de 5% de sérum de veau foetal, sans antibiotique ou le milieu UTM (milieu de transport universel) est utilisé, mais également le milieu A3 qui est un milieu à pH acide contenant du sérum de poulain. Ces milieux peuvent être utilisés pour la mise en culture et pour la PCR. La mise en culture doit se faire sans délai. Les échantillons peuvent cependant être gardés à une température comprise entre 2-4°C pendant 48 h au plus. La congélation à -70°C apparait comme le meilleur moyen de conservation [36].
Diagnostic bactériologique
La culture est relativement simple pour Ureaplasma spp. et M. hominis. Pour M. genitalium, elle est exceptionnelle et non réalisée en pratique courante. Les milieux utilisés sont complexes, rendus sélectifs par addition d’une ßetalactamine ou parfois de polymyxine ou d’amphotéricine B. Il n’y a pas de milieu standard convenant à toutes les espèces en raison de leurs exigences différentes en substrat et en pH.
• M. hominis croît sur le milieu de Hayflick modifié renfermant 20% de sérum de poulain ou le milieu SP-4 (commercialisé) plus complexe, renfermant du sérum de veau foetal. Les milieux liquides, à pH 7,0-7,2, renferment de l’arginine et du rouge de phénol. M. hominis peut occasionnellement croître sur gélose au sang, donnant de très petites colonies ainsi que sur les milieux utilisés pour Ureaplasma spp.
• Ureaplasma spp. se développe sur milieu de Shepard à pH 6,0 renfermant de l’urée.
En milieu liquide, le diagnostic se fait d’après le virage d’indicateurs. Sur milieu gélosé, l’apparition de colonies doit être recherchée à la loupe binoculaire. Leur aspect est variable, en forme d’ oeuf sur le plat pour M. hominis, irrégulier et très petit pour Ureaplasma spp. Ces dernières sont colorées en brun sur milieux contenant du sulfate de manganèse ou du chlorure de calcium, ce qui permet de les distinguer des irrégularités observées parfois sur la gélose [36].
L’identification
Elle se fait d’après les propriétés métaboliques et l’aspect des colonies : fermentation du glucose, hydrolyse de l’arginine et de l’urée. Différentes trousses commerciales existent pour la détection et la quantification de Ureaplasma spp. et de M. hominis à partir des prélèvements génitaux. Des milieux de transports adaptés sont fournis avec ces trousses. Elles donnent globalement des résultats comparables à la méthode standard de culture en milieu liquide ou gélosé, les rendant très utiles pour les laboratoires qui ne réalisent qu’occasionnellement le diagnostic des mycoplasmes urogénitaux. Des faux positifs sont décrits en cas de contamination du prélèvement par d’autres bactéries, conduisant à recommander, en cas de doute, la vérification du résultat par culture sur milieu gélosé [36].
Méthode moléculaire
M. genitalium ne peut être détecté que par amplification génique. Il existe des trousses commercialisées de PCR monoplex ou multiplex pouvant détecter aussi par exemple Chlamydia trachomatis et Neisseria gonorrhoeae.
Des PCR dites « maison » ont été développées pour détecter et différencier les deux espèces de Ureaplasma et M. hominis. Des trousses commercialisées monoplex ou multiplex sont aussi disponibles et d’intérêt, en particulier pour l’examen des prélèvements utéro-annexiels effectués lors des infections génitales hautes ou pour des prélèvements extra-génitaux.
Interprétation
– Prélèvements normalement stériles: s’il y a absence de mycoplasmes urogénitaux sur les milieux d’isolements et d’identifications.
– Prélèvements en contact avec une flore commensale :
Titre de Ureaplasma spp, de M. hominis ≤ 104 UCC/ml
– Prélèvements pathogènes :
Titre de Ureaplasma spp, de M. hominis ≥ 104 UCC/ml (Chez la femme) et Ureaplasma spp, de M. hominis ≥ 103 UCC/ml (Chez l’homme)
Chez l’homme, les critères de pathogénicité pour Ureaplasma spp sont les suivants :
≥ 104 UCC/ml pour un prélèvement urétral, ≥103 UCC/ ml pour le 1er jet d’urine.
Chez la femme, la présence de Ureaplasma spp. dans un prélèvement cervico-vaginal est difficile à interpréter en raison de sa fréquence à l’état normal (jusqu’à 30% des femmes). M. hominis est retrouvé plus rarement (≤ 10% des femmes) et en quantité moindre. Il peut être présent en grande quantité (≥104 UCC/ml) dans les vaginoses bactériennes. La présence en quantité élevée de Ureaplasma spp et de M. hominis dans la flore vaginale peut également évoquer une infection des voies génitales hautes.
Chez le nouveau-né, la présence de mycoplasmes dans des prélèvements périphériques peut être due à une simple contamination. L’isolement à partir d’un prélèvement endotrachéal, d’une aspiration naso-pharyngée ou d’un liquide gastrique en quantité élevée (≥104 UCC/ml) revêt une signification plus grande confronté à un tableau clinique évocateur.
Evaluation des performances d’un test [37]
Un test de dépistage permet de tirer au sein d’une population cible apparemment en bonne santé, les personnes probablement atteintes d’une maladie des personnes probablement indemnes. Un test de dépistage doit avoir les qualités suivantes : simple, fiable, reproductible, acceptable, peu coûteux et valide. La validé d’un test est sa capacité à différencier au sein de la population cible les personnes probablement atteintes de la maladie de celles qui sont probablement indemnes. Cette capacité dépend à la fois des performances propres du test et des caractéristiques de la population testée.
Les performances propres du test de dépistage sont sa sensibilité et sa spécificité, définissant la validé intrinsèque du test. Elles sont définies et calculées en conditions expérimentales et sont donc indépendantes du type de personne testée.
Les caractéristiques de la population testée, en particulier la prévalence de la maladie, conditionnent les performances extrinsèques du test. Ces performances extrinsèques sont les valeurs prédictives positives et négatives. Elles sont définies et calculées en situation de dépistage et permettent d’apprécier la pertinence de l’utilisation du test dans cette population précise.
Performances intrinsèques : sensibilité et spécificité
La sensibilité d’un test est la probabilité que le test soit positif si la personne est atteinte de la maladie. C’est le nombre de vrais positifs (tests positifs chez des personnes atteintes de la maladie) divisé par le nombre total de personnes atteintes de la maladie (a/ a+c). Plus un test est sensible moins il comporte de faux négatifs (tests négatifs chez des personnes atteintes de la maladie) et mieux il permet, s’il est négatif, d’exclure la maladie Se=𝑉𝑃𝑉𝑃+𝐹𝑁.
Performances extrinsèques : valeurs prédictives positives et négatives
En pratique quotidienne de dépistage, la question qui se pose au médecin est d’évaluer chez une personne apparemment en bonne santé la probabilité d’être malade ou non malade en fonction du résultat positif ou négatif du test. Cette probabilité est aussi appelée probabilité a posteriori ou probabilité post-test. Elle dépend des caractéristiques du test (sensibilité et spécificité) et de la probabilité à priori (probabilité pré-test) que la personne ait une maladie, c’est-à-dire de la prévalence de la maladie dans la population considérée. La prévalence de la maladie est la probabilité a priori que la maladie soit présente chez une personne prise au hasard dans une population (a+b/ a+b+c+d).
La valeur prédictive positive (VPP) d’un test est la probabilité que la personne soit réellement malade si son test est positif. C’est le nombre de vrais positifs (tests positifs chez des personnes atteintes de la maladie) divisé par le nombre total de personnes dont le test est positif (a/ a+b). La formule de Bayes permet de calculer la VPP d’un test en fonction de sa sensibilité (Se), de sa spécificité (Sp) et de la prévalence de la maladie (P). 𝑉𝑃𝑃=Se x PSe x P+(1−P)(1−Sp)
La valeur prédictive négative (VPN) d’un test est la probabilité que la personne n’ait pas la maladie si son test est négatif. C’est le nombre de vrais négatifs (tests négatifs chez des personnes indemnes de la maladie) divisé par le nombre total de personnes dont le test est négatif (d/ c+d). 𝑉𝑃𝑁=Sp x PSp x P+(1−P)(1−Se)
La prévalence de la maladie et la VPP du test de dépistage varient dans le même sens. Quelles que soient les performances intrinsèques du test, si la prévalence de la maladie est faible, la probabilité qu’une personne ayant un test positif soit réellement malade est faible : un test positif a dans ce cas de fortes chances d’être un faux positif.
contrôle de performances
Un contrôle d’efficacité et de stérilité a été réalisé sur chaque lot de milieu préparé.
Contrôle d’efficacité
Chaque lot de milieu préparé a été testé avec une souche de contrôle. Une souche pure d’Escherichia coli pour le témoin négatif du bouillon urée, pour le témoin positif une souche pure de Klebsiella pneumoniae a été utilisée. Pour le bouillon arginine une souche de Klebsiella pneumoniae ou Escherichia coli a été utilisée pour le témoin négatif. Le contrôle positif des bouillons arginine a été réalisé avec des souches pures d’Enterococcus fecalis. La positivité du test se traduit par un virage de la couleur jaune orangée au rouge. Pour un test négatif le milieu garde sa coloration d’origine.
Contrôle de stérilité
Pour le bouillon, un millilitre (1ml) de chaque milieu préparé a été déposé dans des tubes à hémolyses stériles, qui ont ensuite été incubés à 37°C pendant 24 heures. Les milieux étaient considérés stériles en l’absence de trouble et de virage de l’indicateur coloré.
La gélose A7 quant à elle, a été incubée à l’étuve à 37°C en anaérobie comme en aérobie. La stérilité du milieu s’est traduite par la présence de colonies après la durée d’incubation requise.
Collecte des échantillons
Un total de 100 échantillons a été collecté au cours de notre étude. Il s’agit de 50 souches de mycoplasme (Mycoplama hominis et Ureaplasma urealyticum) identifiés par le kit de Bio Mérieux (mycoplasma IST2 Sans A7) et 50 échantillons de sécrétion cervico vaginale, de prélèvement urétral et d’urines. Les souches ont été transportées au laboratoire à l’aide du bouillon A3 qui a servis de milieux de transport. Les prélèvements ont été inoculés dans 2ml de bouillon A3 puis acheminés au laboratoire.
Préparation et conditionnement des plaques déshydratées
Les milieux de culture (bouillon urée et arginine) ont été distribués dans les micro-cupules :180μl dans chaque puits. Les plaques ont ensuite été placées à l’étuve à 37° pendant 24h pour permettre la déshydratation des substrats.
Pour tous les milieux déshydratés préparés, nous avons effectué des tests de stérilité et d’efficacité.
Le contrôle de stérilité des microplaques consistait à mettre en évidence l’absence de contaminant dans le milieu. Les cupules ont été inoculées avec de l’eau physiologique stérile puis recouvertes à l’huile de paraffine et incubées à l’étuve à 37°C pendant 24h.
Le contrôle d’efficacité des microplaques est réalisé pour s’assurer que les milieux n’ont pas été dénaturés lors de la déshydratation. Pour les micro-cupules d’urée, une souche pure d’Escherichia coli était mise dans l’eau distillée puis incubée pour le témoin négatif et une souche pure de Klebsiella pneumoniae pour le témoin positif. Pour les micro-cupules d’arginine, une souche pure de Klebsiella pneumoniae a été également utilisée pour le témoin négatif, ainsi qu’une souche d’Enterococcus fecalis pour le témoin positif.
Identification des souches avec la microgalerie MicroCSB system®
Les souches collectées ont été identifiées en vue de confirmer la présence de Mycoplama hominis et/ou de Ureaplasma urealyticum.
Pour ce fait, en un premier temps, nous a procédé à l’identification des souches par la micro méthode MicroCSB myco puis nous avons déterminé la présence et le titre des mycoplasmes identifiés. Les souches positives ont ensuite été ensemencés sur gélose A7 et les colonies observées au microscope optique afin de voir les caractéristiques de ces colonies. Les mycoplasmes confirmés ont servi pour le contrôle de qualité.
En second lieu, les prélèvements effectués ont servis pour l’identification des mycoplasmes avec la microgalerie MicroCSB System® et les résultats ont été comparés à ceux obtenus par celui du Kit mycoplasma IST2 utilisés dans les laboratoires où ces prélèvements ont été effectués.
Identification et titrage en milieu liquide
Principe
L’identification des mycoplasmes en milieu liquide est basée sur le principe suivant: Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum sont respectivement incubés dans les bouillons arginine et urée en présence d’un indicateur coloré: le rouge de phénol. Le principe est alors basé sur le métabolisme du substrat présent dans le bouillon (urée, arginine); lequel est détecté par le virage de l’indicateur de pH.
Arginine voie de l’arginine déhydrolase ATP + NH3 + CO2 Urée Uréase CO2 + NH3.
L’ammoniac libéré augmente le pH dans le milieu entrainant ainsi le virage de l’indicateur qui devient alors rouge-orangé et rose framboise pour l’urée et l’arginine respectivement. Chaque espèce est identifiée par sa capacité à métaboliser ou non le substrat. Notons que la croissance des mycoplasmes ne s’accompagne pas du trouble du milieu qui traduirait une autre croissance bactérienne. A cet effet, les levures sont capables de métaboliser certains constituants du milieu en libérant des substances basiques. Leur croissance s’accompagne du trouble et /ou d’un dépôt blanchâtre.
Mode opératoire
La microplaque utilisée dispose de deux rangées de 8 cupules chacune.
La rangée supérieur contient le bouillon urée déshydratée (A) et la rangée inférieure le bouillon arginine déshydraté (B). Les puits N°1 de chaque rangée correspondent aux témoins négatifs du test, donc ne contient ni l’urée ni l’arginine.
Etape1 : Homogénéiser le milieu de transport ensemencé avec l’échantillon (bouillon A3).
Etape2 : Prélever 20μl du bouillon A3 puis l’introduire dans les cupules N°1 de chaque rangée (changer d’embout à chaque fois).
Etape3 : Prélever 20μl du bouillon A3 ensemencé et l’introduire dans la cupule N°2 de la rangée A. Faire une série de dilution (110⁄) de la cupule N°2 à la cupule N°8 (20μl du puit N°2 ajouté au puit N°3, ainsi de suite jusqu’au dernier puit).
Etape4 : Changer d’embout et reproduire l’étape 3 au niveau de la rangée B.
Etape5 : Mettre une goutte d’huile de paraffine dans chaque puit ensemencé de la microplaque.
Etape6 : Incuber la microplaque à l’étuve à 37°C entre 16h et 24h (tableauV).
NB : En cas de réaction négative réincuber pendant 24h supplémentaire pour une dernière lecture.
Interprétation
– Une coloration jaune orange indique une absence de croissance.
– Un virage du milieu urée en rouge orangé indique la présence de Ureaplasma urealyticum.
– Un virage du milieu arginine au rose framboise indique la présence de Mycoplasma hominis.
– Le titre est donné par la dernière cupule positive (rouge orangé ou rouge framboise), et est exprimé en UCC/ml. (figure 6).
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Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE:REVUE DE LA LITTERATURE
I. Généralités sur les mycoplasmes
I.1. Structure et Morphologie
I.2. Caractères bactériologiques
I.2.1. Caractères biochimiques
I.2.2. Métabolisme glucidique
I.2.3. Métabolisme lipidique
I.2.4. Métabolisme protidique
I.2.5. Caractères antigéniques
I.3. Epidémiologie
I.3.1. Fréquence d’isolement
I.3.2. Facteurs favorisants
I.4. Physiopathologie
I.5. Diagnostic biologique
I.5.1. Le Prélèvement
I.5.2. Transport des échantillons
I.5.3. Diagnostic bactériologique
I.5.3.1. L’identification
I.5.3.2. Méthode moléculaire
I.5.3.3. Interprétation
I.6. Traitement
I.7. Evaluation des performances d’un test [37]
I.7.1. Performances intrinsèques : sensibilité et spécificité
I.7.2. Performances extrinsèques : valeurs prédictives positives et négatives
DEUXIEME PARTIE:TRAVAIL EXPERIMENTAL
I. Objectif de l’étude
II. Cadre d’étude
III. Critère d’inclusion
IV. Matériel d’étude
V. Méthodologie
V.1. contrôle de performances
V.2 Collecte des échantillons
V.3. Préparation des milieux de culture (annexe)
V.4. Préparation et conditionnement des plaques déshydratées
V.5. Identification des souches avec la microgalerie MicroCSB system®
V.5.1. Identification et titrage en milieu liquide
V.5.2. Isolement et identification sur milieu solide
V.6. Contrôle de qualité et Validation
I. Résultats et Discussion
I.2. Résultats
II. Discussion
Conclusion
Références bibliographiques
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