Analyse sur gel d’agarose de la PCR 2 nichée spécifique du diagnostic moléculaire à P. falciparum

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Cycle asexué chez l’homme

 Cycle hépatique ou exo-érythrocytaire
Les sporozoïtes sont les premières formes infestantes de Plasmodium injectés par l’anophèle femelle lors de son repas sanguin. Ces formes parasitaires restent pendant plusieurs minutes dans la peau, la lymphe et le sang avant d’atteindre le foie. Ils se transforment ensuite en schizontes ou « corps bleus » qui sont formés par plusieurs noyaux. Après 7 à 15 jours, les schizontes deviennent matures et se multiplient dans les cellules hépatiques. S’ensuit la rupture des schizontes pour libérer des milliers de mérozoïtes dans la circulation sanguine (Figure 2, Etape 4).
Contrairement à P. falciparum et P. malariae, P. vivax et P. ovale présentent des sporozoïtes intra-hépatiques dans un état dormant appelés hypnozoïtes. Ils sont responsables d’une schizogonie hépatique retardée qui entraîne à nouveau la libération de mérozoïtes dans le sang plusieurs mois après la piqûre du moustique. Ces formes vont être à l’origine d’accès de reviviscence du paludisme à P. vivax et à P. ovale.
 Cycle sanguin ou érythrocytaire.
Après libération des mérozoïtes, ces formes parasitaires envahissent les globules rouges. Des interactions spécifiques entre le parasite et la surface de la membrane du globule rouge permettent la pénétration du parasite dans les érythrocytes. Dans les érythrocytes, les parasites se transforment en trophozoïtes présentant des formes en anneaux. Les trophozoïtes vont se multiplier et maturer en schizontes qui conduisent à la destruction du globule rouge et à une nouvelle libération de mérozoïtes. Toutes ces transformations sont variables entre 24, 48 ou 72 heures, en fonction des espèces plasmodiales.
La libération de mérozoïtes dans le sang entraine une augmentation de la parasitémie chez l’homme. Le sujet devient alors fébrile avec des symptômes cliniques comme la fatigue et la fièvre caractéristiques d’un accès palustre simple. Les cas du paludisme grave causés par P. falciparum est caractérisés par des symptômes sévères (anémie, détresse respiratoire, hypoglycémie, insuffisance rénale) résultant de la propriété de P. falciparum de se séquestrer dans les organes nobles tels que le cerveau, les poumons, les reins et notamment dans le placenta chez la femme enceinte. P. vivax a longtemps été considéré comme un parasite peu virulent mais actuellement, il est reconnu comme un pathogène susceptible de provoquer des complications graves.
Après un certain nombre de cycles érythrocytaires, certains mérozoïtes subissent une maturation accompagnée d’une différenciation sexuée, pour se transformer en gamétocytes mâle ou femelle (Figure 2). Ces gamétocytes sont ingérés par le moustique lors d’un nouveau repas sanguin pour générer la reproduction du parasite (Figure 2, Etape 8).

Cycle sexué chez les moustiques

Le cycle sexué chez le moustique Anopheles débute par l’évolution des gamétocytes ingérés en gamètes dans la lumière de l’estomac de l’anophèle (Figure 2, Etape 9). Les gamètes se différencient en macrogamète femelles et en microgamète mâles après un processus de division et d’exflagelation. Puis, se produit la fécondation qui conduit à la formation d’un zygote mobile diploïde ou ookinète. L’ookinète va traverser la paroi stomacale du moustique et devenir un oocyste après division méiotique. Les cellules dans l’oocyste vont prendre une forme allongée et se transforment en sporoblastes puis en sporozoïtes (Figure 2, Etape 12). La membrane de l’oocyste alors éclate et libère des sporozoïtes. Ils migrent vers la glande salivaire du moustique pour être injecte dans l’hôte humain lors d’un prochain repas sanguin (Figure 2, Etape 1).

Le paludisme à Madagascar

Madagascar est une île de l’Afrique Subsaharienne située dans la zone tropicale dans le sud-ouest de l’Océan Indien, entre 11°57’ et 25°30’ de latitude Sud et 43°14’ et 50°27’ de longitude Est à 400 km des côtes orientales africaines du Mozambique. Madagascar possède une superficie de 590 000 km² avec 5 000 kilomètres de côtes. Les parties côtières sont de basse altitude par rapport au centre du pays caractérisé par les hautes terres centrales avec une altitude de plus de 1500m. Deux saisons climatiques bien distinctes sont observées dans les hautes terres centrales, caractérisées par un été chaud et pluvieux et un hiver frais et sec. Contrairement au climat des hautes terres centrales, le climat sur les côtes est plutôt chaud toute l’année et mais également pluvieux sur la côte Est de l’île. Par exception, le Sud de Madagascar présente un climat semi-aride voire sec presque toute l’année.
Madagascar est un pays en voie de développement avec un taux d’alphabétisation faible estimé à 50% au niveau national dont la majorité des cas sont les femmes. Les chiffres montrent que seulement 12,9% des femmes malgaches finissent le primaire et 4% pour le secondaire. Seulement 2,3% des femmes ont un diplôme supérieur (EIPM 2016).
Le paludisme reste un problème majeur de santé publique dans la grande île. Il représente la huitième cause de morbidité surtout chez les enfants et les femmes enceintes, ces deux sous-populations possédant un système immunitaire faible (Plan Stratégique National de Lutte Contre le paludisme, 2013-2017) (Kesteman et al., 2014).
Le paludisme à P. falciparum est très abondant dans toute l’île avec un taux de 95%. Chez les patients à faible immunité, P. falciparum provoque des infections aiguës pouvant conduire à la mort si un traitement approprie n’est pas donné rapidement.
De façon générale, P. vivax a longtemps été négligé dans le monde. En 2010, une étude épidémiologique réalisée à Madagascar a montré une prévalence de P. vivax non négligeable de 8,8%, notamment dans la région ouest en marge des hautes terres centrales dans les régions de Tsiroanomandidy et Maevatana (Menard et al., 2010).
En fonction des conditions climatiques et de la capacité vectorielle des moustiques Anopheles, on peut classer les zones de paludisme à Madagascar en quatre faciès (Mouchet et al., 1995 ; EIPM, 2016) ((Figure 3) :
 Le faciès équatorial sur la côte-est avec un forte transmission pérenne.
 Le faciès tropical sur la côte-ouest avec un paludisme saisonnier d’environ six mois entre octobre et avril.
 Le faciès subdésertique dans le sud avec une transmission épisodique et courte.
 Le faciès des hauts plateaux avec un paludisme instable entre janvier et avril
De ces quatre faciès, résultent des types de transmission variables dans le pays, avec des régions endémiques au paludisme et autres régions subissant des épidémies :
– Sur les côtes Est et Ouest du pays, le paludisme est stable avec une transmission élevée et régulière. La morbidité et la mortalité sont concentrées chez les jeunes enfants âgés de moins de 15 ans.
– Dans la région Sud et Hautes terres centrales (HTC), le paludisme est instable. Notamment, la transmission dans les hautes terres reste très basse ayant été interrompue pendant plusieurs années. Contrairement aux HTC, la région du Sud-Ouest subit des épidémies tous les ans.

Tests de diagnostic du paludisme

Les tests de diagnostic ont comme objectif principal de déterminer la prévalence d’une maladie dans une population. La prévalence est le nombre de cas d’une maladie enregistré dans une population déterminée à un moment donné. La prévalence du paludisme est généralement déterminée à partir de trois méthodes : le diagnostic microscopique, les tests de diagnostic rapide (TDR) immunochromatographiques et le diagnostic moléculaire réalisé par PCR.

Diagnostic microscopique

Méthode et analyse

Le diagnostic du paludisme par microscopie est une méthode de diagnostic directe du parasite dans le sang dans le cas de suspicion palustre afin de confirmer la positivité à l’infection. C’est la première méthode d’identification des espèces plasmodiales infectant l’homme, recommandée par l’OMS. (Wongsrichanalai et al., 2007, Demas et al., 2011, Mawili-Mboumba et al, 2013, MZE et al., 2016).
Le diagnostic microscopique est réalisé à partir de deux préparations d’étalement du sang sur des lames : la goutte épaisse et le frottis mince. Les gouttes de sang issues de la piqure de prélèvement, au niveau du 3ème ou 4ème doigt de la main chez les enfants et les adultes et au niveau du talon ou du gros orteil chez les nourrissons, sont déposées sur une lame. Les deux préparations sont ensuite fixées avec de l’alcool méthylique et colorées avec de la solution de Giemsa. Après séchage, les lames sont prêtes pour l’observation au microscope. La goutte épaisse est la première méthode qui permet d’évaluer la parasitémie (nombre des parasites par microlitre de sang) chez le patient. Le frottis mince permet de voir les espèces plasmodiales responsable du paludisme.

Avantages et limites

Le diagnostic microscopique est utilisé en raison des différents avantages qu’il présente tels que l’obtention rapide des résultats et son coût d’utilisation modéré. Il représente également la seule méthode de diagnostic qui permet de déterminer le nombre de parasites par microlitre de sang. Par contre, la préparation des lames et une analyse microscopique rigoureuse et juste des lames nécessitent une expertise des personnes en charge du diagnostic (Canier et al.,2013)
Le seuil de détection du diagnostic microscopique est d’environ 50 à 200 parasites par µL de sang (Rakotonirina et al., 2008). Une personne expérimentée pourra analyser jusqu’ à 10-20 parasites par microlitre de sang. De plus, les études ont montré qu’il était difficile d’identifier les infections mixtes à partir d’un diagnostic microscopique (Payne., 1988)

Test de diagnostic rapide (TDR)

Méthode et analyse

Le TDR est un test immunochromatographique qui repose sur la détection des antigènes spécifiques aux espèces plasmodiales.
Le sang total prélevé au niveau de la pulpe du doigt, est déposé sur la membrane de nitrocellulose qui compose le TDR. S’il y a présence d’antigènes d’espèces plasmodiales dans le sang, le ou les antigènes détectés s’attachent aux anticorps monoclonaux spécifiques marqués d’un chromogène le plus souvent à l’or colloïdal. Le TDR détecte trois types d’antigène spécifiques aux espèces plasmodiales : la protéine HRP2 (Histidine rich protéine 2) spécifique à P. falciparum, la protéine pLDH (Plasmodium lactate déshydrogénase) qui est un antigène spécifique aux 5 espèces plasmodiales et la protéine aldolase spécifique aux 4 espèces plasmodiales excepté P. knowlesi (Rakotoarivelo et al., 2012).
L’addition d’un tampon de lyse permet aux complexes antigènes-anticorps de migrer par capillarité. Les complexes sont arrêtés par un deuxième anticorps révélateur fixés à la membrane. Quatre types de résultats peuvent être obtenus suite à la révélation de bandes colorées visibles sur le TDR:
 TDR 100 : test négatif correspondant à la coloration de la ligne de contrôle indiquant la bonne réalisation du test
 TDR 101 : test positif à P. falciparum seul
 TDR 110 : test positif à non P. falciparum
 TDR 111 : test positif à P. falciparum ou coïnfection avec d’autre Plasmodium

Avantages et limites

En comparaison au diagnostic microscopique, le TDR possède plusieurs avantages : il est facile à utiliser et réalisable dans la majeure partie des zones d’études incluant les zones enclavées. De plus, la positivité ou négativité au paludisme est obtenue après 15 minutes. En raison de ces critères, en plus du diagnostic microscopique, l’OMS recommande fortement l’emploi du TDR en cas de suspicion palustre (Perkins et al., 2008, Mawili-Mboumba et al., 2013, Aubry et al., 2015). Par contre, le TDR présente un seuil de détection inférieur à celui du diagnostic microscopique correspondant à une parasitémie proche de 100 parasites/µL de sang (Zimmerman et Howes., 2015).
Par comparison avec le diagnostic microscopique, le TDR peut mener à des résultats discordants sur la positivité et l’identification d’un accès palustre. Un TDR est qualifié de faux négatif lorsque la parasitémie est basse, inférieure au seuil de détection du TDR utilisé. De même, un diagnostic faux positif peut être obtenu jusqu’à 3 à 4 semaines après élimination du paludisme par l’ACT (Rakotoraivelo et al., 2012).

Diagnostique par réaction de polymérisation en chaîne (PCR)

Méthode et analyse : la PCR nichée

La PCR est une technique élaborée à la fin des années 1980 par Pr. K.B. Mullis, qui a reçu pour ces recherches le Prix Nobel de Chimie en 1993. La réaction de PCR consiste en l’amplification d’une région spécifique d’un génome par réplication in vitro afin d’obtenir de multiples copies d’un fragment d’ADN cible d’un ADN matriciel génomique. L’ADN matriciel peut être de l’ADN génomique humain, de l’ADN d’un pathogène viral, bactérien ou parasitaire, ou de l’ADN complémentaire à partir d’un ARN messager. Les gènes sont amplifiés de façon exponentielle à partir de l’utilisation d’un couple d’amorces délimitant la séquence d’intérêt : l’amorce sens (5’→3’) et l’amorce anti-sens (3’→5’). Le produit de PCR obtenu est appelé amplicon. Il existe différents types de PCR : la PCR conventionnelle, la PCR en temps réel ou qPCR, et la reverse-transcriptase PCR (RT-PCR).
C’est dans les années 1990 que la PCR a été exploitée pour obtenir un diagnostic moléculaire des espèces plasmodiales présentes dans le sang. C’est à partir d’une succession de PCRs conventionnelles, qu’une méthode appelée PCR nichée a été développée par Snounou et collaborateurs pour le diagnostic moléculaire du paludisme. Cette réaction de PCR a pour gène-cible le gène codant pour la petite sous unité 18s de l’ARN ribosomique (Snounou et al., 1993, 2002).
Le diagnostic moléculaire par PCR nichée est réalisé dans un premier temps avec des amorces spécifiques au genre Plasmodium pour la PCR initiale. Cette première PCR conventionnelle a pour but d’identifier la présence du parasite Plasmodium avec comme ADN matriciel l’ADN génomique du patient.
Le deuxième objectif de la PCR nichée est de déterminer les espèces plasmodiales. Ainsi, des amorces spécifiques à chaque espèce plasmodiales sont utilisées pour les PCRs suivantes avec comme ADN matriciel les amplicons issus de la première PCR (Singh et al., 1996, 1999).
Depuis le séquençage du génome de P. falciparum et P. vivax en 2002, différents protocoles ciblant des nouveaux gènes ont été élaborés sur la base du nombre de copie du gène ciblé (Isozumi et al., 2015, Echeverry et al., 2016, Mixson-Hayden et al., 2010). Le gène codant pour le cytochrome b possède 40 à 100 copies d’ADN au niveau de l’ADN mitochondrial de Plasmodium, comparé au gène codant pour la petite sous unité 18s de l’ARN ribosomique qui présente moins de 10 copies chez le Plasmodium (Putaporntip et al., 2011). Ainsi, le cytochrome b représente une nouvelle cible attractive pour le diagnostic moléculaire des espèces plasmodiales (Steenkeste et al., 2009, Farrugia et al., 2011 ; Canier et al., 2013).

Avantages et limites

Par comparaison au diagnostic microscopique et le TDR, la PCR nichée possède un seuil de détection plus élevé, pouvant détecter 1 à 10 parasites par microlitre de sang (Mens et al., 2007, Zimmerman et Howes., 2015). Des études épidémiologiques ont mis en évidence une sensibilité et spécificité du diagnostic par PCR plus élevées que le diagnostic microscopique et le TDR. De plus, la PCR nichée permet de diagnostiquer les infections mixtes (Singh et al., 1996 ; Mze et al., 2016).
En revanche, le diagnostic moléculaire par PCR nécessite des réactifs et un équipement couteux ainsi qu’une expertise technique. Par conséquent, le diagnostic moléculaire est difficilement réalisable pour la confirmation de cas palustres dans les zones endémiques ou lors des épidémies.

Problématique et objectifs

Le paludisme est la huitième cause de mortalité et morbidité à Madagascar qui reste encore un pays endémique à plus de 90% (EIPM 2016).
En Décembre 2015, une augmentation significative du nombre de cas du paludisme a été identifiée dans la commune d’Ankililoaka, district de Tuléar II au Sud-ouest de Madagascar (Investigation and Intervention in district of Tuléar II., 2015). Cette région est caractérisée par un facies subdésertique (Figure 3) et est sujette chaque année à des épidémies. En réponse à cette épidémie, une étude-riposte a été réalisée par la Direction de Lutte contre le Paludisme (DLP). Celle-ci a inclus plusieurs volets d’études : une investigation parasitologique, entomologique et anthropologique. L’étude parasitologique a consisté en une analyse de la prévalence du paludisme à partir des TDRs et de la réalisation de confettis sanguins (prélèvement de sang sur papier buvard). Après criblage, une cohorte d’enfants âgés de 6 mois à 15 ans a reçu un traitement à l’ACT pendant les trois premiers mois de l’année 2016. En mars 2016, la DLP a évalué l’efficacité thérapeutique en se basant sur une nouvelle mesure de la prévalence du paludisme trois mois après administration de l’ACT, à partir de TDRs et lames microscopiques, sur la population ciblée.
L’objectif principal du projet de recherche réalisé au laboratoire de parasitologie de la DLP est d’évaluer la faisabilité d’un nouveau protocole pour le diagnostic du paludisme ciblant le gène du cytochrome b mitochondrial des espèces plasmodiales. Ce travail a pour objectifs :
 De comparer la sensibilité de ce protocole avec celle du protocole généralement utilisé qui cible la sous-unité 18s de l’ARN ribosomique.
 D’évaluer une prévalence du paludisme dans la commune d’Ankililoaka après chimio-prévention à partir des résultats de diagnostic moléculaire réalisé sur un échantillon déterminé de la population cible traitée dans le Fokontany d ‘Ankililoaka II.
La deuxième partie du projet a consisté en une validation du protocole PCR ciblant le gène du cytochrome b mitochondrial de Plasmodium sur un autre échantillon d’individus résidant dans la commune d’Ampasimpotsy située dans le district de Tsironomandidy.
Cette région se trouve dans le centre Ouest de Madagascar en marge des hauts plateaux et correspond à un faciès épidémiologique différent de la population d’Ankililoaka dans le Sud-ouest de Madagascar. En effet, cette région est endémique au paludisme avec une haute saison de transmission de novembre à Mai. Les personnes inclues dans l’étude sont les patients fébriles qui vont consulter dans les trois centres de santé de base (CSB) dans la commune d’Ampasimpotsy. Le diagnostic moléculaire réalisé sur les individus qui sont venus consulter dans les CSBs en Mai et Juin 2016 a permis de déterminer une prévalence basée sur la PCR dans cette région en fin de transmission du paludisme. Cette prévalence par PCR a été comparée à celle obtenue par TDRs.

MATERIELS ET METHODES

La réalisation de diagnostic moléculaire par PCR nichée comprend trois étapes :
• La confection des confettis sanguins sur terrain
• L’extraction d’ADN à partir des confettis
• Amplification du gène-cible des espèces plasmodiales par PCR nichée.

Confettis sanguins associés aux deux populations d’étude

Réalisation des confettis sanguin associés à la population d’Ankililoaka II

Les confettis sanguins sont les premiers outils pour réaliser un diagnostic moléculaire des patients par PCR. Ils sont préparés à partir des prélèvements sanguins au bout du doigt sur la population sélectionnée qui inclut uniquement les enfants âgés de 6 mois à 15 ans. Le sang prélevé est déposé sur un papier buvard pour former un confetti de sang. Les confettis sanguins sont ensuite séchés et placés dans des sachets plastiques comportant un dissécateur et conservés à température ambiante. Le code terrain associé au patient prélevé est reporté sur le confetti. Tous les confettis réalisés sur le terrain sont alors transportés au laboratoire de parasitologie de la DLP et conservés à 4°C.

Réalisation des confettis associés à la population d’Ampasimpotsy

De même que pour la population étudiée d’Ankililoaka, le diagnostic moléculaire sur la population ciblée à Ampasimpotsy est réalisé à partir de confettis sanguins. Pour chaque patient fébrile se présentant dans les trois CSBs d’Ampasimpotsy, CSB Nord, CSB Centre et CSB Sud, un confetti sanguin est réalisé lors de la consultation puis stocké avant transport au laboratoire de parasitologie de la DLP et conservé à -80°C.

Extraction d’ADN

L’extraction d’ADN est la deuxième étape dans la réalisation d’un diagnostic moléculaire à partir d’échantillons de terrain. L’extraction d’ADN à partir de confetti sanguin se fait en trois phases successives : lyse des cellules sanguines, séparation de l’ADN avec le lysat cellulaire et extraction de l’ADN. Deux protocoles d’extractions ont été utilisés dans ce projet : la méthode d’extraction InstaGène (BioRad #732-6030) et la méthode QIAGEN (QIAamp DNA Mini kit (250), n°51306). La phase finale d’extraction de l’ADN doit être réalisée avec précaution afin de minimiser au mieux la présence d’autres molécules susceptibles d’inhiber la réaction de PCR.

Méthode d’extraction InstaGène

Préparation des solutions de travail

Les compositions des solutions de travail nécessaire au protocole d’extraction d’ADN par la méthode InstaGène sont détaillées dans le tableau 1. La première étape consiste en la préparation de deux solutions :
• Le tampon phosphate (PBS) de concentration 10X et 1X : Le tampon de PBS 10X est préparé à partir de 3,9g de NaH2PO4, de 13,4g de NaHPO4, de 85g de NaCl et 1L d’eau distillée. Le tampon de PBS 1X est obtenu en diluant le tampon PBS 10X au 1/10ème avec de l’eau distillée. Le tampon PBS 1X est ensuite autoclavé pour travailler dans des conditions stériles (tableau 1).
• Une solution de saponine (Sigma N) mère à 5% est préparée à partir de la dissolution de 0,5g de saponine dans 10mL de tampon PBS 1X. Puis cette solution mère est diluée au 1/10ème avec 45mL de tampon PBS 1X afin d’obtenir une solution finale de saponine à 0,5%.

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Table des matières

INTRODUCTION
A. GENERALITES
I. Le paludisme
I.1 Contexte scientifique
I.2.Cycle évolutif du Plasmodium
I.2.1. Cycle asexué chez l’homme
I.2.2. Cycle sexué chez les moustiques
I.3. Le paludisme à Madagascar
II. Tests de diagnostic du paludisme
II.1. Diagnostic microscopique
II.1.1. Méthode et analyse
II.1.2. Avantages et limites
II.2. Test de diagnostic rapide (TDR)
II.2.1. Méthode et analyse
II.2.2. Avantages et limites
II.3. Diagnostique par réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
II.3.1. Méthode et analyse : la PCR nichée
II.3.2. Avantages et limites
III. Problématique et objectifs
B. MATERIELS ET METHODES
I. Confettis sanguins associés aux deux populations d’étude
I.1. Réalisation des confettis sanguin associés à la population d’Ankililoaka II
I.2. Réalisation des confettis associés à la population d’Ampasimpotsy14
II. Extraction d’ADN
II.1. Méthode d’extraction InstaGène
II.1.1. Préparation des solutions de travail
II.1.2. Protocole d’extraction
III. Diagnostic moléculaire par PCR nichée
III.1. Méthodologie
III.1.1. Préparation du mastermix
III.1.2. Amplification d’ADN
III.2. Analyse par électrophorèse
III.2.1. Préparation du gel d’agarose
III.2.2. Dépôt et migration des produits de la PCR 2
III.2.3. Visualisation des bandes après migration
C. RESULTATS et DISCUSSION
I. DISTRIBUTION DES ESPECES PLASMODIALES A ANKILILOAKA PAR DIAGNOSTIC MOLECULAIRE
I.1. Détermination par PCR cytochrome b des infections plasmodiales
I.1.1. Analyse sur gel d’agarose de la PCR 2 nichée spécifique du diagnostic moléculaire à P. falciparum
I.1.2. Analyse sur gel d’agarose de la PCR2 nichée spécifique du diagnostic moléculaire à P. vivax
I.2. Comparaison de la prévalence de la PCR cytochrome b avec la PCR de Snounou
I.3. Comparaison de la prévalence de ces deux méthodes de diagnostic moléculaire avec les TDRs
I.3.1 Comparaison de la PCR cytochrome b avec le TDR
I.3.2. Comparaison de la PCR de Snounou avec le TDR
I.4. Discussion
II. DISTRIBUTION DES ESPECES PLASMODIALES A AMPASIMPOTSY PAR DIAGNOSTIC MOLECULAIRE
II.1. Détermination par PCR cytochrome b des infections plasmodiales
II.1.1. Analyse sur gel d’agarose de la PCR2 nichée spécifique du diagnostic moléculaire à P. falciparum
II.1.2. Analyse sur gel d’agarose de la PCR2 nichée spécifique du diagnostic moléculaire à P. vivax
II.1.3. Analyse sur gel d’agarose de la PCR2 nichée spécifique du diagnostic moléculaire à P. malariae
II.1.4. Analyse sur gel d’agarose de la PCR2 nichée spécifique du diagnostic moléculaire à P. ovale
II.2. Détermination des infections plasmodiales et prévalences du paludisme à Ampasimpotsy.
II.2.1. Comparaison de la prévalence de la PCR cytochrome b avec le TDR au mois de Mai 2016
II.2.2. Comparaison de la prévalence de la PCR cytochrome b avec le TDR au mois de Juin 2016
II.3. Discussion
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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