Soutenance mémoire
Biologie moléculaire
DISCUSSION
Sur le plan histopathologique, les astrocytomes pilocytiques et les tumeurs glioneuronales de bas grade sont parfois difficiles à distinguer entre eux mais aussi à distinguer des gliomes diffus, notamment en cas de prélèvement biopsique. Si la distinction entre AP et TGN ou XAP et GG n’a pas d’implication thérapeutique (ensemble de tumeurs de bas grade de malignité), la distinction entre gliome circonscrit (AP, TGN) et gliome diffus est fondamentale dans la prise en charge du patient. Le diagnostic définitif repose sur un faisceau d’arguments incluant, de façon presque incontournable, les marqueurs moléculaires. Du fait de l’accès parfois limité aux plateformes de biologie moléculaire, la possibilité de détecter le produit d’un gène muté par technique immunohistochimique représente un atout majeur dans la démarche diagnostique. Il s’agit en effet d’une technique rapide, simple, peu coûteuse et disponible dans tous les laboratoires d’Anatomie Pathologique. Plusieurs études ont montré que l’IHC anti-BRAF-V600E avait une sensibilité et une spécificité supérieures à 95% dans les mélanomes cutanés (7,28,29), mais sa fiabilité reste à démontrer sur de larges séries de tumeurs primitives du SNC. Nous avons réalisé une étude IHC à l’aide de l’anticorps anti-BRAF-V600E sur 165 tumeurs gliales et glioneuronales circonscrites issues de 140 patients. Il existait une expression de BRAF-V600E dans 62,5% des GG/GC (grades I et III), 33% des XAP (grades II et III), 5% des AP/APM et 0% des DNT. Ces résultats sont comparables à ceux publiés dans la littérature (6,14,17,22,33). Pour 39 cas (issus de 39 patients), l’expression IHC de la protéine BRAF mutée a pu être corrélée aux données de biologie moléculaire (séquençage direct et/ou Q-PCR). En considérant la BM comme le gold standard, l’immunohistochimie avait une sensibilité de 94%, une spécificité de 86,5%, une valeur prédictive positive (VPP) de 84% et une valeur prédictive négative (VPN) de 95%, ce qui est satisfaisant bien qu’inférieur aux résultats obtenus dans les mélanomes (7,28,29). Ces résultats sont cependant à nuancer. La plupart des prélèvements analysés ici en BM présentait un immunomarquage peu intense ou intéressant une minorité de cellules tumorales, c’est-à-dire un immunomarquage ambigu. L’ensemble des tumeurs de notre série n’a pu être testé pour des contraintes de temps mais aussi du fait de l’épuisement d’un grand nombre de blocs. Ce biais de sélection pourrait avoir artificiellement baissé la spécificité du test IHC. Par ailleurs, les XAP (9 cas) et les DNT (7 cas) étaient peu représentés dans notre cohorte. Ceci pourrait expliquer pourquoi les fréquences observées de la mutation BRAF-V600E étaient inférieures à celles rapportées dans la littérature (44,5% vs 66% pour les XAP/XAPA et 0% vs 25% pour les DNT) (9,12,22).
Comme déjà mentionné, 24,1% des prélèvements de GG/GGA de notre série n’exprimaient BRAF-V600E que dans le contingent neuronal. Cette observation a déjà été rapportée dans la littérature sans être approfondie (17). Cette constatation amène pourtant à discuter : 1) le seuil de détection des techniques de BM, 2) l’efficacité (ou du moins les mécanismes d’action) des thérapies ciblées, et 3) l’histogenèse des GG.
1) En ce qui concerne le seuil de détection des techniques de BM, les GG présentent une proportion variable de cellules ganglionnaires, allant de rares cellules éparses à un authentique GC (tumeur entièrement constituée de cellules ganglionnaires sans contingent tumoral glial) (30). Le plus souvent, le contingent tumoral glial est prédominant. Le séquençage Sanger n’a pas détecté de mutation dans 10 cas de GG/GGA immunopositifs pour BRAF. Dans 3/10 cas, l’immunomarquage n’intéressait que quelques cellules ganglionnaires mais avec une intensité de marquage significative. Dans 7/10 cas, la présence d’une mutation BRAF-V600E a été confirmée uniquement en Q-PCR (notamment dans 2 des 3 cas avec un marquage de rares cellules ganglionnaires). Cette discordance entre les deux techniques de BM s’explique par des seuils de détection différents. Le seuil de détection du séquençage direct est de 20% alors qu’il est de 5% pour la Q-PCR (32). Les 7 cas discordants en BM avaient un pourcentage d’allèle muté inférieur à 20%. Le seuil élevé du séquençage Sanger remet en question l’indication de cette technique dans les GG, qui renferment souvent une minorité de cellules ganglionnaires. En considérant la Q-PCR seule comme technique de référence, la sensibilité et la spécificité du séquençage Sanger étaient respectivement de 41,5% et 100% avec une VPP de 100% et une VPN de 63%. En prenant également la Q-PCR comme technique de référence, l’IHC avait une sensibilité de 93,5%, une spécificité de 75%, une VPP de 82,5% et une VPN de 90%. L’IHC apparaît donc comme une technique fiable pour détecter la mutation BRAF-V600E dans les tumeurs glioneuronales pauvres en cellules tumorales mutées. Elle permet de plus un contrôle morphologique. Pour rappel, l’anticorps anti-BRAF utilisé ne détecte que le variant BRAF-V600E. L’absence d’immunomarquage n’élimine donc pas une mutation V600 autre (V600K par exemple) (28). Ceci est également vrai pour la PCR spécifique d’allèle BRAF-V600E. Seul le séquençage Sanger permet de détecter les différents variants (mais avec une sensibilité moindre que la Q-PCR car non spécifique de l’allèle muté). Il est à noter qu’aucun cas de notre série ne présentait de mutation autre que la V600E. Les patients porteurs d’autres variants restent néanmoins éligibles aux thérapies ciblées de type vemurafenib ou dabrafenib (34). L’intérêt de nouvelles techniques de BM telles que le pyroséquençage (technique rapide, plus sensible, et de meilleur rendement que le séquençage Sanger) serait à évaluer dans la détection de la mutation BRAF-V600 dans les tumeurs glioneuronales (28). Du fait des applications thérapeutiques, les indications de la recherche de la mutation s’élargissent déjà à d’autres types de tumeurs nerveuses et vont nécessiter des techniques de détection robustes.
2) Il serait intéressant de comparer l’efficacité des thérapies ciblées dirigées contre la protéine mutée BRAF-V600 dans les GG à contingent neuronal majoritaire (voire dans les GC) versus les GG pauvres en cellules ganglionnaires. Qu’en est-il de l’action du vemurafenib ou du dabrafenib dans ces derniers ? Comment explique-t-on la régression ou stabilisation de GG principalement constitués de cellules tumorales gliales BRAF-wild type ? Ce point n’a pas été abordé dans les quelques cas publiés qui ont répondu aux inhibiteurs de BRAF (26,35). Les auteurs ne précisent notamment pas le pourcentage de l’allèle muté ou la nature (gliale et/ou ganglionnaire) des cellules qui expriment la protéine mutée.
Les thérapies ciblées anti-BRAF-V600E ne sont pas complètement spécifiques de la mutation et peuvent également inhiber la voie de signalisation impliquant la forme non mutée de BRAF. A l’état physiologique, l’activation de RAS entraîne la dimérisation de BRAF qui active MEK, qui à son tour active ERK et aboutit à la transmission du signal en aval (Annexe 1). La mutation BRAF-V600E permet l’activation de MEK et ERK sans activation préalable de RAS. BRAF muté agit sous une forme monomérique qui est la cible des inhibiteurs de BRAF. De façon intéressante, quand les inhibiteurs de BRAF interagissent avec les dimères de BRAF, dans certains cas, une seule des molécules du dimère est inhibée ; ceci est à l’origine d’un puissant rétrocontrôle qui stimule l’activation de MEK et ERK et donc renforce la voie de signalisation, plutôt que de l’inhiber. Il s’agit de « l’activation paradoxale » de la voie RAS/RAF/MEK/MAPK (36,37). Dans les AP porteurs d’une fusion BRAF-KIAA1549, la forme tronquée de BRAF forme un dimère et les inhibiteurs de BRAF peuvent stimuler, plutôt que freiner, la croissance tumorale via ce rétrocontrôle positif. Cette activation paradoxale explique également l’apparition de lésions cutanées (carcinomes épidermoïdes, mélanomes) et les modifications de naevus pré-existants chez les patients traités par inhibiteurs de BRAF (37,38). L’association de ces derniers à des inhibiteurs de MEK ou ERK permettrait une suppression plus complète de la voie de signalisation RAS et empêcherait cette activation paradoxale, qui résulte de l’interaction entre les inhibiteurs de BRAF et les dimères de BRAF sauvage. La combinaison d’inhibiteurs de BRAF et de MEK (dabrafenib plus trametinib) a montré une plus grande efficacité et une moindre toxicité comparée aux inhibiteurs de BRAF seuls (39). Les effets indésirables (tumeurs secondaires) des thérapies ciblées sont particulièrement à prendre en compte chez les patients d’âge pédiatrique potentiellement longs survivants.
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Table des matières
LISTE DES ABREVIATIONS
RESUME
INTRODUCTION
MATERIEL ET METHODES
Prélèvements
Etude immunohistochimique
Recherche de la mutation BRAF-V600E par biologie moléculaire
Analyses statistiques
RESULTATS
Données cliniques et radiologiques
Données histopathologiques
Etude immunohistochimique
Analyse moléculaire
DISCUSSION
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES
TABLEAUX ET FIGURES
ANNEXES
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