Soutenance mémoire
Modes de transmission
Le VIH a été isolé dans la plupart des liquides biologiques humains : le sang, le plasma, l’urine, le LCR, le sperme, les sécrétions vaginales, les larmes et la salive. Toutefois, la transmission du VIH nécessite une porte d’entrée et le facteur déterminant du risque infectieux qui est la charge virale du produit biologique contaminant. Depuis le début de l’épidémie, trois principaux modes de transmission ont été observés : latransmission par voie sexuelle, la transmission par voie sanguine et la transmission de la mère à l’enfant par le lait maternel ou transmission verticale.
La transmission par voie sexuelle
A l’échelon mondial, la grande majoritédes infections par le VIH ont été acquises à l’occasion de rapports sexuels non protégés.
La transmission sexuelle de l’infection à VIH se fait par l’intermédiaire des muqueuses buccale, génitale ou rectale, lorsqu’elles sont en contact avec les sécrétions sexuelles ou du sang contenant du virus. Ces muqueuses présentent une certaine perméabilité vis-à-vis du VIH et, on peut retrouver des cellules infectées dans la sous muqueuse après une exposition non traumatique de l’épithélium vaginal au VIH. La muqueuse rectale, par son épithélium monocellulaire, est cependant la plus susceptible à l’infection.
La transmission par voie sanguine
Elle concerne trois groupes de population : les usagers de drogues par voie intra veineuse (IV), les hémophiles et les transfusés ; plus rarement, lesprofessionnels de santé en milieu de soins et laboratoire peuvent être victimesd’accidents exposant au sang ou autres liquides biologiques.
La transmission périnatale
Le VIH peut se transmettre d’une mère à son enfant au cours de la grossesse par voie transplacentaire. Le risque de transmission de la mère à l’enfant, en l’absence de traitement a été estimé dans une cohorte française à 1 èrepartie20% [9, 15, 42]. Il est de l’ordre de 30 à 40%en Afrique en l’absence demesures prophylactiques.
La gravité de la maladie chez la mère influence le risque de la transmission : de l’ordre de 50% si letaux de lymphocytes CD4 maternel est inférieur à 200/mm 3 et inférieur à 10% si le taux de CD4 est supérieur à 500/mm 3.
Evolution immuno-virologique de l’infection à VIH
L’évolution naturelle de l’infection à VIH chez une personneinfectée se fait en trois phases : la primo-infection, la phase chronique et la phase terminale.
La primo-infection
Cette phase dure en moyenne six semaineset débute avec le contage et se termine avec l’apparition d’anticorps anti-VIH qui marque laséroconversion.
Elle peut être asymptomatique ou se traduire, chez 50 à 70% des personnes infectées, par diverses manifestations cliniques transitoires. Cette phase est caractérisée par une réplication virale quise traduit par une antigénémie positive dans le sang circulant et au niveau du LCR (liquide céphalo-rachidien) et traduirait l’établissement de sites privilégiés de la réplication virale à partir desquels a lieu la dissémination virale pendant tout le cours de l’infection. [22, 48].
Chez les personnes en phase de primo-infection, environ la moitié des virus isolés a généralement un phénotype X4 ou CXCR4. La fin decette phase de primo-infection est marquée, d’après les travaux de Daar et collaborateurs, par une diminution rapide de la charge virale circulante [16]et un changement phénotypique des virus isolés qui sont majoritairement R5.
Du point de vue immunologique, cettephase se caractérise par une diminution transitoire du nombre de lymphocytes TCD4+ circulants et l’apparition de la réponse immune à médiation cellulaire [37]. L’apparition de la 1 ère partie réponse immune humorale marque la fin de laphase et l’entrée dans la phase dechronicité.
Diagnostic direct
Détection del’antigène
Les méthodes ELISA commercialisées détectent essentiellement la protéine p24 du VIH-1, parfois observée. La positivitéde la réaction est confirmée par la neutralisation avec un anti-sérum spécifique permettant d’exclure les faux positifs. La recherche de l’antigène p24 dans le sérum est aujourd’hui pratiquée en cas de suspicion de primo-infection lorsque les anticorps ne sont pas encore apparus.
Cette recherche est associée à celle des anticorps anti-VIH-1 et anti-VIH-2 dans les tests de dépistage de 4e génération.
Isolement du VIH enculture de cellules
Des laboratoires spécialisés peuvent isoler le VIH à partir de lymphocytes infectés grâce à des techniques de culture cellulaire. Ils’agit d’une co-culture des lymphocytes du sujet infecté avec des lymphocytes de donneurs séronégatif qui ont été stimulés préalablement (36 à 48H) avec de la phytohémagglutinine.
La réplication virale est révélée par la production d’antigène p24 dans le surnageant des cultures cellulaires.
Les cultures sont positives en 5 à 21 jours, plus rapidement en utilisant le test ELAST. L’amélioration des techniquesde culture bien standardisées depuis1988 permet de détecter le virus chez 80 à 100% des adultes séropositifs quel que soit le stade de la maladie. [31].
Détection des acides nucléiques viraux
L’amplification génique (PCR) permet de détecter l’ADN proviral intégré dans l’ADN cellulaire ou, après une étape supplémentaire de transcription inverse, l’ARN génomique contenu dans les particules virales.
Une technique d’hybridation amplifiée sans amplification génique, fondée sur l’utilisation de sondes ramifiées « ADN branché » permet aussi la détectionde l’ADN proviral. Dans ses derniers développements, cettedernière a unesensibilité qui serait proche de celle de l’amplification génique.
Traitement de l’infection à VIH et prévention
Traitement de l’infection à VIH
Dès 1987, la première molécule antirétrovirale (ARV) a été mise sur le marché. Il s’agit de la Zidovudine ou AZT. Par suite de résistances établies du virus à l’administration de la seule molécule d’AZT, plusieurs autres molécules sont aujourd’hui disponibles et utilisées en association. Les nouvelles molécules disponibles, ayant de plus des cibles virales différentes, ont permis d’obtenir des résultats très encourageants dans le cadre des associations thérapeutiques et d’améliorer considérablementl’évolution des patients [17].
Evaluation de la réplication virale
La culture quantitative du virus
Elle se fait à partir du plasma par infection de PBMCde donneurs non infectés par VIH; elle est non seulement fastidieuse et onéreuse mais présente aussi l’inconvénient d’être négative ou indétectable chez les patientsasymptomatiques.
L’antigénémie
Il s’agit d’une mesure indirecte [63]. La mesure de l’antigénémie est limitée par sa sensibilité.
La détermination de lacharge virale plasmatique
La mesure directe de l’ARN VIH plasmatique se fait dans le plasma en utilisant des techniques de biologie moléculaire notamment l’amplification génique ou la technologie de l’amplification d’un signal. Ces techniques ont été grandement améliorées et ont généralement une limite dedétection de 50 copies/ml voire de 25 copies/ml.
Historique dela charge virale
Les premières techniques de quantification
Avant l’arrivé sur le marché des trousses agréées, les techniques de quantification moléculaire étaient artisanales [24]. Ces techniques étaient non seulement fastidieuses maisne permettaient pas ausside trouver le VIH en quantités significatives chez les personnes ayant le SIDA. La culture de virus, par exemple, a permis de trouver d’autres virus, mais pas le VIH. Ceci s’explique par le fait que lorsque la culture de virus est utilisée pour détecter le VIH, celui-ci n’était jamais retrouvé. Saprésence est mesurée par des méthodes très indirectes : des analyses pour la détection de la transcriptase inverse ou de la protéine p24, dont ni l’une ni l’autre n’est spécifique du VIH. Ces méthodes indirectes ne seraient pas nécessaires si, à la base, une quantité significative de VIH était présente. En d’autres termes, si une quantité significative de VIH était présente, les techniques delaboratoire classiques devraient permettre de le trouver. Or, elles n’y arrivaient pas. [34].
Avènement de la PCR
Pour pallier à ces insuffisances, les techniques de biologie moléculaire furent utilisées comme alternative. A partir de 1996,plusieurs trousses agréées de quantification voient le jour et leur utilisation à grande échelle va considérablement améliorer le suivi des personnes infectées [8, 18, 34]. Ces techniques vont utiliser la PCR ou ses variantes, afin d’amplifier et de quantifier l’ARN viral plasmatique dont la détermination est connue sous le terme de «charge virale plasmatique».
On distingue ainsi 2 groupes de techniques qui ciblent chacune une région spécifique du génome :
– L’amplification de cible ou génique qui est une RT-PCR quantitative, c’est-à-dire une réaction de transcription inverse suivie de l’amplification de l’ADN complémentaire (ADN) généré. C’est le principe des premières trousses commerciales des laboratoires Roche (Amplicor HIV-1Monitor ® ) et Abbott (LCx HIV RNA ® ). C’est également le principe du NASBA QR System Teknika ® des laboratoires Organon, qui utilise une RT dans sa première phase suivied’une amplification isothermique générant de l’ARN à partir de l’ADNc.
– L’amplification de signal a une approche différente qui repose sur l’hybridation moléculaire d’un énorme polymère d’ADN sur l’ARN à quantifier permettant ainsi une amplification considérable du signal ; C’est la technique de l’ADN branché ou Quantiplex HIV RNA Chiron bDNA ® de Bayer.
Toutes ces techniques ont très vite montré des limites relatives à l’étape de détection du matériel amplifié qui est différée de la quantification. En effet, les manipulations post-PCR ont l’inconvénient d’entraîner parfois des contaminations mais aussi une dégradation du produit amplifié. De plus, la PCR étant une réaction exponentielle, la détection en fin deréaction ne donne pas la meilleure idée de la quantité du produit amplifié.
La PCR en temps réel
C’est l’arrivée de la PCR en temps réel ou amplification avec détection en temps réel qui va permettre de s’affranchir de toutes ces limites. Il s’agit d’une technique de RT-PCR qui a la particularité de combiner l’amplification à la détection d’un signal de fluorescence émise par un « reporter». En effet, les données sont collectées cycle après cycle à l’opposé de la PCR quantitative classique où les amplicons ne sont détectés qu’à la fin du processus.
L’augmentation du signal fluorescent est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons générées durant laréaction PCR. La collecte des données à la phase exponentielle, la plus reproductible de la réaction, rend la méthode plus sensible et réduit les risques de contamination car il n’y a pas de manipulation post-PCR.
Principales trousses commerciales de charge virale
Cobas TaqMan HIV-1 test ® de Roche
Le test COBAS TaqMan HIV-1 utilise la PCR en temps réel en vue de quantifier l’ARN des sous type du VIH-1 du groupe M dans une plage allant de 47 à 10000000 de copies grâce un standard de quantification interne. Ce dernier est une construction non infectieuse du VIH possédant des sites de liaison aux amorces identiques à celles de laséquence cible du VIH-1 (gène gag) et génère également un produit d’amplification dela même longueur et composition en base que l’ARN du VIH-1 cible.
L’extraction de l’ARN cible peut sefaire automatiquement ou de façon manuelle sur une prise d’essai de 500µl de plasma. La détection utilise des sondes fluorescentes. Le site de liaison à la sonde dedétection du standard de quantification du VIH-1 a été modifié pourdifférencier l’amplicon du standard de quantification du VIH-1 de l’amplicon du VIH-1 cible.
Les constantes d’étalonnage, spécifiques du lot et fournies avec le test COBAS TaqMan VIH-1, servent à calculer la valeur du titre pour les échantillons et les témoins en fonction des valeurs du cycle seuil (Ct) pourl’ARN du VIH-1 et l’ARN du standard de quantification du VIH-1.
Cobas amplicor ® des laboratoires Roche
Le test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 est aussi une technologie des laboratoires Roche basée sur le principe de la RT-PCR quantitative pour déterminer la charge virale du VIH-1 sur l’analyseur COBAS AMPLICOR TM . Elle permet également de quantifier l’ARN des sous types du VIH-1 du groupe M au niveau du gène gag grâce à l’utilisation d’un standard de quantification interne.
Ce test permet de mesurer le taux du HIV-1 sur une plage de 50 à 750000 copies/ml selon la méthode standard et de 50 à 100000 copies/ml selon la méthode ultrasensible.
Abbott Real Time HIV-1 sur m2000rt de Abbott
L’appareil Abbott m2000rt utilise la PCR en temps réel afin de générer un produit amplifié du génome ARN du VIH-1 dans les échantillons cliniques. Il permet de quantifier les soustype du groupe M et des isolats du groupe O grâce à des sondes fluorescentes partiellement double brin.
Une séquence d’ARN non liée à la séquence cible pol est introduite dans chaque échantillon au début de la préparation des échantillons qui peut être manuelle ou automatique grâce à l’appareil m2000sp. Cette séquence d’ARN non liée est simultanément amplifiée par RT-PCR et sert de contrôle interne (IC) afin de démontrer le traitement correctde chaque échantillon. La quantité de séquence cible de VIH-1 présente à chaque cycle d’amplification est mesurée à l’aide de sondes oligonucléotidiques marquées par fluorescence. Les sondes ne génèrent aucun signal à moins d’être spécifiquement liées au produit amplifié.
Le cycle d’amplification au cours duquel le signal est fluorescent est détecté par m2000rt est proportionnel au log de la concentration d’ARN VIH-1 présente dans l’échantillon d’origine.
Les résultats du dosage peuvent être rendus en copies/ml ou unités internationales /ml (UI/ml).
Analyse statistique
La saisie des données a été réalisée avec le logiciel Excel et l’exploitation a utilisé le logiciel SPSS (Statistical Package for Social Sciences Version 11.0).
Le logiciel MethVal [http://perso.easynet.fr/~philimar] a permis de faire les analyses de concordance entre les techniques avec l’approche de Bland-Altman [6]qui compare les moyennes des charges virale des deux méthodes (transformés en valeurs logarithmiques) contre la différence de charge virale. ; il a également permis de tracer la droite de régression selon Deming qui prend en compte la variabilité des deux méthodes en introduisant un paramètre supplémentaire, le rapport deux variances analytiques.
Résultats
La population d’étude
La population d’étude est composée de 12 hommes (32,4%) et 25 femmes (67,6 %) soit un sexe ratio de 2,1. Initialement, elle était constituée de 43 patients dont 6 qui n’ont pas finalement été retenus pour les raisons suivantes :
-2 patients n’ont pas donné leur consentement pour participer à l’étude
-3 patients ont le profil VIH-2 et
-1 patient a un profil indéterminé
L’âge des 37 patients inclus est compris entre 24 ans et 68 ans avec une moyenne autour de 38 ans.
Concernant le traitement ARV, seuls 7 patients soit 18.9% sont sous trithérapie depuis moins de 6 mois.
Selon le statut immunitaire, notre population peut être répartie en 3 classes :
– la classe des patients dont le taux de LTCD4+ est inférieur ou égal à 200 cellules/mm 3 représentant 20 patients soit 54.1%,
– la classe des patients ayant un taux de lymphocytes compris entre 200 et 350 cellules/mm 3 qui compte 10 patients soit 27%,
– celle des patients ayant un taux de LTCD4+ supérieur à 350 cellules/mm 3 représentant 18.9% de la population totale.
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Table des matières
Introduction
Première partie
Chapitre I : Infection à VIH /SIDA
I Les VIH : Rappels virologiques et immunologiques
1 Historique
2 Définition et classification des VIH
3 La structure des VIH
4 Le cycle réplicatif et sa régulation
5 Les cellules cibles des VIH
6 La variabilité génétique des VIH
7 Pathogenèse de l’infection à VIH
8 Immunologie
II Epidémiologie de l’infection à VIH
1 Dans le monde
2 En Afrique subsaharienne
3 Au Sénégal
III Modes de transmission du VIH
1 La transmission par voiesexuelle
2 La transmission par voie sanguine
3 La transmission périnatale (TME)
IV Diagnostic biologique
1 Diagnostic indirect
1.1 Tests de dépistage
1.2 Tests de confirmation
2 Diagnostic direct
2.1 Détection de l’antigène p24
2.2 Isolement du virus en culture cellulaire
2.3 Détection des acides nucléiques viraux
2.4 Quantification virale
V Aspects cliniques de l’infection à VIH
1 La primo-infection
2 La phase asymptomatique
3 Les formes symptomatiques
4 Le sida
¾ Définition du sida
¾ Evolution de l’infection à VIH
¾ Les marqueurs pronostiques, cliniques, et biologiques
VI Traitement de l’infection à VIH
1 Principes généraux de la thérapeutique antirétrovirale
2 Indications et stratégiesthérapeutiques
3 Les molécules anti-rétrovirales
VII Prévention
Chapitre II : Infections à Chlamydia trachomatis
1 Historique
2 Taxonomie
3 Caractères bactériologiques
3.1 Morphologie
3.2 Habitat
3.3 Cycle de multiplication
3.4 La culture
3.5 Structures antigéniques
4 Pouvoir pathogène
5 Manifestations cliniques
5.1 Le trachome
5.2 Les infections uro-génitales
5.3 La lymphogranulomatose vénérienne ou maladie de Nicolas Favre
6 Réponse immune à Chlamydia
7 Diagnostic biologique des infections à Chlamydia
7.1 Le prélèvement
7.2 Examen microscopique direct
7.3 Isolement de Chlamydia trachomatisen culture cellulaire
7.4 Méthodes rapides et directes de détection d’antigène de CT
7.5 Détection d’anticorps sériques
7.6 Apport de la biologie moléculaire
8 Etudes de la sensibilité aux antibiotiques
9 Traitementet prévention
Chapitre III : Infections à Neisseria gonorrhoeae
1 Historique
2 Classification
3 Caractères bactériologiques
3.1 Morphologie
3.2 Habitat
3.3 Caractères culturaux
3.4 Caractères métaboliques
3.5 Structures antigéniques
4 Epidémiologie
4.1 Transmission
4.2 Incidence et prévalence
5 Manifestations cliniques
5.1 La blennorragie
5.2 Les complications
6 Immunité et réponse immunitaire
7 Diagnostic biologique des infections à NG
7.1 Le prélèvement
7.2 Examen microscopiquedirect
7.3 La culture
7.4 Les techniques de la biologie moléculaire
8 Traitement
9 Prévention
Deuxième partie
I Justification et intérêt
II Cadre d’étude
1 Les sites
2 La population d’étude
3 L’Institut d’Hygiène Sociale (IHS)
4 Le laboratoire de virologie-bactériologie de l’hôpital Aristide le Dantec
III Matériels
IV Réactifs
V Les méthodes
Sur le terrain
1 Echantillonnage
2 Accueil des participantset recueil de consentement
3 Enquête
4 Examen clinique
5 Collecte, traitement etacheminement des prélèvements
Au Laboratoire
1 Recherche de CTet NG par PCR
2 Test de dépistage : la sérologie rétrovirale
3 Test de confirmation : le western blot
4 Analyse statistique des résultats
VI Résultats
VII Discussion
Conclusion
Bibliographie
Annexes
