Antioxydants et radicaux libres

Antioxydants et radicaux libres

Hépatotoxicité (Culture primaire)

Elle consiste à isoler un fragment d’organe ou de tissu et de le maintenir en survie dans un milieu approprié in vitro; -les cellules cultivées sont préparées à partir de foie frais de porc obtenu par une maison d’abattage local il s’agit de PLP2. -les tissus hépatiques sont rincés par HPSS (Hank’s balanced salts solution) contenant 100 U/mL de penicilline, 100 µg/mL de streptomycine et sont découpés en 1x1x1 mm3 d’explants. -les explants (de petits morceaux de tissus) sont fixés sur un récipient de culture traité et baignés dans un milieu de culture où ils sont placés dans des flacons de culture cellulaire de 25 cm2 contiennent un milieu DMEM supplémenté en 10% SBF, 2 mM d’acides aminés, 100 U/mL de pénicilline, 100 mg/mL de streptomycine. Les explants sont ensuite incubés à 37 °C sous des conditions d’atmosphère humidifiée contenant 5% CO2. -après quelques jours, des cellules individuelles se déplacent de l’explant de tissus vers la surface du récipient de culture où elles commencent à se diviser et proliférer -le milieu est changé chaque deux jours. Les explants sont cultivés pendant environ deux semaines, les cellules se fixent, se divisent et prolifèrent. C’est ce qu’on appelle une culture primaire.

Comptage cellulaire et trypsination

On lave le tapis cellulaire en introduisant 2.5-5 mL de PBS (HBSS) puis on agite doucement la boite pendant 30 sec et on élimine tout le liquide à l’aide d’une micropipette. Les cellules cultivées in vitro adhèrent à un support et adhèrent entre-elles grâce à la matrice extracellulaire. Le repiquage des cellules nécessite leur décollement du support et leur  séparation les unes des autres, ce qui est obtenu par action d’une enzyme protéolytique, la trypsine. Son action est inhibée par les ions calcium et par le sérum de veau fœtal (SBF). On introduit un volume de 1.5 à 2 mL de trypsine 0.25% + EDTA. Une fois que l’enzyme a individualisé les cellules, il faut que son action soit arrêtée par addition de SBF avant que les cellules ne soient abîmées. Il faut donc contrôler l’action de la trypsine en stoppant son activité dès que le tapis cellulaire s’est individualisé du support. Pour bien répartir sur tout le tapis cellulaire, on le met ensuite à l’incubateur 5 à 10 mn jusqu’à ce qu’on observe le détachement des cellules adhérentes du support (flacon de culture). Après, on les transfère dans des flacons coniques en polypropylène stérilisés de 25 mL pour la centrifugation 1200 tr/min pendant 5 min. On élimine ensuite le surnagent et on ajoute 3ml du milieu au culot avec une légère agitation manuelle. On introduit 3 à 5 mL du milieu de culture complété (l’action de la trypsine est stoppée par le SBF) pour arrêter la trypsination. Il faut après trypsination dénombrer les cellules vivantes et mortes pour déterminer avec précision le volume de suspension cellulaire à introduire dans les microplaques pour l’essai: 0.075 mL de suspension cellulaire sont prélevés dans un tube Eppendorf afin de réaliser une numération en présence de 0.075 mL de colorant de bleu Trypane (concentration finale: 0.4% (p/v) en utilisant une cellule de Neubauer (plaque de microscope quadrillée) pour le comptage cellulaire. Le dénombrement est effectué sur cinq champs choisis au hasard,

Quadripartita

Les analyses par LC-DAD-ESI/MS/MS ont permis d’identifier les composés phénoliques dans l’extrait aqueux et les fractions d’acétate d’éthyle et butanolique dans les feuilles d’O. quadripartita (Tableau 13; Figure 25). La figure 24 montre les chromatogrammes de l’extrait aqueux et des fractions obtenues à 280 et 370 nm par HPLC-DAD avec attribution des pics majoritaires. Vingt-huit composés phénoliques individuels: quinze flavan-3-ols, six flavones, quatre flavonols, deux acides phénoliques et un dérivé des flavanones sont détectés. A notre connaissance, il s’agit de la première étude caractérisant complètement la composition phénolique dans les feuilles d’O. quadripartita. Le plus grand groupe de composés présents à la fois dans les fractions et dans l’extrait est les dérivés de flavan-3-ols (Figure 26). Les composés 8 et 12 sont identifiés comme étant la (+)-catéchine et (-)l’épicatéchine, en fonction de leurs caractéristiques de temps de rétention, de masse et UV-vis en comparaison avec des standards commerciaux. Les flavan-3-ols restants sont identifiés comme étant des proanthocyanidines basés sur leurs ions pseudo moleculaires et leurs motifs de fragmentation MS2. L’analyse des fragments produits fournit des informations sur le type des unités élémentaires et peut également indiquer leur position relative dans des proanthocyanidines oligomères. Les spectres de masse ne permettent cependant pas d’établir la position de la liaison entre les unités de flavonols (c’est-à-dire C4 C8 ou C4-C6) ni de différencier les catéchines isomères (par exemple, la catéchine/ l’épicatéchine). Les composés 3, 5, 9, 11, 14, 16 et 21 présentent le même ion pseudo moléculaire [M-H]- à m/z 577 et les mêmes motifs de fragmentation MS2 concordant avec les dimères de type B (épi) catéchine. Les ions fils produits caractéristiques MS2 sont observés à m/z 451 (-126 u), 425 (-152 u) et 407 (-152-18 u), sont attribuables au HRF (heterocyclic ring fission): capture de l’hétérocycle , au RDA (Retro-Diels Alder fission): capture apparaissant sur des cycles de plus de six carbones et à la perte d’eau à partir d’une unité (épi) de catéchine, et à m/z 289 et 287, qui pourraient être associés aux fragments correspondant respectivement à l’unité de catéchine inférieure et supérieure (épi) (Santos-Buelga et González-Paramás, 2014). Selon leur comportement d’élution, ces composés pourraient être temporairement attribués aux différents dimères de catéchine (C) et d’épicatéchine (EC) liés par des liaisons interflavanaires C4-C8 ou C4-C6. Ainsi, dans la RP-HPLC, on s’attend à ce que les procyanidines B3 (C-4,8-C) et B1 (EC-4,8-C) s’éluent avant la (+)-catéchine et les dimères B4 (C-4,8- CE) et B2 (EC-4,8-EC) avant (-)-épicatéchine (Santos-Buelga et al., 2003). Ainsi, qu’il pourraient être associés aux pics 3, 5, 9 et 11, respectivement, une identification qui a également été soutenue par une comparaison avec nos composées bibliothécaires. Quant aux pics 14, 16 et 21, il pourrait s’agir de dimères liés en C4-C6 en tenant compte de leur élution ultérieure. En fonction de leur position relative dans le chromatogramme, ils pourraient correspondre aux procyanidines B7 (EC-4,6-C), B8 (C-4,6 EC) et B5 (EC-4,6-EC). Les concentrations de ces composés dans les échantillons semblent cohérentes avec ces identités, puisque les dérivés liés à C4-C6 sont habituellement moins abondants que leurs homologues C4-C8 (de Pascual-Teresa et al., 2000).

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Table des matières

I. Plantes médicinales
I.1. Plantes étudiées et classification botanique
I.1.1. Myrtus nivelii Batt & Trab. (Myrtacées)
I.1.1.1. Description botanique et habitat
I.1.1.2. Distribution géographique
I.1.1.3. Utilisations médicinales
I.1.1.4. Propriétés pharmaceutiques
I.1.1.5. Composition chimique
I.1.2. Osyris quadripartita Salzm. ex Decne (Santalaceae)
I.1.2.1. Description botanique et habitats
I.1.2.2. Répartition géographique
I.1.2.3. Utilisation traditionnelle et propriétés pharmaceutiques
I.1.2.4. Phytochimie
I.1.3. Tetraclinis articulata (Vahl.) Masters (Cupressaceae)
I.1.3.1. Description botanique et habitats
I.1.3.2. Répartition géographique
I.1.3.3. Utilisations traditionnelles
I.1.3.4. Propriétés pharmaceutiques
I.1.3.5. Phytochimie
I.2. Métabolites secondaires
II. Antioxydants et radicaux libres
II.1. Définition d’un radical libre
II.2. Défense de l’organisme contre les agressions radicalaires
II.3. Définition des antioxydants
II.4. Systèmes de défense antioxydants et mécanisme d’action
II.5. Système de défense exogène «antioxydants naturels»
II.6. Polyphénols comme antioxydant
II.7. Flavonoïdes comme antioxydants
II.7.1. Piégeage des radicaux libres
II.7.2. Inhibition de la peroxydation lipidique
II.7.3. Chélation des ions métalliques
II.7.4. Inhibition des enzymes
III. Autre activités biologiques
III.1. Activité anti-inflammatoire
III.1.1. Inflammation et agents inflammatoires
III.1.2. Agents anti-inflammatoires et mécanismes d’actions
III.2. Activité cytotoxique (anti-tumorale)
III.2.1. Cancer
III.2.2. Substances cytotoxiques et mécanisme d’actions
III.3. Activité antibactérienne

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