ASPECTS IMMUNOLOGIQUES AU COURS DE LA TB

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Pathogenèse de la tuberculose

Les espèces du complexe M. tuberculosis, agents pathogènes responsables de la tuberculose, sont transmis par voie respiratoire suite à une libération de petits gouttelettes aérosoles contenant des bactéries par une personne atteinte de tuberculose pulmonaire losqu’il parle, chante ou éternue. Les gouttelettes sont inhalées et déposées dans les alvéoles pulmonaires distales de personnes en contacts étroits [18]. M. tuberculosis est une bactérie intracellulaire et, bien qu’il puisse infecter différents types cellulaires, les macrophages alvéolaires sont sa niche préférée. Les stades initiaux de l’infection sont caractérisés par des réponses immunitaires innées qui impliquent le recrutement de cellules inflammatoires dans les poumons [19] ; l’induction d’une réponse immunitaire adaptative ne se produit que plus tard, après la dissémination de M. tuberculosis aux ganglions lymphatiques drainant [20 ;21]. Dans les ganglions lymphatiques, la présentation des antigènes bactériens par les cellules dendritiques conduit à l’amorçage et à l’expansion des cellules T spécifiques de l’antigène, qui se différencient de cellules T naïves en cellules T effectrices. Les cellules T effectrices migrent ensuite vers le poumon infecté et, en combinaison avec d’autres leucocytes, stimulent la formation de granulomes. Les granulomes sont des structures organisées qui contiennent des macrophages, des lymphocytes et des fibroblastes [22]. Au sein du granulome, les macrophages sont activés, par exemple par l’IFN-γ sécrété par les lymphocytes T CD4+ (cellules Th1) permettant de limiter la dispersion et la multiplication de M. tuberculosis.
Historiquement, les lymphocytes B n’étaient pas considérés comme un élément important dans l’immunopathogenèse de la TB. Cependant, il existe de plus en plus de preuves suggérant que les lymphocytes B assurent la protection par la présentation des antigènes et la production d’anticorps via des interactions avec les lymphocytes T [23 ;24].
Bien que le système immunitaire humain puisse contrôler l’infection, le contrôle ne conduit pas à l’élimination complète des mycobactéries. En fait, la plupart des personnes infectées par M. tuberculosis sont cliniquement asymptomatiques, c’est-à-dire dans un état de tuberculose latente [25]. Ces personnes infectées de façon latente, dont on estime qu’elles représentent le tiers de la population mondiale, représentent un énorme réservoir potentiel de maladie. Des études épidémiologiques montrent que 5 à 10 % des personnes atteintes de TB latente développent une maladie active au cours de leur vie [26]. Les personnes atteintes de TB active toussent et génèrent des gouttelettes infectieuses qui propagent l’infection (Figure 1).

Infection tuberculeuse chez l’homme

L’infection tuberculeuse survient généralement pendant l’enfance lors de la première exposition aux bacilles tuberculeux, d’où la description de la tuberculose infantile ou de la tuberculose primaire. Bien que les infections à Mtb aient été associées à l’érythème noueux et à la fièvre, l’exposition initiale à Mtb est généralement asymptomatique [28]. Si l’infection ne conduit pas à la maladie, elle peut entrer dans une phase latente d’infection. La tuberculose postprimaire se rapporte à la réactivation des bacilles latents, tandis que la tuberculose due à une réinfection est décrite comme une tuberculose secondaire [29]. La tuberculose post-primitive peut affecter les poumons (tuberculose pulmonaire) ou d’autres parties du corps telles que la colonne vertébrale, les articulations, les voies génito-urinaires, le système nerveux ou l’abdomen (TB extra-pulmonaire) [30].

Progression de la tuberculose

Après inhalation, les bacilles sont inoculés dans les bronchioles respiratoires et les alvéoles. Chez les hôtes immunocompétents, une réponse des cellules T à médiation cellulaire est induite, ce qui conduit à l’activation et au recrutement des macrophages sur le site de l’infection [16]. Les macrophages alvéolaires et les phagocytes tels que les cellules dendritiques (DC) et les neutrophiles sont les premières cellules à interagir avec les bacilles [31]. Mtb se réplique dans les macrophages naïfs et reste confiné dans le compartiment intracellulaire pendant de longues périodes [16]. Les bacilles peuvent toutefois être libérés à tout moment après l’immunosuppression [32]. Les macrophages infectés par Mtb sont transportés par la lymphe et le sang vers des organes tels que la rate, le foie et les ganglions lymphatiques [32] où les cellules T sont amorcées et multipliées par clonage [33]. En raison de la libération de facteurs chimiotactiques, les monocytes circulants s’infiltreront dans le site d’infection et se différencieront en macrophages matures capables de tuer les bactéries libres [32]. En fin de compte, la progression de l’infection latente vers l’infection tuberculeuse dépend de la dose infectante, du statut immunitaire et d’autres facteurs tels que la malnutrition et les toxines (alcool, tabac) [34].

ASPECTS IMMUNOLOGIQUES AU COURS DE LA TB

Réponse immunitaire au cours de la TB active

Réponse immunitaire innée

En raison du mode de vie intracellulaire de M. tuberculosis, l’immunité dépend essentiellement des lymphocytes T [35 ;36]. Après une infection par aérosol contenant M. tuberculosis, les macrophages alvéolaires et les cellules dendritiques (DC) interstitielles, après une étape de reconnaissance des composants de M. tuberculosis via des PRR comme les TLR, les CLR, les récepteurs de type oligomérisation de nucléotide, DC-SIGN, Récepteur Fc, Mannose Receptor (MR) et les Récepteurs éboueurs [37 ;38] phagocytent les pathogènes. La phagocytose concomitante de M. tuberculosis par les macrophages l’expose à un environnement intracellulaire sévère, acide (acidification des phagosomes), riche en superoxydes (espèces réactives d’oxygène et d’azote) et l’autophagie de Mtb intracellulaire, entre autres processus [39]. Contrairement aux macrophages, les DC après avoir phagocyter les bactéries dans le tissu pulmonaire, peuvent migrer vers les ganglions lymphatiques drainants, et initier la réponse immunitaire adaptative en activant les lymphocytes T naïve [40].
Cependant Mtb dispose de mécanisme d’échappement efficace qui empêche parfois sa destruction dans les macrophages. Parmi ces mécanismes nous avons :
– Blocage de la fusion phagolysosome. En effet Armstrong et al ont montré que M. tuberculosis arrêtait le phagosome à un stade précoce pour éviter la fusion avec le lysosome [41].
– Inhibition de la lyse toxique : La protéine Mtb catalase-peroxydase (KatG) et la protéine alkylhydroperoxyde réductase (AhpC) la protégeaient des superoxydes toxiques [42].
– Survie dans les corps apoptotiques : Mtb virulent peut contourner l’apoptose des macrophages infectés, entraînant une nécrose et une infection continue de nouveaux macrophages frais [43].
– Immunomodulation environnement cytokinique : M. tuberculosis peut manipuler les profils de cytokines élaborés par l’hôte pour éviter d’être éliminé. En effet une étude a rapporté que trois souches de M. tuberculosis hyper virulentes isolées de patients atteints de méningite tuberculeuse présentaient une croissance intracellulaire significativement accrue dans les macrophages humains par la régulation négative de l’expression du facteur de nécrose tumorale (TNF-a) [44].
Pendant la recirculation, les lymphocytes T spécifiques à M. tuberculosis interagissent avec les macrophages infectés par M. tuberculosis dans les poumons. Ici, ils attirent et activent d’autres monocytes et cellules T pour former un granulome solide où le pathogène est contenu.

Réponse immunitaire adaptative

Les réponses immunitaires adaptatives contre la tuberculose comprennent à la fois l’immunité humorale et l’immunité à médiation cellulaire. Une variété de populations de lymphocytes T participent à la réponse immunitaire contre la tuberculose [35 ;45]. Les lymphocytes T CD4 sont activés par des peptides antigéniques dans le cadre de produits géniques du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe II, dérivés du compartiment phagosomale [46]. La résidence préférentielle de M. tuberculosis dans le phagosome favorise le traitement du CMH de classe II, bien que Mtb ait développé des moyens d’altérer cette voie [47 ;48]. Les cellules T CD4 de type Th1 stimulées produisent des cytokines de type 1, notamment l’interféron-gamma (IFN-γ) et le facteur de nécrose tumorale (TNF) qui sont d’une importance cruciale dans la réponse immunitaire anti tuberculose. Ces lymphocytes T auxiliaires de type 1 activent les fonctions effectrices des macrophages qui contrôlent M. tuberculosis intracellulaire. Par conséquent, ils sont essentiels pour l’immunité protectrice dans la tuberculose.
Après l’activation et l’expansion clonale, les cellules T effectrices diminuent rapidement avec seulement une petite proportion qui se développe en lymphocytes T mémoire (Tm) [49]. Certaines cellules Tm résident dans des sites d’infection en tant que cellules T effectrices mémoire (Tem). D’autres migrent vers des ganglions lymphatiques voisins et constituent des cellules T mémoires centrale (Tcm). Lorsque l’hôte rencontre de nouveau M. tuberculosis, les Tcm vont proliférer et se différencier rapidement en cellules T effectrices pour l’éliminer.
Les cellules T CD4+ sont importantes car les personnes infectées par le VIH ont une incidence plus élevée d’infection primaire ou de réactivation de la latence de la tuberculose [50]. Les lymphocytes Th1 sont essentiels pour lutter contre les pathogènes intracellulaires, y compris M. tuberculosis. Les cellules Th1 sécrètent l’IFN-γ et le TNF-a pour recruter et activer les cellules immunitaires innées, ainsi que l’interleukine (IL-2) pour activer les lymphocytes T [51].
Le rôle essentiel de l’IFN-γ a été démontré chez les patients TB présentant un déficit en IFN-γ [52]. De plus, des mutations du gène de l’interféron-g R1 peuvent rendre les personnes plus sensibles à l’infection à M. tuberculosis et entraîner une dissémination du BCG chez les enfants après une vaccination [53].
Le TNF-a est également critique car les patients traités par un antagoniste du TNF-a pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde présentent une incidence plus élevée de tuberculose [54]. Les patients tuberculeux traités par IL-2 présentent des symptômes cliniques améliorés [55]. De plus, les lymphocytes T polyfonctionnels produisant au moins deux types de cytokines (IFN-γ, TNF-a et IL-2) sont des effecteurs plus puissants que les lymphocytes T monofonctionnels, qui n’en produisent qu’un seul type [56].
Th17 est un autre sous-ensemble de lymphocytes T auxiliaires CD4+ qui intervient pour le contrôle de la tuberculose. Th17 produit de l’IL-17, qui déclenche le recrutement de neutrophiles et de cellules T CD4+ productrices d’IFN-γ (Th1), pour assurer une synergie de la réponse contre l’infection à M. tuberculosis [51].
Contrairement à la fonction protectrice de Th1 et Th17, les cellules T CD4+ auxiliaires de type 2 (Th2) semblent jouer un rôle négatif en activant la sécrétion de cytokines (IL-4, IL-5 et IL-10…) et en inhibant les réponses Th1 [57].
Il est à noter que les cellules T régulatrices (Treg) ont la capacité de produire de l’IL-10 et du facteur de croissance transformant β (TGF-β) pour supprimer la génération et la fonction de Th1 et Th17 [57]. Les lymphocytes Treg s’accumulent souvent aux sites de l’infection à M. tuberculosis chez les patients actifs et joue un rôle négatif pendant l’endiguement de la tuberculose [58].
Collectivement, les réponses des lymphocytes T CD4+ bénéfiques contre la TB reposent probablement sur une polarisation fine vers Th1 et Th17 tout en minimisant l’action de Th2 et de Treg (figure 2).
Outre les réponses des lymphocytes Th1 et Th17, les lymphocytes T CD8+ restreints au CMH-I sont également indispensables dans la lutte contre la tuberculose. La présentation des antigènes M. tuberculosis par les CPA implique la charge directe de l’antigène sur le complexe CMH-I ou l’absorption indirecte par des exosomes ou l’apoptose des cellules infectées [59]. Les lymphocytes T CD8+ activés tuent directement M. tuberculosis en libérant de la granulysine ou indirectement par la lyse des macrophages ou des DC infectés [60]. Deux voies distinctes de la cytolyse incluent l’exocytose des granules coordonnées de perforine et granzyme A / B et la mort cellulaire programmée suite à la fixation de Fas sur FasL, retrouvés à la surface des cellules cibles [61]. Les antigènes de M. tuberculosis libérés peuvent être recapturés par les macrophages pour faciliter davantage le traitement et la destruction de l’antigène.

Généralités sur les molécules de co-stimulation

A la fin des années 1980, Schwartz RH proposait la théorie du « second signal » selon laquelle l’activation des lymphocytes T nécessite un premier signal défini par la reconnaissance par le récepteur T d’un complexe CMH-peptide. Après un premier signal provenant de l’interaction TCR/CMH-peptide, un second signal nécessaire à l’activation complète des lymphocytes T est transmis par l’interaction d’une molécule de co-stimulation exprimée par le lymphocyte T avec son ligand présent sur la cellule présentatrice d’antigène [80]. En son absence, les lymphocytes T deviennent anergiques [80 ;81]. Ce signal de co-stimulation, fourni par un ensemble de molécules, augmente l’avidité de l’interaction TCR/CMH-peptide et amplifie le signal induit par le complexe TCR-CD3. En fin, les molécules de co-stimulation elles-mêmes transmettent un signal aux lymphocytes T indépendamment du CD3 [82].
Quatre grandes familles de molécules de co-stimulation ont été jusqu’ici décrites mais de nouvelles molécules de co-stimulation sont découvertes régulièrement. Ainsi on distingue :
– La superfamille des immunoglobulines (dont le CD28),
– La superfamille des TNFR (Tumor Necrosis Factor receptor ; dont le CD40L),
– La superfamille des intégrines (dont le LFA-1)
– Et la superfamille des TIM (TIM-3).
Chacune d’elles est composée de molécules de co-stimulation activatrices et régulatrices. Le tableau I résume les principales molécules de co-stimulation de ces superfamilles impliquées dans l’activation lymphocytaire.

Mécanisme d’action des molécules de co-stimulation

Initialement, les molécules de co-stimulation étaient considérées comme permettant simplement d’augmenter l’activation et la fonctionnalité des lymphocytes T. Ainsi lorsque les lymphocytes T sont stimulés par le récepteur T et co-stimulés par le CD28, la production d’IL-2 est augmentée. Par la suite, il est apparu que le signal transmis par les molécules de co-stimulation et leurs ligands était bidirectionnel car concerne aussi bien les LT, les CPA et probablement d’autres cellules cibles. Ainsi, le CTLA-4 transmet un signal inhibiteur aux LT mais également aux CPA après interaction avec son ligand. Ce signal induit l’enzyme Indoleamine 2-3 dioxygenase qui dégrade le tryptophane dont l’absence ou la diminution peut entrainer l’apoptose ou l’anergie des LT [84]. Sur le plan moléculaire, les molécules de co-stimulation activatrice de la superfamille des immunoglobulines (CD28, ICOS) vont activer les voies de la PI3 kinase et d’AKT (PKB). La voie Ras est également activée via l’activation du CD28 tandis que la voie ICOS est induite par le C-MAF.
Le domaine intra cytoplasmique des récepteurs des molécules de co-stimulation appartenant à la superfamille des récepteurs du TNF (CD40L) va recruter des adaptateurs de la famille des TRAFF qui activeront ensuite différentes voies de signalisation (NF-kB, MAPK, AP1, ERK et NFAT). A l’inverse, les molécules de co-stimulation inhibitrices inhibent la signalisation par le complexe CD3 en recrutant des phosphatases capables de déphosphoryler différentes protéines (CD zêta, LAT, ZAP70…) impliquées dans la transduction du signal par le récepteur T (figure 3) [85].

Fonctions des molécules de co-stimulation

Les molécules de co-stimulation étaient connues pour leur rôle de second signal pour l’activation des lymphocytes T mais de nos jours leurs fonctions se sont diversifiées. Ces molécules sont exprimées sur des sous-populations de LT et interviennent à différentes étapes de l’activation lymphocytaire. Ainsi sur les LT naïfs, CD28 est la principale la molécule responsable de l’initiation de la réponse lymphocytaire avec probablement un rôle redondant avec le CD2 et HVEM. La survie et la prolifération des LT mémoires semblent plutôt être sous la dépendance des molécules de co-stimulation de la famille du récepteur du TNF (CD40L, CD27…) [86].
ICOS et PD-1 sont exprimés par les LT CD4 folliculaires dans le centre germinatif et sont importants dans la coopération cellulaire entre les LT CD4 et les lymphocytes B. En l’absence d’ICOS, on assiste à un déficit dans la production des immunoglobulines. Le signal de co-stimulation va également jouer un rôle dans la polarisation de la réponse lymphocytaire T. Ainsi les récepteurs appartenant à la famille SLAM, ainsi que TIM-1 et TIM-4, favorisent une polarisation de type Th2, tandis que d’autres molécules de co-stimulation appartenant souvent à la famille des récepteurs du TNF (CD27, HVEM…) orientent vers une réponse Th1 [87].
Ces molécules de co-stimulation sont également importantes dans la génération et la formation des LT régulateurs (Treg). Le CD28 est nécessaire à la différentiation de ces cellules dans le thymus et à leur persistance au niveau périphérique. Des molécules de co-stimulation inhibitrices (CTLA-4, Lag 3, GITR, HVEM…) sont exprimées par les LT régulatrices et jouent un rôle dans leurs fonctions suppressives [87].
De façon plus générale, les molécules de co-stimulation inhibitrices jouent un rôle dans la tolérance et la prévention des maladies auto-immunes. Elles sont également surexprimées physiologiquement en réponse à une activation lymphocytaire aigue et participent à la régulation de cette réponse immunitaire [88].

Le CD40L

Le ligand du CD40, connu sous le nom de CD154 ou CD40L, est une glycoprotéine transmembranaire de type II, avec un poids moléculaire variable entre 32 et 39 kDa en raison des modifications post-traductionnelles [89]. Une forme soluble de CD40L a été rapportée qui exprime des activités similaires à la forme transmembranaire [90,91]. Cette forme soluble est le résultat d’un clivage enzymatique au niveau de la méthionine 113 de la partie extracellulaire du CD40L membranaire. Le CD40L clivé est une molécule de 18KDa, trimérique et biologiquement active [92]. Le CD40L est un membre de la superfamille du TNF et est caractérisé par une structure extracellulaire en sandwich qui est composée d’une feuille β, d’une boucle en hélice α et d’une deuxième feuille β [93]. Cette structure permet la trimérisation du CD40L, qui est également une caractéristique de la famille des ligands du TNF [93].
Le CD40L est exprimé sous forme trimérique à la surface des lymphocytes T activés ainsi que par différentes cellules hématopoïétiques comme les monocytes, les basophiles, les cellules dendritiques et les plaquettes. Il est aussi exprimé par certaines cellules non hématopoïétiques comme les cellules épithéliales, les cellules musculaires lisses et les cellules endothéliales [94].
Le CD40L (CD154) est une molécule co-stimulatrice qui joue un rôle dans l’immunité cellulaire contre les pathogènes intracellulaires en induisant la production de l’IL-12, qui génère ensuite des cytokines de type Th1 par des interactions avec CD40 sur les macrophages ou les cellules dendritiques [95].

Les récepteurs du CD40L

Le CD40 est considéré comme étant le principal récepteur du CD40L [96]. Récemment, trois autres récepteurs pour le CD40L ont été identifiés : l’αIIbβ3 [97], l’α5β1 [98] et le Mac-1 [99].
Le récepteur co-stimulateur CD40 est une glycoprotéine transmembranaire de type I appartenant à la superfamille du TNFR [100]. Le CD40 est une protéine de 48 kDa. Elle est constituée d’un domaine extracellulaire de 193 acides aminés (aa), d’une séquence leader de 21 aa, d’un domaine transmembranaire de 22 aa et d’un domaine intracellulaire de 62 aa [89]. Dans le domaine extracellulaire du CD40, il y a 22 résidus de cystéine qui sont conservés entre les membres de la superfamille du TNFR [89]. En ce qui concerne le profil d’expression, le CD40 a été initialement caractérisé sur les cellules B et exprimé sur les cellules dendritiques (CD), monocytes, plaquettes et macrophages ainsi que par les cellules non hématopoïétiques comme les myofibroblastes, les fibroblastes, les cellules épithéliales et endothéliales [101 ;102].

L’interaction CD40L/CD40

Les interactions CD40L / CD40 exercent des effets profonds sur les CD, les cellules B et les cellules endothéliales, parmi de nombreuses cellules des compartiments hématopoïétiques et non hématopoïétiques.
Il a été démontré que l’engagement du CD40 sur la surface des DC favorise leur production de cytokines, l’induction de molécules co-stimulatrices sur leur surface, et facilite la présentation croisée de l’antigène [103]. Dans l’ensemble, l’impact de la signalisation CD40 sur les CD est d’assurer leur maturation pour déclencher efficacement l’activation et la différenciation des cellules T.
La signalisation CD40 des lymphocytes B favorise la formation du centre germinatif (GC), la commutation isotypique des immunoglobulines, l’hypermutation somatique (SHM) de l’Ig pour augmenter l’affinité pour l’antigène et enfin la formation de cellules plasmiques.
De plus, il a été démontré que la voie CD40 est essentielle pour la survie de nombreux types de cellules, y compris les cellules B, les CD et les cellules endothéliales dans des conditions normales et inflammatoires [104]. Cet éventail de fonctions pour CD40 souligne l’importance de ce récepteur lors de la génération d’une réponse immunitaire acquise [103]. Chez les CD infectés par le BCG, il a été montré que la stimulation du CD40 favorise non seulement leur capacité à sécréter de l’IL-12 mais augmente la libération d’autres médiateurs inflammatoires tels que l’IL-1α, IL-1β et IL-6 [105].

Matériels et réactifs (voir annexe)

La séparation et conservation des PBMC

 Principe de la séparation cellulaire
Les éléments figurés du sang périphérique, en milieu Ficoll-Triosil de haute densité, subissent durant la centrifugation une migration différentielle qui conduit à leur séparation en deux fractions : d’une part, les érythrocytes et les granulocytes qui sédimentent au fond du tube et d’autre part, les lymphocytes, les monocytes et les plaquettes qui restent à l’interface échantillon/milieu de séparation. Le milieu de séparation Ficoll-Triosil est une solution de densité 1,077 contenant :
 Du Ficoll de haute masse moléculaire (400.000 Da), très soluble dans l’eau mais de faible viscosité intrinsèque, et possédant des propriétés agrégantes vis-à-vis des globules rouges ;
 Du Triosil, qui forme avec le Ficoll une solution de faible viscosité et de haute densité, et qui a pour rôle d’établir une osmolarité et une densité adaptée à la sédimentation des granulocytes.
Lors de la centrifugation, les cellules sédimentent vers l’interface échantillon/Ficoll-Triosil. A l’interface, les érythrocytes sont agrégés du fait de la présence de Ficoll. La densité des agrégats étant supérieure à celle du Ficoll-Triosil, les érythrocytes sédimentent au fond du tube. La densité des granulocytes s’élève dans une solution hyper-osmotique. Ils sédimentent donc, tandis que les cellules mononucléées (PBMC) demeurent à l’interface échantillon / milieu de séparation (figure 6).
 Mode opératoire de la séparation des cellules
 Collecter 2 x 8 ml de sang dans un tube hépariné
 Dans un tube Falcon de 50 ml contenant 15 ml de Ficoll, faire couler doucement le sang hépariné à la surface du Ficoll et centrifuger pendant 15 minutes à 800 g sans freinage.
 Aliquotter 2 x 1ml de plasma dans du tube eppendorf 1,5 et conserver à -20°C
 Transférer les PBMCs dans un nouveau tube Falcon de 50 ml et compléter le volume jusqu’à 50 ml avec la solution de lavage (RPMI/PS) ; centrifuger à 1800 Tpm pendant 10 minutes à 4°C avec freinage.
 Aliquotter 2 x 300 μL de Buffy-coat dans un tubes eppendorf 1,5 et congeler à -20° C.
 Verser le surnageant et resuspendre doucement le culot dans 10ml de solution de lavage
 Pour le comptage :
– Resuspendre les cellules dans 10 ml de 10%FBS/RPMI et transférer 50 μL de la suspension cellulaire dans un puit d’une plaque de 96 puits
– Centrifuger à 1800 tpm pendant 10 minutes à 4°
– Durant la centrifugation, ajouter 50 μL de bleu trypan dans le puit contenant les 50 μL de la suspension cellulaire et compter les cellules vivantes avec une cellule hématimétrique
– Pour une cellule de comptage mesurant 0,1μl/16 carrés :
 Compter les cellules dans 2 quadrants de 16 carrés et diviser par 2 pour avoir n
 Multiplier n par 20.000 pour avoir la concentration cellulaire.
 Conservation des cellules mononuclées du sang périphérique
Les PBMC ainsi isolées ont été conservées pour leur stimulation et la détermination ultérieure des réponses cellulaires. L’objectif de ce procédé a été de réaliser les tests immunologiques de tous les échantillons en même temps afin d’éviter les variabilités techniques entre les échantillons mesurés à des moments différents.
La conservation des PBMCs a été réalisée selon les étapes ci-dessous :
 Après la centrifugation des PBMCs, verser le surnageant et resuspendre doucement le culot cellulaire dans un volume suffisant de 10% FBS/RPMI pour avoir une concentration de 20 millions de PBMC/ml.
 Mettre 300 μL de la suspension de 20 million de PBMC dans un cryotube =˃ 6 millions de PBMC.
 Mettre 200 μL de la suspension de 20 million de PBMC dans un cryotube =˃ 4 millions de PBMCs (répéter cette étape obtenir un second tube de 4 millions de PBMC).
 Ajouter dans le tube contenant les cellules le même volume de solution de conservation (10 % FBS/ 20 % DMSO / RPMI).
 Mettre les cryotube à 4° C dans de l’isopropanol et conserver à -80°C pendant une nuit.
 Le jour suivant, transférer les cellules à -150°C.

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Table des matières

PREMIERE PARTIE : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
CHAPITRE I : GENERALITES SUR LA TUBERCULOSE
I EPIDEMIOLOGIE
I.1 Incidence
I.2 Mortalité
II PATHOGENIE DE L’INFECTION A MTB
II.1 Agent causal de la tuberculose
II.2 Pathogenèse de la tuberculose
II.3 Infection tuberculeuse chez l’homme
II.4 Progression de la tuberculose
CHAPITRE II : ASPECTS IMMUNOLOGIQUES AU COURS DE LA TB
I Réponse immunitaire au cours de la TB active
I.1 Réponse immunitaire innée
I.2 Réponse immunitaire adaptative
I.3 Rôle de l’IFN-γ
II Généralités sur les molécules de co-stimulation
II.1 Mécanisme d’action des molécules de co-stimulation
II.2 Fonctions des molécules de co-stimulation
II.3 Le CD40L
II.4 Les récepteurs du CD40L
II.5 L’interaction CD40L/CD40
II.6 Le TIM-3
II.7 Les ligands de TIM-3 : La Galectine-9
II.8 L’interaction TIM-3/Galectine-9
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL PERSONNEL
I METHODOLOGIE
I.1 Objectifs
I.1.1 Objectifs généraux
I.1.2 Objectifs spécifiques
1.2 Cadre d’étude
1.3 Type et période d’étude
1.4 Population d’étude
1.4.1. Critères d’inclusions
1.4.2 Critères de non inclusion
1.5 Aspects éthiques
1.6 Prélèvements
I.7 Matériels et réactifs
I.7.1 La séparation et conservation des PBMC
I.7.2 Décongélation des PBMC
I.7.3 Stimulation et fixation cellulaire
I.7.3.1 Principe
I.7.3.2 Modes Opératoires
I.7.4 Marquage extracellulaire
I.7.5 Marquage intracellulaire
I.7.6 Analyse des cellules par cytométrie en flux
I.7.6.1 Principe de la cytométrie en flux
I.7.6.2 Stratégie de sélection (gating)
I.7.7 Analyses des données
II. RESULTATS
II.1. Caractéristiques de la population d’étude
II.2 Production d’IFN-γ par les Th1
II.3 Production d’IFN-γ par les T CD8
II.4 Expression du CD40L par les cellules Th1
II.5 Expression de CD40L par les lymphocytes T CD8+
II.6 Expression de TIM-3 par les cellules Th1
II.7 Expression de TIM-3 par les cellules T cytotoxiques
III. DISCUSSION
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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