Analyse structurale des carraghénanes par hydrolyse enzymatique

Les algues sont des organismes eucaryotes photosynthétiques qui appartiennent à des lignées phylogénétiques différentes. Les algues rouges (Rhodophyta) font partie, comme les algues vertes (Chlorophyta) et les plantes supérieures (Streptophyta) de la lignée des plantes, alors que les algues brunes (Phaeophyta) appartiennent à la lignée des hétérokontes (Figure 1). Les cellules des algues et des plantes supérieures ont en commun la particularité de posséder une paroi autour de leur membrane plasmique. La paroi de certaines algues rouges est principalement composée de polysaccharides sulfatés : les carraghénanes. La première algue carraghénophyte découverte fut Chondrus crispus (Irish Moss) en 1862 par Stanford, qui donna le nom « carrageenin » au matériel gélatineux qu’il avait extrait de l’algue. Les propriétés gélifiantes et viscosifiantes des carraghénanes ont été utilisées dès le 19ème siècle en Europe dans la confection de flans. L’expansion industrielle de la production de carraghénanes s’est effectuée après la seconde guerre mondiale et leur gamme d’applications s’est étendue. La limitation des algues sauvages a entraîné des recherches sur leur cycle de vie et une industrie de culture des algues, principalement des espèces Eucheuma, a été mise en place en Asie. L’industrie des  carraghénanes est estimée aujourd’hui à 35 000 tonnes/an (Source Cargill). Les carraghénanes ont des structures qui varient suivant les espèces d’algues dont ils sont extraits. Afin de corréler les structures et les propriétés texturantes des carraghénanes, des méthodes d’analyses structurales chimiques et spectroscopiques ont été développées ces 80 dernières années. Le développement récent des biotechnologies, notamment de la glycobiologie, a généralisé de plus en plus l’utilisation des enzymes, glycoside hydrolases et polysaccharide lyases, dans l’analyse des polysaccharides. La caractérisation des κ-, ι- et λcarraghénases, les glycoside hydrolases spécifiques des carraghénanes, ainsi que leur utilisation comme outils d’analyse structurale a fait l’objet de cette thèse.

Les carraghénanes

Organisation de la paroi des algues rouges

La paroi des algues est un lieu d’échanges intercellulaires et d’échanges avec le milieu extérieur. La paroi donne aux cellules leur forme et leur permet de croître. Elle est aussi une barrière contre les agressions extérieures. L’organisation générale de la paroi des algues rouges est similaire à celles des autres algues (brunes, vertes) et des plantes supérieures. Chaque cellule possède, en plus de sa membrane plasmique, une paroi polysaccharidique, et les cellules sont reliées entre elles par une matrice intercellulaire (Figure 2). La paroi et la matrice intercellulaire sont constituées d’une phase squelettique cristalline de polysaccharides insolubles, et d’une phase matricielle amorphe de polysaccharides plus hydrosolubles.

La phase squelettique des algues rouges, et des végétaux en général, est constituée de polysaccharides linéaires neutres, majoritairement des microfibrilles cristallines de cellulose, et parfois de xylanes ou de mannanes (Tableau 1). La cellulose est une chaîne linéaire de (1Æ4)β-D-glucoses en conformation chaise 4 C1 qui donne à la cellulose une disposition en ruban. Des liaisons hydrogène intra et intermoléculaires stabilisent la cellulose sous forme de microfibrilles cristallines. La cellulose ne représente que 1 à 8% du poids sec chez les Rhodophyta et les Phaeophyta (Ross, 1953), alors qu’elle constitue 30% du poids sec des plantes supérieures. Certaines Chlorophyta peuvent même contenir jusqu’à 70% de cellulose cristalline (Frei et al., 1961). Bien qu’en faible quantité chez les algues rouges, la cellulose joue un rôle structural important en permettant à l’algue de résister à l’hydrodynamisme du milieu.

Les phases matricielles des algues rouges et brunes représentent la majeure partie du poids sec des algues. Elles sont composées de polysaccharides anioniques, portant des groupements sulfates (carraghénanes, agars, fucanes) ou des groupements carboxylés (alginates) (Tableau 1). Les deux polysaccharides principaux de la phase matricielle des algues rouges sont les carraghénanes et les agars, galactanes linéaires sulfatés de masse moléculaire élevée (400 à 600 kDa). Ils sont composés alternativement d’unités (1Æ3)β-Dgalactopyranose et d’unités (1Æ4)α-galactopyranose de configuration absolue D chez les carrraghénanes et L chez les agars. Des structures branchées (xylose, acide glucuronique) plus complexes ont aussi été observées comme des xylomannanes sulfatés (Usov, 1984; Kolender et al., 1997), des xylogalactanes sulfatés branchés (Usov et al., 1997; Duarte et al., 2002) et des galactoglucuronoxylanes non sulfatés (Watt et al., 2002). L’importance de la phase matricielle dans la paroi des algues rouges ainsi que sa composition polyanionique particulière, reflètent des propriétés spécifiques du milieu marin (résistance au courant, pression osmotique, échanges ioniques, rétention de l’eau à marée basse) (Kloareg et al., 1988).

La différenciation entre la paroi et la matrice intercellulaire est peu distincte et elle se base essentiellement sur des différences de distribution des polysaccharides squelettiques et matriciels. Les polysaccharides squelettiques sont abondants dans la paroi proche de la cellule et presque absents de la matrice intercellulaire. La paroi des algues rouges contient aussi des protéines pariétales, mais en quantité relativement faible, et qui sont concentrées notamment dans la paroi externe (Craigie, 1990). Ces protéines jouent un rôle important, entre autres, pour l’adhésion cellulaire, le transport ionique et la biosynthèse .

Diversité des algues rouges carraghénophytes

Les espèces carraghénophytes sauvages sont nombreuses, faisant partie notamment des genres Chondrus, Gigartina, Iridaea et Chondracanthus de la famille Gigartinaceae (Figure 3). La culture de carraghénophytes de la famille Soleriaceae, notamment des espèces Kappaphycus alvarezii (Eucheuma cottonii) et Eucheuma denticulatum (Eucheuma spinosum), a été développée aux Philippines puis en Indonésie et Tanzanie (Figure 3). L’extraction des carraghénanes de la paroi de ces algues est réalisée dans l’eau à chaud et en milieu alcalin. Le carraghénane est ensuite filtré à chaud afin d’éliminer les résidus insolubles, notamment la cellulose de la phase squelettique. Le carraghénane peut ensuite être récupéré de la solution par précipitation à l’alcool ou au chlorure de potassium dans certains cas (Figure 4). Environ 80 000 tonnes d’algues rouges sèches sont nécessaires pour produire 20000 tonnes de carraghénanes (Bixler, 1996).

Structure des carraghénanes

Nomenclature des carraghénanes

Les carraghénanes sont composés alternativement d’unités (1Æ3)β Dgalactopyranoses (unités G) et (1Æ4)α-D-galactopyranoses (unités D) (Figure 5). Les (1Æ4)α-D-galactopyranoses peuvent aussi exister sous la forme 3,6 anhydrogalactopyranoses (unités DA). Ces unités G et/ou D peuvent être substituées à différentes positions par des sulfates (S), des O-méthyles (M) ou des groupements d’acide pyruvique sous la forme de kétal cyclique (P), créant ainsi une grande diversité de structures de carraghénanes. La position des substituants est indiquée par le numéro des carbones auxquels ils sont attachés sauf pour le groupement P toujours positionné sur les mêmes carbones 4 et 6 de l’unité D. Les unités galactopyranoses G et D des carraghénanes adoptent la conformation chaise qui permet de placer en position équatoriale le groupement CH2OH relativement volumineux, ainsi que la plupart des autres groupements hydroxyles potentiellement substituables (Figure 5). Les unités D et G ont une conformation chaise 4 C1 et les unités DA ont une conformation chaise 1 C4.  La désignation des différentes unités s’effectue par un code alphabétique (Knutsen et al., 1994) pour pallier les limites rencontrées avec le code des lettres grecques (Rees, 1969). Une lettre grecque était attribuée à chaque nouveau motif disaccharidique identifié et leur nombre augmentait rapidement. Le code alphabétique permet de décrire n’importe quel motif et il est surtout utile dans la description de chaînes complexes de carraghénanes contenant plusieurs motifs disaccharidiques différents. Le code des lettres grecques est toujours communément utilisé pour les carraghénanes commerciaux constitués majoritairement d’un seul motif de répétition, comme, par exemple, le κ carraghénane (G4S-DA) extrait de K. alvarezii.

Classification des carraghénanes

La première classification des carraghénanes a été basée sur leurs propriétés de gélification. Le carraghénane extrait de C. crispus se divisant en deux fractions dans le KCl, la dénomination lambda carraghénane a été donnée aux carraghénanes de l’extrait soluble, et la dénomination kappa carraghénane à la fraction insoluble (Smith et al., 1953). Avec les avancées de l’analyse structurale, les carraghénanes ont ensuite été classés dans différentes familles, en se basant sur la position des sulfates sur les unités G. Deux familles, kappa et lambda, ont tout d’abord été distinguées (McCandless et al., 1979), auxquelles se sont ajoutées la famille beta (Greer et al., 1984a) et la famille oméga (Mollion et al., 1986) (Figure 6).

La famille kappa (G4S)
Elle se caractérise par une sulfatation en position 4 de l’unité G. Elle se compose des carraghénanes kappa (G4S-DA) et iota (G4S-DA2S) et de leurs précurseurs biosynthétiques respectifs mu (G4S-D6S) et nu (G4S-D2S,6S) (Anderson et al., 1973). Les motifs précurseurs µ- et υ-carraghénanes peuvent être convertis en motifs κ- et ι-carraghénanes, lors de la biosynthèse sous l’action de galactose-6 sulfurylases, ou industriellement par un traitement alcalin (Bellion et al., 1983). Cette transformation s’effectue par la fermeture du pont 3,6- anhydro, concomitante au départ du groupement sulfate en C6. Ces carraghénanes de la famille kappa se rencontrent chez de nombreuses espèces d’algues rouges, avec des compositions en motifs kappa et iota, s’échelonnant d’une dominante kappa comme chez les K. alvarezii (Bellion et al., 1981) vers une dominante iota comme chez E. denticulatum (Bellion et al., 1981) (Figure 7).

La famille lambda (G2S)
La famille lambda se compose des carraghénanes possédant une sulfatation en position 2 sur l’unité G du motif. Ces carraghénanes se rencontrent dans les parois des tétrasporophytes de certaines espèces de Gigartinaceae et Phyllophoraceae. La structure majoritairement rencontrée est de type lambda (G2S-D2S,6S) (Matulewicz et al., 1990; Noseda et al., 1993; Falshaw et al., 1994; Stortz et al., 1994; Falshaw et al., 1998). La structure θ-carraghénane (G2S-DA2S) peut être obtenue par la lente transformation alcaline du λ−carraghénane (Ciancia et al., 1993b). Cette structure θ carraghénane est aussi naturellement présente chez certaines algues comme C. hombroniana (Miller, 2003; Falshaw et al., 2005). Des structures désulfatées comme le ξ -carraghénane (G2S-D2S) (Penman et al., 1973) et pyruvatées comme le π  carraghénane (G2S-DP2S) (DiNinno et al., 1979) ont aussi été observées en proportion plus ou moins importante chez les tétrasoporophytes de différentes espèces de Gigartinaceae (McCandless et al., 1983; Falshaw et al., 1995; Falshaw et al., 1998).

La famille beta (G)
Elle regroupe les carraghénanes qui ne possèdent pas de groupement sulfate sur leur unité G comme le β-carraghénane (G-DA) et son précurseur le γ-carraghénane (G-D6S), isolés chez Eucheuma gelatinae (Greer et al., 1984a) et Furcellaria lumbricalis (Knutsen et al., 1987). L’α-carraghénane (G-DA2S) et son précurseur biologique le δ-carraghénane (GD2S,6S) font aussi partie de cette famille et ont été isolés chez Catenella nipea (Zablackis et al., 1986; Falshaw et al., 1996) .

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Table des matières

Introduction générale
I. Les carraghénanes
A. Organisation de la paroi des algues rouges
B. Diversité des algues rouges carraghénophytes.
C. Structure des carraghénanes
1. Nomenclature des carraghénanes
2. Classification des carraghénanes
D. Origines de la diversité structurale des carraghénanes.
1. Variation de la structure des carraghénanes au cours du cycle de reproduction des algues
2. Localisation des différents carraghénanes dans le thalle
3. Biosynthèse des carraghénanes
E. Propriétés fonctionnelles des carraghénanes
1. Propriétés physico-chimiques
2. Activités biologiques des carraghénanes
II. Analyse structurale des carraghénanes
A. Détermination du poids moléculaire et de la polydispersité.
B. Détermination des unités de répétition des carraghénanes
1. Méthodes chimiques
2. Méthodes spectroscopiques
a. Spectroscopie Infra-Rouge
b. Spectroscopie RMN (Résonance Magnétique Nucléaire)
3. Analyse par spectrométrie de masse des oligo-carraghénanes
a. Electrospray Ionisation Mass Spectrometry (ESI-MS)
b. MALDI-TOF (Matrice Assisted Laser Desorption/Ionisation / Time Of Flight)
c. Couplage LC-MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry)
III. Les carraghénases
A. Généralités
B. La κ-carraghénase
1. De la κ-carraghénase native à la κ-carraghénase recombinante.
2. Mécanisme de coupure des κ-carraghénases.
3. Mode d’action des κ-carraghénases
4. Site actif de la κ-carraghénase de P. carrageenovora
C. La ι-carraghénase
1. De la ι-carraghénase native à la ι-carraghénase recombinante.
2. Mécanisme de la ι-carraghénase
3. Mode d’action des ι-carraghénases.
4. Site actif de la ι-carraghénase d’A. fortis
Présentation du travail
Chapitre I : Analyse structurale du λ-carraghénane par la λcarraghénase
INTRODUCTION
RESULTATS
I. Production et purification de la λ-carraghénase.
II. Choix du substrat d’étude
III. Propriétés de la λ-carraghénase
A. Mesure de l’activité enzymatique.
B. Evolution du poids moléculaire du λ-carraghénane au cours de l’hydrolyse.
C. Formation des produits limites de l’hydrolyse
D. Purification et caractérisation des produits d’hydrolyse
1. Purification des oligo-λ-carraghénanes
2. Caractérisation des oligo-λ-carraghénanes par spectrométrie de masse
3. Caractérisation des oligo-λ-carraghénanes par RMN.
E. Analyse de la fraction résistante à l’enzyme
F. Etude du mode d’action de l’enzyme
G. Etude du site actif
DISCUSSION
I. Mode d’action de la λ-carraghénase de P. carrageenovora
II. Spécificité du site actif de la λ-carraghénase.
III. Analyse RMN du λ-carraghénane et des oligo-λ-carraghénanes
IV. Structure hybride du λ-carraghénane de G. skottsbergii
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Chapitre II : Analyse structurale des κ/ι-carraghénanes
INTRODUCTION
RESULTATS
I. Analyse 1
H-RMN des κ/ι-carraghénanes
II. Structure hétérogène du κ/ι-carraghénane de G. skottsbergii
III. Caractérisation des oligo-κ/ι-carraghénanes.
A. Purification des oligo-κ/ι-carraghénanes par SEC
B. Caractérisation des oligo-κ/ι-carraghénanes par RMN.
C. Détermination de la séquence des motifs dans les oligosaccharides κ−[κ/ι]−κ et κ−[κ/ι/ι]−κ.
IV. Comparaison des profils d’hydrolyse enzymatique de différents κ/ι-carraghénanes.
V. Caractérisation des fractions résistantes aux carraghénases
DISCUSSION
I. Données sur la spécificité du site actif des carraghénases
A. Spécificité de la κ-carraghénase
B. Spécificité de la ι-carraghénase
II. Proposition de schéma d’organisation des κ/ι-carraghénanes
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Chapitre III : Analyse structurale des κ/µ-carraghénanes
INTRODUCTION
RESULTATS
I. Analyse 1
H-RMN des κ-carraghénanes extraits de K. alvarezii
II. Hydrolyse des κ-carraghénanes transformés et non-transformés par la κ-carraghénase.
III. Caractérisation des oligo-κ/µ-carraghénanes.
A. Purification des oligo-κ/µ−carraghénanes
B. Caractérisation par RMN des oligo-κ/µ-carraghénanes.
C. Caractérisation des oligo-κ/µ-carraghénanes par LC-MS
DISCUSSION
I. Données sur la spécificité du site actif de la κ-carraghénase
II. Les motifs précurseurs mu sont dispersés aléatoirement dans la chaîne de κcarraghénane
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Chapitre IV : Conclusions

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