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Caractères bactériologique des entérobactéries
Morphologie [7 – 12 – 17 – 18]
Toutes les entérobactéries ont une morphologie habituellement typique ; bacilles à Gram négatif de 2-3 μm de long sur 0,6 μm de large, généralement polymorphes.
Les espèces mobiles les plus nombreuses le sont grâce à une ciliature péritriche. Certaines sont immobiles (Klebsiella, Shigella, Yersinia pestis). La présence d’une capsule visible au microscope est habituelle chez les Klebsiella.
La plupart des espèces pathogènes pour l’homme possèdent des fimbriae ou pili qui sont des facteurs d’adhésion.
Culture [11 – 12 – 17 – 19]
Les entérobactéries poussent facilement sur les milieux ordinaires en 24 heures à 37°C en aérobiose et en anaérobiose.
Leurs exigences nutritionnelles sont, en général, réduites et la plupart se multiplient en milieu synthétique avec une source de carbone simple comme le glucose. Sur milieux gélosés, les colonies d’entérobactéries sont habituellement lisses, brillantes, de structure homogène (type « smooth » ou S). Cet aspect peut évoluer après cultures successives pour donner des colonies à surface sèche rugueuse (type « rough » ou R).
Les Klebsiella forment des colonies souvent très muqueuses, larges et luisantes. Les Proteus ont tendance à envahir la gélose et à y former un tapis uniforme.
En milieu liquide, les entérobactéries occasionnent un trouble uniforme du bouillon.
Antigènes [21]
La détermination du sérotype est réalisée pour des souches dont l’identification biochimique est certaine. Il existe différents antigènes :
Les antigènes O
Ce sont des antigènes de paroi constitués de lipopolysaccharides (LPS) qui sont thermostables et résistant à l’alcool ou à l’acide.
Les réactions d’agglutination se produisent lentement et sont constituées d’agglutinats granulaires, difficilement dissociables par agitation.
La spécificité O est perdue par les souches R qui sont auto-agglutinables en eau distillée.
Les antigènes H
Ce sont des antigènes qui ne sont présents que chez les souches mobiles. Constitués d’une protéine, la flagelline, ils sont thermostables et inactivés par l’alcool.
Les réactions d’agglutination se produisent rapidement et sont constituées d’agglutinats floconneux, facilement dissociables par agitation.
Les antigènes K
Ces antigènes capsulaires sont généralement constitués d’une couche externe polysaccharidique. Parmi les antigènes K, se trouvent les antigènes L, A, B d’E. coli et l’antigène Vi de certaines Salmonella ou Citrobacter. Ces antigènes peuvent rendre la souche qui les possède inagglutinable par les antisérums O. Ils sont détruits par une ébullition de 2 heures.
Les antigènes d’adhérence ou adhésines, de nature protéique, en relation avec la présence de pili sont classés parmi les antigènes K (K88, K99).
L’antigène Kunin
Cet antigène commun chez la famille des Enterobacteriaceae n’est pratiquement retrouvé que dans cette famille et a un intérêt taxonomique.
Des antisérums dirigés spécifiquement contre chacun des antigènes bactériens sont préparés en utilisant les méthodes de l’absorption spécifique des anticorps de Castelcani. Des anticorps qui se sont fixés sur l’antigène bactérien correspondant forment des agglutinats. Après centrifugation, il ne reste plus dans le surnageant que des anticorps qui n’ont pas été en contact avec l’antigène.
Pouvoir pathogène
Les entérobactéries constituent plus de 80 % des germes isolés en laboratoire : Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Morganella et Yersinia sont les entérobactéries les plus souvent retrouvées.
Escherichia coli
C’est un germe très courant. Son habitat est le colon humain. Sa survie est extrêmement difficile dans l’environnement. Il est le genre préférentiel des infections urinaires. . L’incidence de ces infections est plus marquée chez les personnes de sexe féminin en milieu communautaire en raison notamment de la colonisation de la région péri-urétrale et de la longueur de l’urètre. En milieu hospitalier, l’incidence est égale entre les deux sexes en rapport essentiellement avec l’utilisation fréquente des sondes urinaires.
E. coli cause également des infections du tractus digestif notamment Escherichia coli entérotoxinogène (ETEC) qui est responsable de la diarrhée du voyageur et Escherichia coli entéropathogéne (EPEC) responsable de diarrhées chez l’enfant, en raison de la contamination de l’eau ou des aliments par la flore fécale des malades ou des porteurs sains
E. coli est aussi à l’origine d’infections pulmonaires chez les personnes gravement malades par colonisation des voies respiratoires supérieures.
E. coli peut coloniser le vagin et être responsable des méningites néonatales (sérotype K1) après un accouchement ou suite à l’infection du liquide amniotique consécutive à une rupture prolongée des membranes.
Klebsiella pneumoniae:
L’habitat de K. pneumoniae est le tractus digestif et le système respiratoire supérieur. Ce germe est principalement isolé en milieu hospitalier, le portage étant fortement accru chez les patients hospitalisés de longues périodes ou bénéficiant de traitements antibiotiques au long court. Toutefois, il est également présent en dehors des hôpitaux, notamment chez des patients diabétiques, ou souffrants de maladies respiratoires chroniques. Bien que la plupart des personnes colonisées soient asymptomatiques, K. pneumoniae peut causer des pneumonies, des bronchites et broncho-pneumonies, la contamination pulmonaire se faisant surtout par voie aérienne, mais la voie hématogène n’étant pas exclue. K. pneumoniae a été longtemps décrit comme le pneumo bacille de Friedlander. C’est une bactérie également retrouvée dans des infections urinaires suite au passage de la flore fécale aux voies urinaires. Finalement, des bactériémies compliquent parfois les infections localisées mentionnées ci-dessus.
Klebsiella oxytoca
Cette bactérie est isolée de produits pathologiques comme les urines, le sang et les sécrétions naso-pharyngées et trachéales. A l’instar de K. pneumoniae, K. oxytoca peut infecter les voies urinaires et respiratoires des patients hospitalisés.
Enterobacter cloacae
C’est un germe qui colonise souvent les patients hospitalisés et plus particulièrement ceux de la réanimation ou chez ceux qui sont sous traitement antibiotique au long cours. Il peut être à l’origine d’infections urinaires de pneumonies, ainsi que d’infection cutanées. Il peut également être responsable de bactériémies, et c’est un pathogène dont l’incidence en milieu hospitalier a considérablement augmenté ces dernières années. Il est principalement isolé chez des patients en unité de réanimation et est le germe le plus incriminé dans les infections associées aux soins (IAS).
La résistance aux bêtalactamines [23].
Chez les bacilles à Gram-négatif(BGN) ; il existe des mécanismes de résistance aux bêtalactamines, principalement acquise : la faible affinité pour les PLP, les phénomènes d’imperméabilité et d’efflux, et surtout l’inactivation enzymatique par des protéines, dénommées bêtalactamases en raison de leur affinité pour le noyau bêta-lactame (Figure 1).
Les gènes de résistance des bêtalactamases se situent soit au niveau du chromosome bactérien, soit sur des éléments extra-chromosomiques.
Résistance chromosomique [24]
En ce qui concerne la résistance médiée par le chromosome bactérien, elle peut être due à une mutation spontanée ou à une recombinaison. La mutation est un changement fortuit dans la séquence des acides nucléiques qui peut par exemple transformer la molécule cible d’un antibiotique et rendre l’interaction avec l’antibiotique impossible. Quant à la recombinaison, elle consiste en un transfert de fragments de gènes d’un endroit du chromosome bactérien à un autre. Si ces fragments sont incorporés à des endroits bien précis, ils sont appelés intégrons, alors que s’ils se déplacent librement, il s’agit de transposons.
Résistance extra-chromosomique [24]
La résistance peut provenir de l’acquisition d’ADN étranger par le biais de plasmides, bactériophages ou transposons. On parle alors de transfert horizontal de gènes de résistance et les mécanismes utilisés sont la conjugaison, la transduction et la transposition.
Les plasmides sont des éléments génétiques mobiles constitués de 10 à 400 paires de bases d’ADN. Ils sont autonomes dans la mesure où ils sont capables de se répliquer indépendamment. En effet, un plasmide peut établir une connexion entre une cellule donatrice et une cellule réceptrice, et être transféré dans la cellule réceptrice en même temps qu’il est répliqué dans la cellule donatrice où il demeure. Contrairement aux plasmides, les transposons sont des éléments génétiques incapables de se répliquer par eux-mêmes, mais qui peuvent passer d’un chromosome à un autre, ou d’un chromosome à un plasmide. Les plasmides et transposons déterminent la résistance aux antibiotiques. En effet, une bêtalactamase spécifique à une bactérie peut apparaître chez d’autres espèces par la suite, au vu du transfert relativement facile de matériel génétique entre les différentes bactéries.
Classification des bêtalactamases à spectre élargi
La classification d’Ambler [25] comporte quatre groupes A, B, C et D (Tableau 3). Les bêtalactamases de classe A, C et D comporte une sérine active responsable de l’ouverture du cycle beta-lactame. À l’opposé, les bêtalactamases de classe B ont besoin d’un ou deux atomes de zinc ionisé (Zn2+) pour hydrolyser leur substrat et sont ainsi couramment appelées sous le nom de « métallo-enzymes ».
Schématiquement, les bêtalactamases de classe A sont sensibles à l’action de l’acide clavulanique, du sulbactam et du tazobactam qui sont des inhibiteurs des bêtalactamases. On y trouve la majorité des bêtalactamases retrouvées chez E. coli, comme TEM, SHV, des bêtalactamases à spectre élargi (BLSE) comme les CTX-M, et des carbapénèmases comme KPC et certains variants de GES (mutation Gly170Ser ou Gly170Asn).
Les bêtalactamases de classe B sont principalement des carbapénèmases comme IMP et VIM, elles sont inhibées par l’EDTA.
Les bêtalactamases de classe C sont les céphalosporinases de type AmpC, inhibées par la cloxacilline.
Enfin les bêtalactamases de classe D sont des oxacillinases, qui constituent une famille extrêmement composite en termes de spectre d’hydrolyse.
La classification de Bush et al. est plus ramifiée [26] notamment avec la présence de sous-classes pour les bêtalactamases de classe A (Tableau 3).
Epidémiologie sur les EBLSE
Un aperçu à grande échelle de la prévalence des EBLE dans les différentes régions du monde (figure 3) montre une répartition inhomogène à l’échelle mondiale, avec par ordre décroissant de prévalence, l’Amérique du Sud, l’Asie/région pacifique, l’Europe et les Etats-Unis [13]. Il existe quelques données provenant d’études régionales pour le continent africain qui laissent présager d’une forte prévalence [14]. Ces aspects descriptifs de prévalence, confirment l’isolement constamment croissant de souches d’EBLSE dans les prélèvements à visée diagnostique au cours de la dernière décennie [15].
Différents types de BLSE
Anciennes BLSE
BLSE de type TEM (Temoneira)
De nombreux dérivés de TEM-1/2 (> 150) ont été décrits à ce jour, dont plus de 100 avec un phénotype de BLSE. Bien que fréquemment retrouvées chez E. coli et K. pneumoniae, les BLSE de type TEM ont aussi été rapportées parmi les autres membres de la famille des entérobactéries ainsi que P. aeruginosa [34 – 35]. En Europe, les BLSE de type TEM les plus fréquentes sont TEM-24 chez Enterobacter aerogenes, TEM-3 et TEM-4 chez K. pneumoniae, et TEM-52 chez Salmonella enterica et E. coli [30]. Les mutations responsables de l’élargissement de spectre ont généralement lieu au niveau de 4 «hot spots» de la protéine (positions 104,164, 238 et 240) [28]. A noter que certains dérivés de TEM (environ 30) ne sont pas des BLSE mais présentent une diminution de sensibilité aux inhibiteurs des bêtalactamases, ce sont les TRI (pour TEM Résistantes aux Inhibiteurs) [34].
BLSE de type SHV (Sulfhydryl Variable)
La majorité des dérivés de SHV-1 (> 60) ont un phénotype de BLSE, avec SHV-5 et SHV-12 étant les mutants les plus fréquents en Europe [30]. Les BLSE de type SHV ont été détectées parmi de nombreuses entérobactéries (notamment K. pneumoniae) mais aussi chez P. aeruginosa et Acinetobacter spp. [34 – 35]. Comme les dérivés de TEM, les mutations dans SHV-1 (68% d’identité avec TEM-1) ont lieu classiquement au niveau de quelques positions (notamment 238 et 240) [28]. Enfin, le gène codant pour SHV-12 a été décrit en association avec le déterminant plasmidique de résistance aux quinolones, QnrB [30].
Nouvelles BLSE
BLSE de type CTX-M (Céfotaximase -Munich)
Ces enzymes «émergentes» pourraient représenter très prochainement les BLSE les plus fréquentes au sein des entérobactéries au niveau mondial après une diffusion rapide depuis le milieu des années 90 [34 – 35 – 36 – 37]. Au niveau de leur spectre d’activité, elles hydrolysent préférentiellement le cefotaxime, d’où leur nom de céfotaximases [36]. En effet, les bactéries productrices de CTX-M sont résistantes au cefotaxime (CMI > 64 μl/mL) et plus ou moins sensibles à la ceftazidime (CMI de 2 à 8 μl/mL), tandis que les CMI de l’aztréonam sont variables [33]. Au niveau structural, les CTX-M ne sont pas proches des bêtalactamases de type TEM ou SHV (< 40 % d’identité) [36]. A ce jour, de nombreuses variantes de CTX-M ont été décrits (>50), et sont classés en 6 groupes phylogénétiques distincts : CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9, CTX-M-25 et CTX-M-45 [38].
Les enzymes Toho-1/2, décrites au Japon, sont très proches structuralement des CTX-M et sont donc classées parmi celles-ci [36]. A noter que certaines variantes (ex. CTX-M-15, CTX-M-32) avec une activité de ceftazidimase élevée (CMI > 256 μl/mL) ont été décrit (mutation ponctuelle en position 240) [36 – 38].
Les progéniteurs des CTX-M ont été identifiés sur le chromosome de Kluyvera spp. qui est une entérobactérie non pathogène environnementale. En effet, les progéniteurs des gènes codant pour les CTX-M des groupes 1 et 2 et pour celles des groupes 8 et 9 sont respectivement K. ascorbata et K. georgiana, tandis que les sources des CTX-M des groupes 25 et 45 restent inconnues [39]. Depuis leurs progéniteurs, les gènes ont été capturés grâce à des éléments génétiques mobiles type séquence d’insertion (ex. ISEcp1, ISCR1) ou à des phages, et transférés sur des plasmides conjugatifs qui ont ensuite diffusé parmi les entérobactéries pathogènes [28 – 38 – 39]. Les souches productrices de CTX-M ont été initialement rapportées de façon sporadique à la fin des années 80 au Japon (FEC-1), en Europe (MEN-1, CTX-M-1) et en Argentine (CTX-M-2) [36].
BLSE de type PER (Pseudomonas Extended Resistance)
L’enzyme PER-1, initialement découverte en 1993 chez P. aeruginosa en Turquie, est fréquente chez P. aeruginosa et Acinetobacter spp. mais a aussi été détectée chez S. enterica sérovar Typhimurium, Providencia spp, Proteus mirabilis et Alcaligenes faecalis [22]. En Turquie, une étude récente a montré que 32 % des souches résistantes à la ceftazidime de P. aeruginosa et 55 % de celles de A. baumannii étaient productrices de PER-1 [33]. Une seconde enzyme, PER-2 (86 % d’identité avec PER-1), a été détectée en 1996 chez S. enterica sérovar Typhimurium en Argentine, et depuis chez d’autres entérobactéries, Vibrio cholerae et A. baumannii [22 – 33]. Tandis que PER-1 est surtout présente en Turquie et en Corée du Sud (quelques cas décrits en Italie, France et Belgique), PER-2 n’a été détectée qu’en Amérique du Sud. Enfin, une souche de P. aeruginosa produisant à la fois PER-1 et la carbapénèmase VIM-2 a été détectée en Italie [22].
BLSE de type VEB (Vietnam Extended-spectrum Betalactamase)
L’enzyme VEB-1 (38 % d’identité avec PER-1) a été retrouvée en 1996 chez une souche d’E. coli isolée chez un patient vietnamien puis chez P. aeruginosa en Thaïlande [22 – 33]. A ce jour, 4 dérivés de VEB-1 ont aussi été décrits (VEB-2 à VEB-5). VEB-1 a été détectée chez P. aeruginosa au Koweït, en Chine, en Inde et au Bangladesh, chez A. baumannii en France, en Belgique et en Argentine, chez P. stuartii en Algérie, chez Enterobacter cloacae et Achromobacter xylosoxidans en France, et chez E. coli au Canada [33]. Plusieurs épidémies nationales ont été rapportées : A. baumannii VEB-1 en France et en Belgique ; P. mirabilis VEB-1 en Corée du Sud ; et E. cloacae en Chine. Enfin, à noter que le gène codant pour VEB-1 est souvent localisé au sein d’un intégron et peut donc être associé à d’autres gènes de résistance comme qnrA, déterminant plasmidique de la résistance aux quinolones [33].
BLSE de type GES (Guyana Extended-Spectrum Betalactamase)
Les BLSE de type GES sont de plus en plus rapportées chez les BGN, notamment P. aeruginosa, E. coli et K. pneumoniae. GES-1 a été initialement décrite chez une souche de K. pneumoniae isolée en 1998 en France puis en Argentine, au Brésil, au Portugal et aux Pays-Bas [10d]. A ce jour, 9 variants différents ont été décrits dont GES-2 en Afrique du Sud, GES-5 à GES-8 (GES-7 = IBC-1 ; GES-8 = IBC-2) en Grèce, GES-3 et GES-4 au Japon, GES-5 en Corée du Sud, en Chine et au Brésil, et GES-9 en France [33]. A noter que, contrairement à la plupart des BLSE, GES-1 n’hydrolyse pas l’aztréonam et surtout GES-2 hydrolyse les carbapénèmes en étant moins sensible aux inhibiteurs des bêtalactamases. Par une unique mutation, GES-2 est le premier exemple de BLSE avec un élargissement du spectre d’activité aux carbapénèmes ; depuis, 4 autres dérivés ont été décrits (GES-4 à GES-6, GES-8) [33]. De façon inquiétante, des souches de P. aerginosa produisant GES-1 et la carbapénèmase VIM-11 et de E. coli produisant GES-7 et la carbapénèmase VIM-2 ont été décrites respectivement en Argentine et en Grèce. Enfin, plusieurs épidémies de BGN producteurs de BLSE de type GES ont été rapportées : K. pneumoniae en Corée du Sud, au Portugal et en Grèce, S. marcescens aux Pays-Bas, et P. aeruginosa en Afrique du Sud [33].
Autres BLSE de classe A
L’enzyme SFO-1 (Serratia fonticola) n’a été détectée qu’une seule fois chez une souche de E. cloacae isolée au Japon en 1988 [33].
L’enzyme BES-1 (Brazilian extended-spectrum β-lactamase) n’a été isolée qu’une seule fois à partir d’une souche de S. marcescens au Brésil en 1996 [33].
L’enzyme BEL-1 (Belgium extended-spectrum β-lactamase) a été identifiée dans une souche de P. aeruginosa en Belgique en 2004. De récents travaux suggèrent que le gène codant pour BEL-1 pourrait disséminer dans les souches de P. aeruginosa en Belgique [33].
L’enzyme TLA-1 (Tlahuicas – tribu indienne) a été décrite dans une souche de E. coli isolée au Mexique en 1993. Depuis, plusieurs cas de bactériémies et d’infections urinaires nosocomiales dues à une souche de K. pneumoniae produisant à la fois SHV-5 et TLA-1 ont été rapportés au Mexique. A noter que TLA-1 n’a été identifié qu’au Mexique [33].
Le gène codant l’enzyme TLA-2 est porté par un plasmide de 47 kb (pRSB101) isolé à partir d’eaux usées de traitement de plantes en Allemagne en 2002.
Cependant, l’espèce hébergeant ce déterminant n’a pas pu être identifiée et aucune souche TLA-2-positive n’a été décrite à ce jour.
BLSE de type OXA (Oxacillinase)
Bien que les BLSE appartiennent souvent à la classe A, plusieurs oxacillinases (classe D et classe 2d) ont des propriétés de BLSE [34 – 35 – 40]. Les bêtalactamases de type OXA confèrent la résistance à l’ampicilline et à la céfalotine, et sont caractérisées par une forte activité hydrolytique des pénicillines M (oxacilline, cloxacilline). De plus, elles sont faiblement inhibées par l’acide clavulanique [35]. La plupart des bêtalactamases de type OXA n’hydrolysent pas de façon significative les C3G/C4G mais l’évolution par mutation(s) ponctuelle(s) vers un élargissement du spectre a dû avoir lieu comme pour les dérivés de TEM/SHV2, [33].
Les bêtalactamases de type OXA représentent une famille phylogénétiquement très hétérogène et les BLSE de type OXA dérivent de OXA-10, de OXA-13, de OXA-2 ou sont non reliées (OXA-18, -45) [35 – 33]. Bien que la plupart des BLSE dérivées de OXA-10 confèrent une résistance plus élevée au cefotaxime, les activités enzymatiques des BLSE de type OXA sont très variables. Les BLSE de type OXA sont principalement retrouvées chez P. aeruginosa, mais ont aussi été détectées chez d’autres BGN dont les entérobactéries [35 – 33]. Découvertes initialement chez P. aeruginosa en Turquie, elles ont ensuite été décrites en France, à Taïwan, en Corée et aux Etats-Unis. Malheureusement, très peu d’études épidémiologiques ont été menées pour évaluer la dissémination des BLSE de type OXA [33].
Spectre d’inactivation des bêtalactamases à spectre élargi
Devant un phénotype de résistance de type pénicillinases, il y a lieu de distinguer les enzymes de la classe A, sensibles aux inhibiteurs enzymatiques : acide clavulanique ou tazobactam par exemple de celles résistantes comme les pénicillinases de classe D. Devant une résistance aux C3G (cefotaxime, ceftriaxone, ceftazidime), il y’a des différences de comportement en particulier pour les C4G entre BLSE, céphalosporinase hyper-produite (CASE HP), céphalosporinase à spectre élargi (CASESE) et carbapénèmase (CARB) (Tableau 4).
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Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE
I. ENTEROBACTERIES
1. Généralités
1.1. Définition
1.2. Historique
1.3. Classification
1.4. Habitat
2. Caractères bactériologique des entérobactéries
2.1. Morphologie
2.2. Culture
2.3. Biochimie.
2.4. Antigènes
3. Pouvoir pathogène
4. La résistance aux bêtalactamines.
II. LES BETALACTAMASES A SPECTRE ELARGI(BLSE)
1. Définition
2. Classification des bêtalactamases à spectre élargi
3. Epidémiologie sur les EBLSE
4. Différents types de BLSE
4.1. Anciennes BLSE
4.2. Nouvelles BLSE
5. Spectre d’inactivation des bêtalactamases à spectre élargi
III. CLASSIFICATION DES BETALACTAMINES
1. Les pénicillines (pénames)
2. Les pénèmes
3. Céphalosporines (céphèmes)
4. Les monobactames
DEUXIEME PARTIE
I. CADRE, TYPE ET PERIODE D’ETUDE
1. Cadre d’étude
2. Type et période d’étude
II. MATERIELS ET METHODE
1. Matériels
1.1. Echantillonnage
1.2. Interprétation des résultats
2. Méthodologie
2.1. Sélection des souches d’entérobactéries
2.2. Ré-isolement et ré-identification (Figure 4)
2.3. Préparation de la solution d’EDTA
2.4. Antibiogramme
2.5. Principe de la détection des classes de BLSE
2.6. Interprétation des résultats
III. RESULTATS
1. Répartition des souches selon le sexe
2. Répartition des souches selon l’âge
3. Répartition des souches selon l’origine des prélèvements
4. Répartition des souches selon la nature du prélèvement
5. Répartition des souches selon l’espèce
6. Répartition des souches selon la classe de bêtalactamases.
7. Répartition des espèces d’entérobactéries selon la classe de bêtalactamases
8. Répartition des classes de bêtalactamases selon la provenance.
DISCUSSION
CONCLUSION ET RECOMMANDATIONS
PERSPECTIVES
REFERENCES
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