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Biologie des neutrophiles dans l’espèce bovine
Immunité antibactérienne et granulocytes neutrophiles
Le système immunitaire a pour objectif de maintenir l’homéostasie de l’organisme, en particulier de prévenir la pénétration et la multiplication d’agents pathogènes étrangers : bactéries, virus, parasites le plus souvent, mais aussi cellules tumorales ou issues d’un organisme différent (greffe d’organe, transfusion…). La base de son fonctionnement repose donc sur la distinction entre les composants du référentiel immunitaire (auparavant désigné comme le « soi » immunologique) et des composants étrangers, en particulier lorsqu’ils proviennent d’organismes vivants, grâce à un système de reconnaissance complexe.
L’étude de l’immunité est habituellement séparée en deux grands types : l’immunité innée ou spontanée (dite aussi non spécifique, ce qui est un terme impropre) et l’immunité acquise ou adaptative (dite également spécifique). Cette dichotomie est en réalité artificielle puisque ces deux types d’immunité sont liés et interagissent dès le début d’une réponse immunitaire.
L’immunité innée repose sur des mécanismes déjà fonctionnels avant tout contact préalable avec l’Ag ; leur action est donc immédiate. Lorsqu’une bactérie pathogène parvient à déjouer les mécanismes protecteurs des barrières physico-chimiques (revêtement cutanéomuqueux, escalator muco-ciliaire, pH gastrique, …), la réponse immunitaire spontanée fait intervenir principalement un type de leucocytes, les granulocytes neutrophiles (GNN), en association avec les macrophages.
Ces globules blancs, dont le noyau a un aspect segmenté, jouent un rôle prépondérant dans la réaction inflammatoire et dans le déroulement de la réponse immunitaire. Alors que la rapidité de migration des neutrophiles vers le site inflammatoire et leur capacité d’ingestion de microorganismes sont connus depuis le début du XXème siècle, il a fallu attendre les années 1960 pour montrer que les GNN sont aussi capables de produire des molécules oxydatives bactéricides et de libérer des substances antimicrobiennes (Babior 1973, Klebanoff 1967, et Leher 1969). Ils sont aujourd’hui considérés comme la première barrière de défense vis-à-vis des bactéries lorsque ces dernières réussissent à s’introduire dans l’organisme. Leur courte durée de vie dans le courant sanguin, par rapport aux leucocytes mononuclées notamment, a rendu leur étude difficile et provoqué un certain désintérêt de la part des immunologistes.
Dans les conditions physiologiques
Contrairement à de nombreuses espèces de mammifères chez lesquelles les GNN sont majoritaires parmi les leucocytes sanguins, chez les bovins, les GNN représentent environ 25- 35% de la quantité totale de leucocytes dans les conditions physiologiques (cf. tableau 1) ; par conséquence, les lymphocytes sont majoritaires (58 % des globules blancs). Si l’on considère le volume sanguin total d’un bovin adulte (8% du poids vif environ), le nombre de GNN matures circulants est de l’ordre de 1012 cellules (Paape 1979). En plus de ces GNN circulants se rajoute un pool de GNN matures marginés, c’est-à-dire adhérents à la paroi interne des vaisseaux sanguins. Cette réserve de GNN correspond à 50-60 % du nombre de neutrophiles circulants (Paape 1974).
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PARTIE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE : Immunité antibactérienne et granulocytes neutrophiles
1. Biologie des neutrophiles dans l’espèce bovine
1.1. Numération leucocytaire
1.1.1. Dans les conditions physiologiques
1.1.2. Facteurs de variation de la numération leucocytaire
1.1.2.1. Variations liées à l’âge
1.1.2.2. Variations liées au stade physiologique
1.1.2.3. Variations liées au stress
1.2. Morphologie du neutrophile bovin
1.2.1. Le neutrophile bovin mature
1.2.2. Autres caractères morphologiques des neutrophiles sanguins
1.3. Cycle de vie d’un granulocyte neutrophile
1.3.1. Origine des GNN
1.3.2. Une mort cellulaire programmée
2. Fonctions des granulocytes neutrophiles
2.1. Chimiotactisme
2.1.1. Principe
2.1.2. Les signaux chimiotactiques
2.1.2.1. Le système du complément
i. Définition
ii. Mécanisme d’action
iii. Propriétés biologiques
2.1.2.2. Les médiateurs lipidiques
2.1.2.3. Les molécules bactériennes
2.1.2.4. Les chimiokines
2.1.2.5. Autres signaux chimiotactiques
2.1.3. Bilan du rôle des neutrophiles
2.1.4. Migration guidée par les molécules chimiotactiques
2.1.4.1. Les récepteurs impliqués dans l’attachement des neutrophiles aux cellules endothéliales
2.1.4.2. Adhésion à l’endothélium
i. Première étape : liaison des sélectines
ii. Deuxième étape : activation des neutrophiles grâce aux signaux chimiotactiques
iii. Troisième étape : adhésion des intégrines neutrophiliques aux récepteurs endothéliaux
2.1.4.3. Transmigration des neutrophiles
2.2. Reconnaissance de l’agent pathogène
2.2.1. Rôle des récepteurs Toll-like dans la reconnaissance
2.2.2. Opsonisation
2.2.3. Reconnaissance non immunologique
2.2.4. Les cascades d’activation du granulocyte neutrophile : synthèse
2.3. La phagocytose
2.3.1. Les étapes de la phagocytose
2.3.2. Les granulations des neutrophiles
2.4. La destruction du micro-organisme ingéré
2.4.1. Le système de production de formes réactives de l’oxygène
2.4.1.1. Le complexe NADPH oxydase initie les réactions de formation des FRO
i. La NOX, un assemblage complexe de composants membranaires et cytosoliques
ii. La NOX initie l’explosion respiratoire
2.4.1.2. La formation des autres FRO
2.4.1.3. Mesure de l’activité bactéricide par chimioluminescence
2.4.2. Les enzymes lytiques et les protéines antimicrobiennes
2.4.2.1. Les enzymes lytiques
2.4.2.2. Les peptides antimicrobiens
2.4.2.3. Le lysozyme
2.4.2.4. Les lectines
2.4.2.5. Les protéines chélatrices du Fer
2.4.3. Les conditions d’activation des enzymes dans la vacuole phagocytaire
2.4.4. Le neutrophile et ses limites
2.4.5. Les variations des capacités neutrophiliques
2.5. Le neutrophile du lait
2.6. Le neutrophile, un effecteur incontournable de la défense de l’organisme
2.6.1. Immunodéficience iatrogénique
2.6.2. Immunodéficience héréditaire
2.6.2.1. Immunodéficience et adhésion des neutrophiles : exemple de la LAD
2.6.2.2. Immunodéficience et dysfonctionnement du métabolisme oxydatif : exemple de la CGD
2.6.3. Immunodéficience et métabolisme azoté
2.6.3.1. Les bases du métabolisme azoté chez les ruminants
2.6.3.2. Immunodéficience et hyper-urémie
PARTIE II : ETUDE EXPERIMENTALE
1. Matériel et Méthodes
1.1. Les animaux
1.2. Date et lieu de l’étude
1.3. Alimentation et protocole expérimental
1.3.1. Rationnement pré-essai
1.3.2. Rationnement expérimental
1.3.3. Schéma expérimental
1.4. Prélèvements sanguins
1.4.1. Biochimie
1.4.1.1. Les gaz sanguins
1.4.1.2. Paramètres métaboliques
1.4.1.3. Archivage
1.4.1.4. Autres paramètres biochimiques
1.4.2. Immunologie
1.5. Analyses immunologiques
1.5.1. Préparation des cellules
1.5.1.1. Séparation et purification des neutrophiles
1.5.1.2. Comptage des cellules
1.5.1.3. La cytométrie en flux : principe et utilisation
i. Principe de la cytométrie en flux
ii. La cytométrie en flux : applications
1.5.2. Analyse de l’expression des marqueurs membranaires CD11b et CD62L
1.5.3. Analyse des fonctions cellulaires
1.5.3.1. Préparation du zymozan activé
1.5.3.2. Mesure de la production de radicaux libres
1.5.4. Analyse de la bactéricidie
1.6. Analyses statistiques
1.6.1. Effet ration
1.6.1.1. Sur les paramètres immunologiques et biochimiques cumulatifs
1.6.1.2. Sur les paramètres biochimiques ponctuels
1.6.2. Effet d’un paramètre biochimique
1.6.3. Effet instantané
1.6.4. Interaction entre paramètres biochimiques cumulatifs
2. Résultats
2.1. Description des paramètres biochimiques
2.1.1. Cinétique de l’ammoniémie et de l’urémie
2.1.2. Mesure des autres paramètres biochimiques
2.1.3. Effet de la ration sur les paramètres biochimiques
2.2. Numération des neutrophiles et pureté après purification
2.2.1. Numération et formule leucocytaire
2.2.1.1. Analyse globale
2.2.1.2. Analyse en fonction des paramètres Animal, Session et Ration
2.2.1.3. Analyse en fonction des paramètres biochimiques
2.2.2. Pureté des neutrophiles
2.2.2.1. Analyse globale
2.2.2.2. Analyse en fonction des paramètres Animal, Session et Ration
2.2.2.3. Analyse en fonction des paramètres biochimiques
2.3. Expression des récepteurs membranaires
2.3.1. Expression du marqueur CD62L
2.3.1.1. Analyse globale
2.3.1.2. Analyse en fonction des paramètres Animal, Session et Ration
2.3.1.3. Analyse en fonction des paramètres biochimiques
2.3.2. Expression du marqueur CD11b
2.3.2.1. Analyse globale
2.3.2.2. Analyse en fonction des paramètres Animal, Session et Ration
2.3.2.3. Analyse en fonction des paramètres biochimiques
2.4. Les fonctions oxydatives des neutrophiles
2.4.1. Analyse globale
2.4.2. Analyse en fonction des paramètres Animal, Session et Ration
2.4.3. Analyse en fonction des paramètres biochimiques
2.4.3.1. Hors stimulation
2.4.3.2. Après stimulation avec l’OZP
2.4.3.3. Après stimulation avec le PMA
2.5. Bactéricidie
2.5.1. Analyse globale
2.5.2. Analyse en fonction des paramètres Animal, Session et Ration
2.5.3. Analyse en fonction des paramètres biochimiques
2.6. Interactions entre les paramètres biochimiques
2.7. Bilan des effets
3. Discussion et perspectives
3.1. Points forts et limite de l’étude
3.1.1. Animaux utilisés dans l’étude
3.1.2. Le prélèvement des échantillons
3.1.3. Les analyses de laboratoire
3.1.4. Les limites de l’interprétation de l’analyse statistique
3.1.5. Mesure de la fonction oxydative des GNN
3.2. Discussion des effets
3.2.1. Effets de la proportion de matière azotée totale : effet Ration
3.2.2. Numération cellulaire et expression de CD62L
3.2.3. Expression du récepteur CD11b
3.2.4. Production des formes réactives de l’oxygène en fonction du mode d’activation des neutrophiles
3.2.4.1. Production basale
3.2.4.2. Après activation
3.2.5. Le pouvoir bactéricide
3.2.6. Synthèse des effets
3.3. Perspectives
Conclusion
Références bibliographiques
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