Cancer et cibles moléculaires

Cancer et cibles moléculaires

Terminologie et épidémiologie

Il y a plusieurs siècles, le cancer n’était pas aussi fréquent car l’espérance de vie était moins élevée. La peste, la tuberculose ou encore la diphtérie représentaient les premières causes de mortalité. Depuis le 20ème siècle, avec l’accroissement de l’espérance de vie et l’augmentation de l’exposition à des éléments cancérogènes (tabac, aliments riches, polluants chimiques…), le cancer est devenu l’une des premières causes de mortalité. Ainsi, dans le monde, plus de 11 millions de personnes sont diagnostiquées avec un cancer chaque année, et il tue environ 7 millions de personnes tous les ans. Selon l’OMS (l’Organisation Mondiale de la Santé), le nombre de cancers pourrait atteindre 15 millions de nouveaux cas par an dès 2020. Selon les dernières statistiques publiées pour l’Europe par l’OEC (Observatoire Européen du Cancer) en 2006, le nombre de cas incidents (nouveaux cas diagnostiqués) de cancer est d’environ 2,4 millions (en dehors des cancers de la peau non mélanomes) et le nombre de décès d’environ 1,2 millions. Le cancer est moins fréquent chez la femme (45% des cas diagnostiqués) que chez l’homme (55% des cas diagnostiqués) (figure 1).

Une « tumeur » (ou néoplasme) est une masse anormale de tissu qui peut être bénigne ou maligne (cancéreuse). Notre corps étant composé de centaines de catégories différentes de cellules, il existe alors des centaines de cancers qui peuvent être classés en fonction du type cellulaire affecté : le carcinome (tissus glandulaires et épithéliaux), le sarcome (tissu conjonctif), le lymphome (ganglions lymphatiques), le myélome (moelle osseuse) et la leucémie (éléments constitutifs du sang). L’une des caractéristiques du cancer est la prolifération anarchique de cellules anormales qui peuvent se propager dans d’autres organes, via la circulation sanguine ou lymphatique, formant des « métastases » (figure 2). En effet, selon le type de cancer, les cellules vont acquérir des capacités de motilité et d’invasion différentes. Le décès par cancer est dû principalement au développement de ces métastases au niveau des organes vitaux.

Tumorigenèse : Dommages à l’ADN 

Les cancers sont des pathologies avec pour origine principale une altération génétique qui est somatique dans 90% des cancers humains ; les 10% restants sont associés à une altération constitutionnelle (facteur héréditaire). L’ADN (Acide DésoxyriboNucléique) est le support de l’information génétique, il est empaqueté sous forme de chromosomes par association à des protéines chromatiniennes au sein des noyaux des cellules eucaryotes. Selon le modèle de Watson et Crick (figure 3A) [18], la molécule d’ADN est formée de deux brins complémentaires enroulés en hélice de façon antiparallèle, donnant naissance à un grand et à un petit sillon.

Ces deux brins sont constitués d’un enchaînement précis (séquence) d’unités élémentaires que sont les nucléotides (dATP, dGTP, dCTP et dTTP). Un nucléotide est composé d’un phosphate relié à un sucre, le 2’-désoxyribose, lui-même relié à une base azotée. L’adénine (A) et la guanine (G) sont des bases puriques, la cytosine (C) et la thymine (T) des bases pyrimidiques. Les liaisons hydrogènes qui lient les bases des deux brins complémentaires vont stabiliser la double hélice (figure 3B).

Cet ADN est continuellement soumis à des agressions. Ces altérations sont soit dues à des facteurs internes (mutations, additions ou délétions au niveau de la séquence d’ADN, modifications épigénétiques), soit dues à des facteurs externes (virus, bactéries, agents chimiques ou radioactifs, radiations électromagnétiques). En majeure partie, les modifications de l’ADN de nos cellules passent inaperçues car les systèmes de réparation de l’ADN corrigent ces défauts. Mais dans de rares cas, une mutation peut subsister et modifier l’expression de facteurs qui contrôlent la prolifération cellulaire, comme les oncogènes ou les suppresseurs de tumeur ; ces dérégulations conduiront à plus ou moins long terme à l’apparition d’un cancer. Les lignes classiques de traitements antitumoraux sont représentées par la chirurgie et la radiothérapie (traitements locaux-régionaux), ainsi que la chimiothérapie (traitement systémique, agents chimiques) qui est la base de nombreux travaux de recherche du laboratoire. Pour augmenter l’efficacité et diminuer les phénomènes de résistance et de toxicité, ces traitements sont le plus souvent combinés dans le cadre d’une stratégie programmée. Enfin, on a plus rarement recours à l’hormonothérapie ou à l’immunothérapie (traitement systémique, agents biologiques), pour les cancers sensibles à ces traitements. Il est important de rappeler que, selon le type de traitement employé, les cellules répondront de manière différente et y seront plus ou moins sensibles (radiosensibilité ou chimiosensibilité des cellules tumorales).

Historique de la chimiothérapie

Au 19ème siècle, diverses méthodes « anticancéreuses » étaient déjà à l’étude, le Pr Flores y avait décrit les propriétés anti-tumorales d’un lézard d’Amérique Centrale. W. Harvey proposa également de couper l’apport vasculaire de la tumeur puisqu’il était connu que la ligature du cordon testiculaire induisait la nécrose du testicule ; ce concept fut d’ailleurs repris un siècle et demi plus tard par J. Folkman sous le nom de thérapie antiangiogénique [19]. Au début du 20ème siècle, P. Ehrlich montra l’affinité de certaines matières colorantes pour les cellules vivantes (tel que le bleu de méthylène pour le tissu nerveux). Par ailleurs, sachant que certains colorants tuent les micro-organismes, il poursuivit ses recherches afin d’utiliser ces colorants à des fins thérapeutiques. En 1909, il mit au point un dérivé de l’arsenic efficace contre la syphilis, le Salvarsan, premier médicament de synthèse qu’il perfectionne par la suite sous le nom de Néosalvarsan, utilisé jusqu’en 1945 et remplacé alors par la pénicilline. Sa contribution à la mise au point de nouvelles techniques expérimentales, comme l’utilisation des cultures cellulaires pour sélectionner des substances disposant d’un effet thérapeutique potentiel (anti-bactérien, anti tumoral…), lui vaut d’être considéré comme le père de la chimiothérapie [20]. La méchlorétamine (ou Caryolisine®), appelée plus communément gaz moutarde, est la première molécule à avoir fait la preuve d’une efficacité significative pour le traitement du cancer. C’est en 1946 que sont publiés plusieurs cas de régressions tumorales chez des patients atteints de lymphome et traités par la moutarde azotée [21]. Dès 1945, plusieurs dérivés de la moutarde azotée furent développés, dont certains sont encore utilisés aujourd’hui tels que le chlorambucile et le melphalan. D’autre part, une des premières applications du principe de sélectivité (déterminant l’index thérapeutique) sera la découverte des inhibiteurs de l’acide folique comme le méthotrexate ou encore des antimétabolites comme le 5-Fluorouracile (5-FU). Cependant, jusque dans les années 80, la plupart des médicaments anticancéreux ont été sélectionnés et développés tout en ignorant bien souvent leur mécanisme d’action au niveau cellulaire. A présent, une phase d’étude pré-clinique permet d’identifier le mécanisme d’action moléculaire, d’étudier l’effet de la nouvelle molécule sur les cellules et sur l’animal afin de déterminer les organes cibles potentiels.

Enfin, l’histoire retiendra probablement l’Imatinib (Glivec®) comme le premier agent de chimiothérapie ciblée, sélectionné selon un processus radicalement différent. Ce composé a été synthétisé spécifiquement pour inhiber l’activité enzymatique de la protéine de fusion bcrabl suite à la découverte de la translocation t(9;22) dans la leucémie myéloïde chronique. Cependant, en l’état actuel des connaissances, tous les types de cancers n’ont pas de cibles clairement identifiées ou utilisables. Il est donc important de continuer à développer de nouvelles molécules à large spectre d’action présentant une plus grande tolérance et une moins forte toxicité. Cette recherche passe en grande partie par l’exploration de la nature comme source d’agents actifs, leur structure pouvant servir de base à l’élaboration de nouveaux médicaments pour lutter contre les cancers qui ne disposent pas ou peu de traitements à ce jour. Les plantes, les microorganismes et, plus récemment, les organismes marins représentent les principales sources d’agents anticancéreux. Depuis le début de la chimiothérapie, il a été estimé que plus de 60% des nouvelles entités chimiques introduites entre 1981 et 2006 étaient des produits naturels ou des dérivés de ces produits naturels [22].

Phénomènes de résistance

La recherche de nouvelles molécules est d’autant plus importante étant donné que 50% des tumeurs présenteraient d’emblée des phénomènes de résistance aux traitements antitumoraux. De plus certaines tumeurs peuvent développer une résistance au cours du traitement, la population cancéreuse est en effet souvent hétérogène et une sélection de clones résistants peut se produire [23]. La résistance au traitement serait due à :

– Une faible concentration intracellulaire de drogue (augmentation de l’efflux ou diminution de l’entrée) (ex : anthracyclines)
– L’inactivation de la drogue par des mécanismes de détoxification, comme l’interaction au glutathion (GSH) (ex : alkylants) ou à des métallothionéines qui sont des détoxifiants des métaux lourds (ex : cisplatine)
– La diminution de l’activité de la drogue, métabolisme de l’agent au sein de la cellule (conversion des antimétabolites en nucléotides, métabolisme hépatique ou élimination rénale)
– L’augmentation de la production d’un récepteur ou d’une enzyme impliquée dans la tumorigenèse par amplification de gène (ex : methotrexate en quantité insuffisante si amplification de la dihydrofolate réductase)
– La diminution de l’affinité à un récepteur ou à une enzyme impliquée dans la tumorigenèse (ex : les inhibiteurs de kinase ne pourront plus interagir avec les kinases mutées comme le Glivec®)
– L’augmentation de la réparation de l’ADN (ex : alkylants)
– La diminution de l’activité d’une enzyme cible (ex : inhibiteurs de Topoisomérase II telle que la doxorubicine)
– L’augmentation de l’expression du gène de resistance multidrogue mdr1 qui code pour la glycoprotéine P, une pompe d’efflux transmembranaire dépendante de l’ATP. Dans certains cas cette résistance peut être inversé par l’utilisation de cyclosporine, de tamoxifen ou de bloqueurs de canaux calciques comme le verapamil.

Afin de remédier à ces phénomènes de résistance, des combinaisons thérapeutiques sont possibles.

Efficacité du traitement chimiothérapeutique

Sachant que la majorité des cellules tumorales se multiplient plus rapidement que les cellules saines, les molécules impliquées directement ou indirectement dans les mécanismes de prolifération cellulaire, et plus particulièrement l’ADN nucléaire et les protéines nucléaires associées, représentent de multiples cibles privilégiées des traitements antitumoraux classiques. Afin d’augmenter l’efficacité du traitement, les agents cytotoxiques peuvent être associés dans le cadre d’un protocole de polychimiothérapie. L’utilisation simultanée de plusieurs médicaments repose sur la recherche d’un meilleur indice thérapeutique basé sur l’utilisation de molécules ayant des mécanismes d’actions différents. Par exemple, le 5-FU combiné à la leucovorin est le seul protocole depuis plus de 40 ans à montrer la plus forte activité contre les cancers colorectaux. Depuis peu, le protocole XELOX (combinaison de l’oxaliplatin par voie intraveineuse et de la capecitabine par voie orale) a montré son efficacité chez des patients présentant un cancer colorectal métastasique [24].

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Table des matières

CHAPITRE I : Introduction
1. Cancer et cibles moléculaires
1.1. Terminologie et épidémiologie
1.2. Tumorigenèse : Dommages à l’ADN
1.3. Historique de la chimiothérapie
1.4. Phénomènes de résistance
1.5. Efficacité du traitement chimiothérapeutique
2. Traitement systémique, agents chimiques
2.1. Agents ciblant les voies signalétiques
2.2. Anti-métabolites
2.3. Antitubulines
2.4. Inhibiteurs de Topoisomérases
2.5. Agents intercalants de l’ADN
2.6. Agents clivant l’ADN
2.7. Agents alkylant l’ADN
2.7.1. Définition
2.7.2. Agents alkylant le grand sillon
2.7.3. Alkylants du petit sillon
3. Le S23906-1
3.1. Découverte de l’acronycine et synthèse de dérivés pentacycliques
3.2. Mécanisme d’action du S23906-1
3.2.1. Mécanisme d’action cellulaire du S23906-1
3.2.2. Détoxification cellulaire du composé
3.2.3. L’ADN comme cible moléculaire du S23906-1
3.3. Bilan mécanistique
3.4. Déstabilisation de la double hélice
3.5. Objectifs
4. GAPDH
4.1. Expression et structures de la GAPDH
4.1.1. Gène(s) de la GAPDH
4.1.2. Régulation de l’expression de la GAPDH
4.1.3. Structure et activité glycolytique de l’enzyme
4.1.4. Modifications post-traductionnelles de la GAPDH
4.2. Localisation et fonctions extracellulaires
4.3. Localisation et fonctions cytoplasmiques
4.3.1. Interaction avec la membrane plasmique, échanges d’informations avec le milieu extracellulaire
4.3.2. Interaction avec les tubulines, interface RE-golgi
4.3.3. Localisation mitochondriale, rôle anti- ou pro-apoptotique
4.3.4. Activité kinasique de la GAPDH, implication dans la transmission de signaux et dans l’infection des cellules
4.4. Interface Cytoplasme/Noyau
4.4.1. Régulation de l’expression de certains ARN, implication dans l’inflammation, l’infection et l’export d’ARNt
4.4.2. Translocation nucléaire de la GAPDH
4.5. Fonctions nucléaires
4.5.1. Maintien structural de la chromatine
4.5.2. Réplication
4.5.3. Régulation de la transcription
4.5.4. Réparation des lésions de l’ADN
4.5.5. Interaction Acides Nucléiques et reconnaissance d’adduits
4.6. Bilan des fonctions de la GAPDH
4.6.1. Diabète, inflammation, infection
4.6.2. Survie, prolifération cellulaire et maintenance
4.6.3. Activité antiproliférative et maladies neurodégénératives
CHAPITRE II : Objectifs des travaux de thèse
CHAPITRE III : Résultats et discussions
1. Interaction à l’ADN et déstabilisation
1.1. Validation de l’interaction du S23906-1 aux guanines
1.2. Déstabilisation de l’ADN
2. Recherche des partenaires protéiques des adduits
2.1. Identification d’un site de fixation de facteurs de transcription ciblé par le S23906-1
2.1.1. Utilisation de membranes TranSignalProtein/DNA Array
2.1.2. Protéines ciblant la séquence Smad-SBE
2.1.3. Vérification de l’alkylation de Smad-SBE par le S23906-1
2.2. Recherche du/des partenaire(s) protéique(s)
2.2.1. Protéines recrutées sur l’oligonucléotide Smad-SBE
2.2.2. HMG-B1, une protéine aux multiples fonctions nucléaires
2.2.3. Localisation nucléaire de la GAPDH
2.3. Validation des interactions
2.3.1. Interaction HMG-B1/Smad-SBE alkylé ou non
2.3.2. Interaction GAPDH/Smad-SBE alkylé ou non
2.3.3. Interaction GAPDH/autres séquences alkylées ou non
2.3.4. Interaction GAPDH/Smad-SBE alkylé par d’autres composés
3. Spécificité de fixation de la GAPDH à l’ADN
3.1. Identification de séquences consensus par CAST-ing
3.2. Validation du consensus par retard en gel, ADN non alkylé
3.3. Validation du consensus par retard en gel, ADN alkylé par le S23906-1
3.4. Stœchiométrie et domaine d’interaction de la GAPDH à l’ADN
4. Translocation nucléaire de la GAPDH après traitement au S23906-1
4.1. Etude de la localisation cellulaire de la GAPDH exogène après traitement au S23906-1
4.1.1. Mise au point de la transfection dans les cellules A549
4.1.2. Localisation cellulaire de la GAPDH-GFP : Time Lapse
4.1.3. Etude de l’interaction entre la GAPDH chimérique et Smad-SBE
4.1.4. Conséquences de la surexpression globale de la GAPDH
4.2. Etude de la localisation cellulaire de la GAPDH endogène après traitement au S23906-1
4.2.1. Cellules A549
4.2.2. Cellules HT-29
4.2.3. Validation par western-blot
5. Conséquences cellulaires de l’interaction GAPDH/adduits
5.1. Cellules HT-29
5.1.1. Invalidation transitoire de la GAPDH
5.1.2. Survie des cellules transfectées avec le siRNA puis traitées au S23906-1
5.2. Cellules A549
CHAPITRE IV : Conclusion

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