Soutenance mémoire
Pré-vitellogénése nommée aussi une première croissance
Commence immédiatement après la prophase de méiose. Les jeunes ovocytes montrent alors un cytoplasme trèsbasophile, sans aucune inclusion, mais dont le volume s’accroît par rapport à celui du noyau. Les formations de réticulum subissent un certain accroissement. Ce stade coïncide avec le début de la période d’accroissement des ovocytes (Baert, 1986). La croissance ovocytaire s’échelonne sur deux ans environ pour le genre Perinereis. Pendant cette période d’accroissement, la taille de l’ovocyte augmente considérablement : de 30 à 40 pm, les cellules atteignent un diamètre supérieur à 200 µm à la maturité. Cette croissance n’est cependant pas constante en fonction du temps. Au début de la première année de la croissance ovocytaire, les jeunes ovocytes de p. cultrifera présentent un diamètre moyen de 40 pm. Dans un premier temps (première année) le développement de ces cellules est relativement faible : leur diamètre double pour atteindre environ 80 pm. Une augmentation de taille considérable est observée durant la deuxième année de croissance et plus particulièrement pendant les mois d’hiver (décembre à mars). Ainsi les ovocytes matures atteignent une taille proche de 260 µm (Baert, 1986).
Le liquide cœlomique et ses constituants
Coel signifie cavité, chez un animal coelomate, le mésoderme se creuse d’une ou de plusieurs cavités, ces dernières sont complètement entourées de mésoderme ; ce sont les cavités cœlomiques. L’ensemble des cavités cœlomiques d’un individu forme le cœlome. Le cœlome confère plusieurs avantages aux animaux. Il laisse un espace où les organes peuvent croître. Le fluide qu’il contient facilite la circulation, et peut servir à tamponner les variations de températures et à absorber les chocs. Il permet de construire un squelette hydrostatique efficace. Le fluide qui baigne les organes internes peut être filtré pour éliminer les déchets métaboliques. Enfin, il permet au tube digestif de se mouvoir indépendamment du corps de l’animal. D’après Fontaine (1982), chez les Annélides Polychètes, la cavité générale ou cœlome, est spacieuse. Elle est tapissée intérieurement, ainsi que tous les organes qu’elle renferme, par un endothélium péritonéal qui est une très mince membrane à cellules aplaties. Cette membrane péritonéale forme un mésentère dorsal et un mésentère ventral soutenant le tube digestif. Elle présente des régions plus ou moins abondamment garnies de cils vibratiles qui déterminent des courants dans la lymphe périviscérale (ou liquide cœlomique). La cavité générale est distincte de l’appareil circulatoire qui est clos, sang et liquide cœlomique ne se mélangeant pas. C’est dans cette cavité générale que va s’accomplir la maturation des produits génitaux qui se détachent précocement, y flottent en grande quantité. Mais outre les gamètes, on trouve aussi d’autres cellules : des Protozoaires parasites et surtout une catégorie de cellules cœlomiques particulièrement intéressante, les éléocytes. Ces éléocytes se sont vus attribués différents noms : lymphocytes, leucocytes, amibocytes, phagocytes, granulocytes, cellules chloragogènes … (Fauvel, 1959). Mais on a pu montrer, notamment chez Sabella spallanzani et Amphitrite johnstoni (Dales, 1961, 1964), que ces cellules constituent les étapes de la vie d’un même type cellulaire, c’est Romieu (1923) qui a employé le premier le terme d’éléocytes, car i1 avait observé dans ces cellules des gouttelettes colorables au Soudan III et au Tetroxyde d’osmium, donc riches en graisses non saturées. Dans notre étude il serait plus correct de parler de cœlomocytes, terme plus général qualifiant tous les éléments libres du cœlome autres que les gamètes. C’est dans le milieu intérieur chez les Annélides Polychètes où se fait la maturation des gamètes. Comme a pu l’écrire Porchet (1974) au moment de la reproduction, le corps des heteronereis est presque réduit à l’état d’un sac bourré de produits génitaux mûrs. Ainsi, remarque-t-il, chez les Perinereis cultrifera epitoques le contenu cœlomique des femelles (ovocytes, liquide cœlomique et cœlomocytes) représente plus de la moitié du poids total de l’animal, alors que le « cœlome » du ver sexuellement indifférencié n’en constitue que 10% environ. Durchon et Lafont (1951) notent que la multiplication et la maturation des cellules germinales, aux dépens des éléocytes, s’accompagnent de changements importants dans la composition chimique du liquide cœlomique.
Activité des acides nucleique au cours de la reproduction et de développement
La synthèse des trois types d’ARN dans l’ovocyte primaire est bien plus importante quantitativement que dans le spermatocyte primaire, puisque le diamétre de l’ovocyte passe de 15 à 100 µm (Phase de croissance).. C’est dans l’ovocyte primaire essentiellement, et un peu dans l’ovocyte secondaire, que s’opère la traduction des ARN et non pas dans un stade ovotide qui serait parallèle au stade spermatide. L’ovocyte reste sphérique et ne connait pas des modifications morphologiques spécialises. L’ovocyte compétent pour reprendre la méiose à deux reprises lors de l’ovulation et lors de la fécondation et pour devenir fécondable, parmi ces protéines très nombreuses, o, peut citer la tubuline et l’actine nécessaire aux divisions et les enzymes intervenant dans ces divisions, les glycoprotéines des grains corticaux situés sous la membrane plasmique. Ce n’est qu’une des ARN qui est traduite en vue de la maturation cytoplasmique, la plus part d’entre eux sont stockés pour étre traduits plus tard, après la condition le déroulement des premiers stades du développement embryonnaire conditionné par l’utilisation de ces ARN matures.
Méthode de dosage de de la Glutathion S-transférase (GST)
La mesure de l’activité de la gluthation S-transférase (GST) est déterminée selon Habig et al. (1974). Elle est basée sur la réaction de conjugaison entre la GST et un substrat, le CDNB (1 chloro 2,4 dinitrobenzène) en présence d’un cofacteur le gluthation (GSH) et mesurée à une longueur d’onde de 340 nm dans un spectrophotomètre visible/uv (GENESYSTM8). Les échantillons Corps entier de P. cultrifera récolté au niveau des trois sites sont homogénéisés dans 1 ml de tam pon phosphate (0.1M, pH 6). L’homogénat est centrifugé à 14000 trs/mn pendant 30 mn et le surnageant récupéré servira comme source d’enzyme. Le dosage consiste à faire réagir 200µl du surnageant avec 1.2 ml du mélange CDNB (1mM)/GSH (5mM) [20.26 mg CDNB, 153.65 mg GSH, 1ml éthanol, 100ml tampon phosphate (0.1M, PH6)]. La lecture des absorbances est effectuée toutes les 1mn pendant 5 minutes à une longueur d’onde de 340 nm contre un blanc contenant 200µl d’eau distillée remplaçant la quantité du surnageant. Une quantification des protéines a été réalisée selon Bradford (1976), la technique a été cité précédemment (page 41).
Les cœlomocytes
Les ovocytes qui évoluent librement dans le coelome sont entourés par de nombreuses cellules somatiques appelées cœlomocytes. Ces derniers éléments ne présentent jamais d’intrications étroites avec les cellules germinales et de ce fait ne peuvent donc être assimilés à des cellules folliculeuses (Dhainaut, 1970 a). Un travail récent (Dhainaut, 1984) a permis de différencier 6 types cellulaires parmi les cœlomocytes de Néréidiens. Sur ces 6 classes, 3 sont plus fréquemment rencontrées : les granulocytes de type 1 et II et les éléocytes. Ces différentes catégories de cellules présentent une activité phagocytaire importante et joueraient donc ainsi un rôle important dans le processus d’épuration du milieu intérieur. De même celles-ci se caractérisent par leur capacité à incorporer activement des produits provenant de la digestion et relargués dans le liquide cœlomique (Dakhama, 1983). Inversement, le rôle des cœlomocytes dans l’élaboration des réserves ovocytaires a également été pressenti chez les Annélides ( Eckelbarger, 1976). Cette fonction, jusqu’à présent unique ment supposée, a été principalement attribuée aux éléocytes, catégorie la plus abondante chez les Néréidiens. En effet, un certain épuisement des importantes réserves éléocytaires (principalement glycogène et lipides) semblent accompagner la maturation génitale. Ces cellules pourraient donc participer au maintien d’un certain équilibre dans le milieu cœlomique : les réserves des éléocytes proviendraient de métabolites issus d’une part du catabolisme des produits phagocytés et d’autre part d’un processus de capture d’un matériel d’origine « digestive », puis seraient utilisées pour assurer la présence dans le liquide cœlomique d’éléments simples nécessaires aux métabolismes des cellules cœlomiques et plus particulièrement des ovocytes. La fonction « régulatrice » du milieu intérieur décrite ci-dessus ne serait cependant pas la seule remplie par les coelornocytes. Comme l’ont montré les résultats d’études métaboliques (Porchet et al., 1979) autora- diographiques (Dhainaut, 1984) et immunologiques (Dhainaut et al., 1984) ces cellules, et plus particulièrement les éléocytes, synthétisent un matériel protéique qui est ensuite excrété dans le milieu environnant. Elles pourraient ainsi représenter le site de synthèse des substances ovocytaires d’origine exogène. L’ensemble de ces données suggère donc le rôle primordial pouvant être rempli par les cellules somatiques dans’ le cadre des interrelations métaboliques entre l’ovocyte et son milieu. Cependant, au stade des connaissances actuelles, il est encore difficile de définir avec exactitude la nature de ces relations et seuls les résultats d’études plus approfondies pourront permettre de confirmer certaines interprétations faites et ainsi amener à mieux comprendre les mécanismes coelomiques mis en œuvre dans le cadre du développement ovocytaire.
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Table des matières
1. INTRODUCTION
2. MATÉRIEL ET MÉTHODES
2.1. Analyse écologique
2.1.1. Localisation et présentation des sites d’étude
2.1.2. Paramètres physico-chimiques de l’eau de mer
2.1.3. Méthode d’échantillonnage et de récolte
2.1.4. Inventaire et biodiversité
2.1.5. Aperçu sur la systématique des Annélides
2.1.6. Évaluation des indices écologiques
2.2. Analyse biologique
2.2.1. Présentation et identification du matériel biologique
2.2.2. Différenciation des sexes
2.2.3. Paramètres morphométriques
2.2.4. Reproduction et Développement
2.3. Analyse biochimique
2.3.1. Liquide cœlomique et constituants
2.3.2. Séparation des constituants cœlomiques
2.3.3. Prélèvement des tissus
2.3.4. Extraction des métabolites
2.3.5. Dosage quantitatif des métabolites
2.3.5.1. Dosage des protéines
2.3.5.2. Dosage des glucides
2.3.5.3. Dosage des lipides
2.3.6. Analyse quantitative des vitellogénines et des vitellines
2.3.7. Extraction des vitellogénines et des vitelline
2.3.7.1. Dosage quantitative des vitellogénines
2.3.7.1. Dosage quantitative des vitellines
2.3.8. Analyse quantitatif des acides nucléique
2.3.9. Technique d’extraction des acides nucléique
2.3.9.1. Dosage quantitatif de l’ARN
2.3.9.2. Dosage quantitatif de l’ADN
2.4. Analyse écotoxicologique
2.4.1. Dosage de l’Acétylcholinéstérase (AChE)
2.4.2. Dosage de la glutathion S-transférase (GST)
2.5. Analyse histologique
2.5.1. Technique histologique classique
2.6. Analyse immunogénétique
2.6.1. Les marqueurs génétiques
2.6.1.1. Extraction de l’ADN génomique
2.6.1.2. Extraction de l’ADN génomique
2.6.1.3. PCR (Polymerase chain reaction)
2.6.1.4. Séquençage automatique
2.6.1. Les cœlomocytes
2.6.2. Les cœlomocytes
2.6.2.1. Observation de cœlomocytes
2.6.2.1.1. Coloration vitale au rouge neutre à 2%
2.6.2.1.2. Coloration par frottis sanguin
2.7. Analyse statistique
3. RÉSULTATS
3.1. Les paramètres physico-chimiques
3.2. Inventaire et biodiversité
3.3. Indices écologiques
3.3.1. L’abondance
3.3.2. Richesse et abondance du peuplement
3.3.3. Fréquence centésimale
3.3.4. Diversité et équitabilité
3.4. Paramètres morphométriques
3.4.1. Taille
3.4.1.1. Au niveau du littoral Est-algérien
3.4.1.2. Au niveau de la Manche française
3.4.2. Nombre de sétigères
3.4.2.1. Au niveau du littoral Est-algérien
3.4.2.2. Au niveau de la Manche française
3.4.3. Evolution annuelle de l’état sexuel
3.4.4. Evolution annuelle du poids frais essuyé
3.4.4.1. Au niveau du littoral Est algérien
3.4.4.2. Au niveau de la Manche française
3.4.5. Evolution annuelle du diamètre ovocytaire
3.4.5.1. Au niveau du littoral Est-algérien
3.4.5.2. Au niveau de la Manche française
3.5. Analyse biochimique
3.5.1. Effets du stress environnemental sur le contenu biochimique des ovocytes
3.5.1.1. Taux de protéines
3.5.1.2. Taux de glucides
3.5.1.3. Taux des lipides
3.5.2. Analyse quantitative des vitellogénines et des vitellines
3.5.2.1. Évaluation du taux de vitellogénines
3.5.2.2. Évaluation du taux de vitellines
3.5.3. Analyse quantitative des acides nucléiques
3.5.3.1. Évaluation du taux d’ADN ovocytaire chez les femelles de P. cultrifera récoltées au niveau des trois sites d’étude
3.5.3.2. Évaluation du taux d’ARN ovocytaire chez les femelles de P. cultrifera récoltées au niveau des trois sites d’étude
3.5.4. Dosage des biomarqueurs
3.5.4.1. Dosage de l’Acétylcholinéstérase (AChE)
3.5.4.2. Dosage de la glutathion S-transférase (GST)
3.5.5. Analyse histologique
3.5.5.1. Interprétation de la structure ovocytaire chez les femelles récoltées à partir des trois sites d’étude
3.5.5.2. Étude des paramètres morphométriques de l’ovocyte mature
3.5.5.2.1. Evaluation du diamètre ovocytaires (µm) chez P, cultrifera
3.5.5.2.2. Evaluation de l’épaisseur de la membrane vitelline (µm) de l’ovocyte mature chez les femelles de P. cultrifera
3.5.5.2.3. Evaluation du diamètre du noyau (µm) chez P. cultrifera
3.5.6. Analyse Immunogénétique du complexe d’espèces jumelles de P. cultrifera
3.5.6.1. Alignement des séquences cyt-b
3.5.6.2. Comparaison des caractéristiques immunologiques chez Perinereis cultrifera et Nereis diversicolor (Annélide polychètes) du littoral Est-algérien et des côtes de la manche française
3.5.6.2.1. Observation des cellules immunitaires
1) Au niveau du littoral Est-Algérien
a) Coloration au rouge neutre
b) Coloration par frottis sanguin
2) Au niveau de la manche française
a) Les éléocytes
b) Les granulocytes
4. DISCUSSION
4.1. Paramètres physico-chimiques de l’eau de mer
4.2. Effets du stress environnemental sur la diversité biologique
4.3. Effets du stress environnemental sur les paramètres morphométriques
4.4. Effets du stress envirennomental sur la croissance ovocytaire
4.5. Effet de la pollution sur les paramètres biochimiques des ovocytes
4.6. Evaluation des taux de vitellogénines et de vitellines
4.7. Évaluation du taux d’ADN et d’ARN ovocytaires
4.8. Effets du stress environnemental sur l’activité des biomarqueurs
4.9. Effets du stress environnemental sur la structure ovocytaire
4.10. Analyse phylogénétique du complexe d’espèces jumelles de P. cultrifera
4.11. Étude de l’aspect des cellules immunitaire chez P. cultrifera
5. CONCLUSION
6. RÉSUMÉS
7. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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