Analyse moléculaire des altérations chromosomiques et mutations du carcinome urothélial

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Evaluation du risque de récidive ou progression des TVNIM

L’évaluation du risque forme la pierre angulaire des choix thérapeutiques. En s’appuyant sur les données de l’European Organisation for Research and Treatment of Cancer (EORTC), Sylvester et al. ont développé des tables prédictives de récidive et progression (21). Aucune décision thérapeutique n’est actuellement prise à l’aide de marqueurs moléculaires dans la pratique clinique quotidienne, alors qu’il en existe de nombreux. En pratique, la présence d’un haut grade ou d’un bas grade guide la plupart des décisions thérapeutiques pour les tumeurs n’infiltrant pas le muscle (TVNIM).
La méthode standard pour déterminer le risque d’un patient donné consiste à utiliser les facteurs de risque associés à la récidive ou à la progression qui sont issus d’analyses multivariées de cohorte de patients. L’EORTC a proposé un score pronostique pour les tumeurs de vessie en affectant un certain nombre de points en fonction des signes cliniques et de l’analyse anatomopathologique (21). Le calcul peut être fait sur un site internet gratuit (http///www.eortc.be/tools/bladdercalculator/default.htm).
A partir de ces données, les patients sont habituellement classés (Tableau 3), en fonction à la fois de leur risque de récidive et de progression, en risque faible (50%), intermédiaire (35%) ou élevé (15%) et, à chaque groupe, correspond une approche thérapeutique différente.

Suivi des TVNIM

Après résection trans-urétrale éventuellement associée à un traitement adjuvant (immunothérapie ou chimiothérapie endovésicale), l’histoire naturelle des lésions superficielles est marquée par deux risques : la récidive et la progression. Ainsi les tumeurs superficielles de vessie nécessitent une surveillance particulièrement vigilante.
Actuellement, utilisées conjointement, la cystoscopie et la cytologie urinaire sont les deux méthodes dites de référence pour le suivi des tumeurs de vessie, selon les recommandations internationales et française (22, 24). Cette surveillance, essentiellement fondée sur le couple cystoscopie–cytologie, est le plus souvent négative, imposant une morbidité inutile au patient. D’une part, la cystoscopie est dépendante du chirurgien qui la pratique et possède quelques limites techniques et d’interprétation (mauvaise vision liée à une hypertrophie bénigne de prostate ou à un saignement, carcinome in situ difficile à diagnostiquer car difficile à visualiser). D’autre part, si la cystoscopie est un examen performant, il est invasif, parfois mal toléré, peut être source de complications (sténoses de l’urètre ou infections urinaires après cystoscopie évaluées à 4%) (26, 27), et possède un coût propre. Or, chaque patient subit 4 à 8 cystoscopies dans les 2 ans qui suivent la résection d’une tumeur urothéliale superficielle.
Le cytodiagnostic urinaire est un complément utile à la cystoscopie mais sa sensibilité pour les tumeurs de faible grade est médiocre et dépendante de l’anatomopathologiste effectuant l’examen (28). En effet, même si la cytologie des urines est un examen très spécifique (niveau de preuve III-2) (29-32), sa sensibilité est très variable, de 35 à 45 %, et son interprétation est clairement dépendante de l’expérience du cytologiste pour en déjouer les pièges : atypies réactionnelles, viroses, atypies post thérapeutiques (29, 30, 32-34).
Si la cytologie urinaire est très spécifique et peu onéreuse, sa sensibilité est médiocre, en particulier, pour les tumeurs de bas grade où elle est le plus souvent négative, avec une sensibilité de l’ordre de 4-29%. Dans les tumeurs de haut grade, la cytologie a une sensibilité plus acceptable de 69-92%, mais n’en fait pas un bon test de surveillance (35, 36).

Traitement et suivi des TVIM

La tomodensitométrie (TDM) et l’imagerie par résonance magnétique peuvent être utilisées pour la stadification des TV, bien que la TDM soit préférée pour l’évaluation d’une extension pulmonaire. La cystectomie radicale ouverte avec une dissection étendue des ganglions lymphatiques (LND) reste le traitement de choix pour les échecs thérapeutiques dans les TVNIM et T2-T4aN0M0. Cependant, pour les patients bien informés, bien choisis et conformes, un traitement multimodal peut être proposé comme alternative, surtout si la cystectomie n’est pas une option. Le critère de comorbidité, et non celui de l’âge, doit être utilisée pour décider de la cystectomie radicale. Les patients doivent être encouragés à participer activement au processus de prise de décision, et un détournement urinaire du continent devrait être offert à tous les patients, à moins qu’il n’y ait des contre-indications spécifiques. Pour les patients en bonne santé, la chimiothérapie néoadjuvante à base de cisplatine doit toujours être discutée car elle améliore la survie globale. Pour les patients atteints d’une maladie métastatique, une chimiothérapie combinée contenant du cisplatine est recommandée. Pour les patients inaptes, une chimiothérapie combinée au carboplatine ou des agents uniques peuvent être utilisés (25, 37).

Tumeurs urothéliales de la voie excrétrice supérieure (TVES)

Les tumeurs urothéliales de la voie excrétrice supérieure (TVES) sont rares et ne représentent que 5 à 10% des carcinomes urothéliaux (38), avec une incidence annuelle estimée dans les pays occidentaux de ~ 2 cas par 100 000 habitants. Les tumeurs pyélocalicyelles sont environ deux fois plus fréquentes que les tumeurs urétérales. Dans 17% des cas, un cancer de la vessie concomitant est présent (39). La récidive dans la vessie se produit dans 22-47% des patients TVES (40), comparativement à 2-6% dans le tractus supérieur controlatéral (41). Soixante pour cent des TVES sont invasives au diagnostic, contre 15 à 25% des tumeurs de la vessie (42). Les TVES ont un pic d’incidence chez les personnes âgées de 70 à 90 ans et sont trois fois plus fréquentes chez les hommes.
Jusqu’en 2004, le classement de 1973 de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) était le plus souvent utilisé, distingue seulement trois grades (G1-G3) (43). La récente classification OMS de 2004 considère des données histologiques permettant de distinguer les tumeurs non invasives: néoplasie papillaire urothéliale à faible potentiel de malignité, carcinomes de bas grade ou de haut grade.
Les TVES qui envahissent la paroi musculaire ont généralement un mauvais pronostic.
Le taux de survie à 5 ans est <50% pour pT2 / pT3 et <10% pour pT4 (44).
La prise en charge conservatrice du TVES peut être discutée dans les cas à faible risque lorsque le rein controlatéral est fonctionnel. La chirurgie conservatrice rénale pour TVES à faible risque permet d’épargner la morbidité associée à la chirurgie radicale ouverte, sans compromettre les résultats oncologiques et la fonction rénale (45). En outre, il peut également être considéré dans tous les cas impératifs (c’est-à-dire, insuffisance rénale ou rein fonctionnel solitaire). Cette prise en charge se réalise par urétéroscopie souple et vaporisation des lésions à l’aide d’un laser, ou peut être réalisée par résection segmentaire de l’uretère.
La néphro-urétérectomie radicale par voie ouverte avec excision de la coiffe vésicale est la norme pour les TVES à haut risque, indépendamment de l’emplacement de la tumeur. Une alternative est la néphro-urétérectomie par voie coelioscopique (46).
Le suivi des traitements conservateurs est rapproché et se réalise par nouvelle urétéroscopie tous les 3 à 6 mois et bilan radiologique par uro-scanner ou uro-IRM. Le suivi après traitement radical comporte un suivi radiologique par uro-scanner ou uro-IRM annuel. Dans tous les cas, un suivi de la fonction rénale et un suivi endoscopique .

Nouvelle taxonomie des cancers urothéliaux : sous-types basal et luminal

Les cancers urothéliaux de la vessie sont hétérogènes du point de vue moléculaire et, pour ce qui concernent les stades avancés (pT2 et supérieur) ont des résultats cliniques et des réponses à la chimiothérapie conventionnelle très variables. Quatre profils taxonomiques ont été établis, ces dernières années, par différents groupes d’étude : University of Northern California, University of Texas MD Anderson Cancer Center, The Cancer Genome Atlas (TCGA), et Lund University (Figure 3).
Pour obtenir ces taxonomies, les équipes ont comparé les profils des séquences génomiques obtenus par séquençage tout exome ou tout génome de nouvelle génération, les altérations chromosomiques de type copy number variation (CNV), les taux d’expression des ARNm, des micro-ARN et protéiques. Des groupements différents sur le plan de la nomenclature et différents sous-groupes ont été établis. Il existe toutefois une constante, c’est-à-dire la subdivision des tumeurs de vessie en type luminal et basal, qui rappelle précisément la subdivision identifiée pour le cancer du sein.
Les TVIM de type basal partagent des biomarqueurs avec les cancers du sein basaux, sont caractérisés par l’activation de p63, une différenciation squameuse et une maladie plus agressive à la présentation. Les TVIM de subtype luminal contiennent des caractéristiques de la transcription active des récepteurs PPARγ et des récepteurs des estrogènes (ER), sont enrichies en mutations activatrices du gène FGFR3, et ont potentiellement une sensibilité aux inhibiteurs de FGFR. La nomenclature établie par le MD Anderson Cancer Center comporte un troisième sous-type : les TVIM de type p53 qui sont constamment résistants à la chimiothérapie néoadjuvante MVAC, et dont toutes les tumeurs chimiorésistantes adoptent un phénotype de type p53 après le traitement (48).
Ces deux groupes présentent cliniquement une différence significative en termes d’agressivité et de réponse au traitement chimiothérapique (49, 50). Les cancers infiltrants la musculeuse (TVIM) montrent une agressivité plus marquée et une survie plus courte s’ils sont de type luminal (48). Le type basal, à l’inverse, est associé à une meilleure réponse à la chimiothérapie par cisplatine et semble montrer une meilleure réponse à la chimiothérapie néoadjuvante (49).
Une toute nouvelle classification moléculaire des carcinomes urothéliaux vient d’être établie et publiée par le groupe du TCGA (The Cancer Genome Atlas). En effet, en 2014, dans le cadre de ce vaste projet, les résultats de l’analyse moléculaire de 131 tumeurs urothéliales envahissant la musculeuse TVIM ont été publiés permettant d’identifier 4 sous-groupes (Figure 3) (51). En Octobre 2017, une nouvelle version de classification, établie à partir de l’analyse de 412 TVIM, a permis d’identifier finalement 5 sous-groupes : 3 de type luminal, 1 basal et 1 neuronal (Figure 4) (52). Ces sous-groupes respectent la distinction luminal/basal, sont caractérisés par des altérations moléculaires et histologiques spécifiques et pourraient bénéficier d’approches thérapeutiques distinctes (Figure 4).

Mutations géniques somatiques

Deux voies majeures existent dans la cancérogenèse vésicale : l’une pour les tumeurs infiltrantes ou de haut grade caractérisée par l’altération du gène suppresseur de tumeur TP53 et l’autre pour les tumeurs non infiltrantes ou de bas grade impliquant des mutations du gène FGFR3 (53-56). Ainsi, les mutations de TP53 se produisent à la première étape de la voie du CIS, alors qu’elles se feraient beaucoup plus tard dans la voie Ta, ou T1G3 ou pour les TVIM.

TP53

Le gène codant la protéine p53 est localisé sur le chromosome 17, de même que les gènes BRCA1 et 2.
Ce gène TP53 code pour une phosphoprotéine nucléaire de masse moléculaire 53 KDa. La protéine p53 de type sauvage est présente dans une grande variété de cellules normales, mais la protéine a une demi-vie très courte et n’est donc présente qu’en petite quantité, généralement en dessous du niveau de détection des méthodes immunohistochimiques. La mutation somatique du gène TP53 est un événement très fréquent dans le développement des cancers humains, et parce que, les protéines p53 mutantes sont souvent beaucoup plus stables que la protéine p53 de type sauvage, la protéine p53 mutante s’accumule à un niveau élevé. A titre d’exemple, l’accumulation de la protéine p53 a été observée dans 76% des 212 lésions malignes humaines, y compris dans le carcinome à cellules transitionnelles de la vessie (57).
La protéine p53 de type sauvage fonctionne comme un facteur de transcription, c’est-à-dire comme un modulateur qui peut activer ou désactiver des gènes cruciaux. Il inhibe également la réplication de l’ADN et est une molécule de contrôle de la progression du cycle cellulaire. En outre, la protéine p53 est impliquée dans la régulation de l’apopotose. Dans les tests de transfection, le gène TP53 de type sauvage se comporte comme un suppresseur de tumeur, tandis que celui muté se comporte comme un oncogène transformant dominant (58).
Ce gène a été rapporté comme inactivé dans 76% des TVIM (56).

FGFR3

Le gène FGFR3 est localisé sur le bras court du chromosome 4, et comprend 19 exons. Il appartient à une famille de récepteurs à tyrosine kinase (comprenant également FGFR1 et 2). L’épissage alternatif de l’Acide Ribonucléique messager (ARNm) correspondant génère différentes isoformes (FGFR3b et FGFR3c), dont l’expression varie selon les tissus. Ils sont impliqués dans la voie de signalisation régulant la prolifération cellulaire, la différentiation, la migration cellulaire et l’angiogenèse. Ces récepteurs sont des glycoprotéines composées de trois domaines extracellulaires « immunoglobulin-like », d’un domaine hydrophobe permettant son ancrage dans la membrane cellulaire et d’un domaine tyrosine kinase intra cytoplasmique (59). Les domaines extracellulaires interagissent avec les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF). La fixation de ces derniers sur les domaines extracellulaires induit la dimérisation de FGFR3 puis l’autophosphorylation de son domaine tyrosine kinase qui sera ainsi activé (59).
Selon l’étude de Neuzillet et al. (54), il existe deux voies différentes de la progression tumorale dans le cancer de la vessie : la voie du CIS, dans laquelle les mutations de FGFR3 sont rares, et la voie Ta, dans lequel les mutations de FGFR3 sont fréquentes (Figure 5).
Les mutations de FGFR3 représentent la première anomalie moléculaire spécifique de la voie des tumeurs Ta de faible grade. Les tumeurs porteuses d’une mutation FGFR3 récidivent fréquemment, mais progressent très rarement vers des tumeurs invasives (53-56, 59, 60). Une mutation du gène FGFR3 était retrouvée selon les études dans 60 à 70% des tumeurs de vessie superficielles (Ta, T1) et/ou peu agressives (G1, G2) (61, 62). Dix mutations de FGFR3 différentes ont été décrites, mais 4 d’entre elles (R248C, S249C, G372C, et Y375C) peuvent expliquer 95% des cas (63). La recherche des mutations du gène FGFR3 était initialement réalisée par un séquençage du gène. Depuis, Van Oers et al. (2005) ont décrit la technique du SNaPshot, méthode simple, permettant de rechercher les mutations ponctuelles les plus fréquentes de ce gène, situées sur les exons 7, 10 et 15 (Hotspot de mutations) (64).

STAG2

STAG2 est un gène, localisé en Xq25, impliqué dans le processus de la cohésion et de la ségrégation des chromatides sœurs (65).
La protéine codée par ce gène est une sous-unité du complexe cohésine, qui régule la séparation des chromatides sœurs pendant la division cellulaire. L’inactivation ciblée de ce gène conduit à des défauts de cohésion des chromatides et à l’aneuploïdie, ce qui suggère que la perturbation génétique du complexe cohésine est une cause de l’aneuploïdie dans le cancer humain.
Le complexe cohésine est une structure multi-protéine qui est requise pour la cohésion des chromatides sœurs après la réplication de l’ADN et peut être impliquée dans l’assemblage du fuseau mitotique. Il existent plusieurs variantes de ce complexe, toutes composées d’un hétérodimère constitué d’une des isoformes a ou b de SMC1(Structural Maintenance of Chromosomes), et de SMC3, d’une protéine de liaison appelée RAD21 et d’une protéine de liaison supplémentaire. Selon le complexe, la protéine supplémentaire peut être SA-1, SA-2 ou SA-3 (Figure 6). La protéine SA-2, également connue sous le nom de STAG2, comporte 1231 acides aminés et interagit directement avec RAD21. Localisée dans le noyau, STAG2 s’associe à la chromatine et, après phosphorylation, se dissocie de la chromatine pour permettre la formation correcte des chromosomes pendant l’anaphase. STAG2 est capable d’améliorer l’activité du facteur de nécrose tumorale TNF alpha et peut également jouer le rôle de régulateur transcriptionnel (66, 67).
De fréquentes altérations du gène STAG2 (mutations, délétions et hyperméthylation du promoteur de ce gène) ont été observées dans des tumeurs de vessie, notamment de mauvais pronostic (68, 69).

Profil mutationnel global des tumeurs de vessie selon le TCGA

L’analyse de séquençage tout exome de 412 tumeurs réalisée par le TCGA a permis de différencier 4 clusters de tumeurs selon leur profil de mutations qui se distinguent principalement par la présence ou la fréquence de signatures mutationnelles de type APOBEC-a, APOBEC-c, ERCC2 ou transition C>T (Figure 4) (52). Pour tous les clusters, la mutation du gène codant pour la protéine p53 reste la plus fréquente et est retrouvée dans 49% de l’ensemble des tumeurs (56).

Altérations chromosomiques du carcinome urothélial selon les données du TCGA

De la même façon, l’analyse en CGH (Comparative Genomic Hybridization) sur puce ADN de ces 412 tumeurs a permis d’identifier les altérations chromosomiques retrouvées le plus fréquemment dans l’ensemble des tumeurs urothéliales (Figure 5) et dans chacun des 4 clusters au profil mutationnel différent (Figure 6).

Analyse moléculaire des altérations chromosomiques et mutations du carcinome urothélial

Les tumeurs superficielles de la vessie avec des grades élevés ou des stades pT1 nécessitent une surveillance active, étroite, en raison de leur risque significatif de récidive et de progression vers un stade invasif. A partir des résultats obtenus à l’aide de marqueurs d’ADN, il a été reconnu que les mutations du gène FGFR3 étaient plus associées au TVNIM de bas grade et pTa, alors que la présence de nombreuses altérations chromosomiques (CNV) étaient associées à des tumeurs génétiquement instables, de stade élevé ou pT1 / pTis.
Dans l’absolu, un test urinaire très spécifique, très sensible et peu onéreux (10 euros environ) pourrait idéalement se substituer au couple cystoscopie et cytologie des urines (60 euros environ). Ce test pourrait être basé sur des altérations génétiques identifiées dans les tumeurs de vessie. Des tests urinaires ont été développés, basés sur les anomalies découvertes au niveau des tumeurs, mais ces tests commercialisés (BTA Trak, NMP 22, Accu-Dx, uCyt+, Urovysion), à l’heure actuelle, ne sont pas utilisés en pratique clinique de routine.
Une caractéristique commune à de nombreuses tumeurs est de présenter des anomalies chromosomiques (déséquilibres alléliques) qui peuvent être révélées par l’étude de marqueurs polymorphes de l’ADN. Cette particularité du génome tumoral a été mise à profit dans les tumeurs de vessie pour détecter des cellules tumorales en étudiant l’ADN extrait des urines de patients à l’aide de marqueurs microsatellites (71). Depuis, plusieurs équipes ont rapporté des résultats utilisant cette technique pour le diagnostic (72, 73) ou le suivi de ces tumeurs (65). Il apparaît donc dès maintenant que l’examen de l’ADN urinaire présente un intérêt majeur pour le suivi des patients au décours d’une résection trans-urétrale d’un carcinome superficiel de la vessie. La sensibilité et la spécificité de ce test apparaissent meilleures que celles de la cystoscopie urinaire et du BTA TRAK test (74, 75).
L’objectif est de dépister une lésion urothéliale asymptomatique dans une population cible d’une part, et de simplifier les modalités de surveillance des patients porteurs de tumeurs de vessie déjà connues et traités en réduisant les indications de l’endoscopie d’autre part (28, 65, 71, 76, 77). Il serait donc souhaitable de pouvoir détecter un cancer urothélial à partir des urines d’un patient avec une grande sensibilité, puis éventuellement d’apporter des informations complémentaires sur la nature du cancer et son agressivité. L’identification de lésions cytogénétiques au sein d’un urothélium optiquement normal, après exérèse de la tumeur primitive pourrait être un critère intéressant de sélection des patients qui pourraient bénéficier d’instillations vésicales.
Une puce intitulée BCA-1 a été développée, dans cette optique, par notre équipe en collaboration avec la société ArrayGenomics (Voisins Le Bretonneux, France). Les anomalies les plus pertinentes ont été sélectionnées et une puce à ADN d’hybridation génomique comparative (CGH) a été développée comprenant 341 clones (BACs ou chromosomes artificiels bactériens) répartis sur des régions chromosomiques d’intérêt (78, 79). La validité de ce test a été confirmée sur 10 lignées cellulaires tumorales et bénignes. Un travail a ensuite consisté à étudier la valeur ajoutée de cette puce en pratique clinique. Pour ce faire, une cohorte de 163 patients porteurs de tumeurs urothéliales et de témoins a été constituée. Les urines ont été prélevées et analysées en utilisant la puce BCA-1. Une base de données a été développée sous Filemaker pro® afin de permettre une saisie uniforme et détaillée des données cliniques et de prendre en considération le caractère complexe de la prise en charge de ces tumeurs. Le test urinaire utilisant la puce CGH a montré une excellente performance diagnostique avec une sensibilité de 95% et une spécificité de 86% dans les tumeurs vésicales. Enfin, le test a aussi permis d’identifier un panel d’aberrations génomiques permettant d’identifier le grade de la tumeur avec une sensibilité et une spécificité de 86 et 88%, respectivement (79).
Suite à cette étude, une nouvelle puce a été créée. En effet la première puce BCA-1 était constituée de BACs. Cette nouvelle puce couvre les mêmes régions chromosomiques mais elle n’est plus constituée de BACs, mais d’oligonucléotides (60000 sondes de 50-60 paires de bases). Il suffit donc d’extraire entre 150 et 500 ng d’ADN par urine pour pouvoir utiliser cette puce, alors que l’ancienne puce nécessitait de 2-4 µg d’ADN. Grâce à une technique de co-hybridation d’un ADN à tester et d’un ADN témoin marqués par deux fluorochromes différents, il est mis en évidence la perte ou le gain d’ADN (78).
De même, cette puce pourrait éventuellement être utilisée après la résection initiale pour l’identification des patients nécessitant une résection de « second look », pour moduler la surveillance, et pour identifier les patients les plus à risque de progression.
Dans notre étude, nous avons recherché, d’une part, si des altérations chromosomiques étaient spécifiquement associés à des stades tumoraux à partir d’ADN extrait de tissus congelés, d’autre part, évalué la valeur prédictive des mutations du gène FGFR3 et du test BCA-oligo à partir d’ADN extrait d’urines.

Analyse moléculaire des altérations chromosomiques par puce CGH BCA-Oligo sur tissu tumoral congelé

Patients et Méthodes

A partir de la base de la tumorothèque, nous avons sélectionné rétrospectivement 54 tumeurs solides de patients présentant un carcinome urothélial de la vessie ou du haut appareil, opéré par résection transurétrale, cystectomie ou néphrectomie. Chaque patient a eu une fiche d’information et de consentement à compléter, dater et signer, qui a été archivée au sein du CeRePP.
Nous avons recueilli 16 carcinomes urothéliaux pTa, 20 pT1 et 18 pT2, dont 6 pTa, 6 pT1 et 5 pT2 étaient des tumeurs de la voie excrétrice supérieure (tumeur du haut appareil).

Extraction d’ADN à partir de tissus congelés

Environ 10 mg de tissus congelés étaient placés dans un tube eppendorf. L’extraction de l’ADN a été réalisée au moyen du kit QIAamp DNA Mini kit (Qiagen). Le protocole d’extraction comporte plusieurs étapes :
– Lyse cellulaire : 200µl PBS, 20µl de protéase (pour la digestion des protéines) et 200µl de tampon de lyse sont ajoutés au fragment de tissu. Le mélange est laissé au moins une nuit et jusqu’à la lyse complète à 56 °C au bain marie sous agitation.
– Précipitation et fixation de l’ADN : 200µl d’éthanol (100%) sont ajoutés pour faire précipiter l’ADN puis l’ensemble est mélangé au vortex 15s. Après une courte centrifugation, le mélange contenant l’ADN est transféré sur la colonne d’extraction. La colonne est centrifugée à 8000 rpm pendant 1 min pour fixation de l’ADN.
– Lavage : Après élimination de l’éluat, 500µl d’AW1 sont ajoutés, et la colonne est centrifugée de nouveau à 8000 rpm pendant 1 min. De nouveau, on élimine l’éluat et 500µl d’AW2 sont ajoutés. La colonne est ensuite centrifugée à 14 000 rpm pendant 3 min et l’éluât est éliminé.
– Elution de l’ADN : 100µl de tampon AE sont ajoutés à la colonne, puis après 5 min à température ambiante, elle est centrifugée à 8000 rpm pendant 1min. Ce dernier éluât contient l’ADN tissulaire décroché.

Test BCA-oligo

Avant de réaliser le test BCA-oligo, la quantité et la qualité de l’ADN étaient vérifiées. D’une part, l’ADN était quantifié par fluorimètre, en utilisant le système Qbit (Life Technologies Invitrogen) pour vérifier que les 200 ng nécessaires pour réaliser le test étaient disponibles. D’autre part, 1 µL d’ADN était déposé sur un NanoDrop pour vérifier que le profil obtenu était correct. Seuls les échantillons de quantité et qualité suffisantes pouvaient être utilisés pour l’analyse avec la puce ADN. L’étape suivante consistait en un marquage des ADNs testé et de référence qui allaient être hybridés ensemble sur la puce CGH. Le marquage était réalisé à l’aide du kit BioPrime (Life Technologies Invitrogen), selon les recommandations du fournisseur, l’ADN testé était marqué en Cy5 et l’ADN de référence était marqué en Cy3. Suivaient alors deux purifications, la première sur colonne avec le kit Nucleospin Extract II (Macherey-Nagel), la deuxième sur une colonne Purelink® (Life Technologies).
L’ADN testé et l’ADN de référence étaient mélangés, puis on ajoutait de l’ADN répété COT-1 (1 mg/ml), pour bloquer les hybridations non spécifiques, du Agilent 10X Blocking Agent et du tampon d’hybridation (Agilent 2X Hybridation Buffer). Ce mélange était ensuite incubé 3 minutes à 95°C, puis 30 minutes à 37°C. Le mélange était déposé entre lame et lamelle sur la puce BAC-oligo pour une hybridation de 16 heures à 65°C. La puce était ensuite lavée avec une solution de lavage (Wash Buffer, Agilent), puis séchée.
Les puces étaient scannées au laser à 532 et 635 nm en utilisant un Hi-scanner Agilent. Les images numérisées étaient analysées en utilisant le logiciel WorkBench (Agilent) et l’affichage graphique des données était générée à l’aide de ce même logiciel. La médiane log2 valeur normalisée de fluorescence était calculée pour chaque sonde. Une sonde était considérée comme délétée ou amplifiée si son ratio moyen Log2 normalisé était inférieur ou supérieur à -0,2 ou 0,2, respectivement. Un fragment chromosomique était considéré comme amplifié ou délété pour l’analyse si au moins 6 sondes successives étaient interprétées comme gagnées ou perdues sur ce fragment.

Analyse moléculaire des altérations chromosomiques par puce CGH BCA-oligo et des mutations du gène FGFR3 à partir d’ADN urinaire de patients présentant un carcinome urothélial

Matériels et méthodes

Une cohorte de 50 patients ayant une tumeur de la vessie a été incluse dans cette étude. Les critères d’inclusion étaient d’abord une indication de résection endoscopique de la vessie dans le contexte de la surveillance ou d’une récidive de tumeur de la vessie non envahissant TVNIM (<3 cm); deuxièmement, une cytologie négative ou non informative; troisièmement, aucun signe de tumeurs du tractus urinaire supérieur (UUT-TCC) en tomodensitométrie. Tous les patients ont donné leur consentement éclairé. Les données cliniques recueillies comprenaient l’âge, le sexe, l’âge au diagnostic, l’historique des tumeurs du haut appareil urinaire, le statut de fumeur (actif, ancien ou non-fumeur). Les données anatomo-pathologiques suivantes sur la tumeur de la vessie ont également été recueillies: le stade et le grade, et le statut mutationnel du gène FGFR3 pour les mutations S249C; Y375C; G372C.

Protocole de collection et analyse des urines

Les patients inclus dans l’étude, ont signé un consentement de participation au protocole 2011/24 NICB (Comité de Protection des Personnes Ile de France IV, Institutional Review Board 00003835). Des échantillons d’urine (50 ml) ont été prélevés avant chaque intervention. Après centrifugation de l’urine, le kit QIAmp DNA Blood Mini (Qiagen) a été utilisé pour extraire l’ADN urinaire du culot obtenu, en respectant les recommandations du fournisseur. Après validation de la quantité et de la qualité de l’ADN extrait, il a été marqué puis hybridé sur la puce BCA-oligo. Brièvement, le kit BioPrime (Life Technologies Invitrogen) a été utilisé conformément aux recommandations du fournisseur pour marquer l’ADN testé (avec Cyanine 5) et l’ADN de référence (avec Cyanine 3). Après une double purification, la première avec le kit Nucleospin Extract II (Macherey-Nagel) et la seconde avec le kit Purelink® (Life Technologies), les deux ADN ont été mélangés en quantité égale. Le mélange a ensuite été incubé pendant 3 minutes à 97 °C, puis 30 minutes à 37 °C en présence d’ADN répété Cot-1 (1 mg/ml), du tampon d’hybridation Agilent 2X (Agilent Technologies) et de l’agent de blocage Agilent 10X (Agilent Technologies). Le mélange a ensuite été placé sur la puce BCA-Oligo pour hybridation pendant 16 heures à 65 °C. Après lavage avec la solution de lavage Wash Buffer (Agilent Technologies), la puce a été scannée en utilisant le scanner haute résolution Agilent (Agilent Technologies). Le logiciel WorkBench (Agilent Technologies) a été utilisé pour analyser les résultats.
Pour interpréter le résultat du test BCA-oligo, la valeur médiane de fluorescence Log2 normalisée a été calculée pour chaque oligonucléotide. Un oligonucléotide a été considéré comme délété ou amplifié si son rapport Log2 moyen normalisé était inférieur ou supérieur à -0,2 ou 0,2 respectivement. Une région chromosomique était considérée comme amplifiée ou délétée si au moins 6 oligonucléotides successifs de la région étaient interprétés comme étant gagnés ou perdus.

Résultats

Les caractéristiques de la population étudiée et les résultats individuels sont présentés dans l’article placé en Annexe 1. La distribution et la typologie (Gain, perte, Gain+Perte) des altérations chromosomiques mises en évidence par l’analyse avec la puce BCA-oligo des 50 ADNs urinaires de patients présentent un carcinome urothélial sont présentées dans la Figure 14. La cartographie des relations entre facteurs cliniques, pathologiques et moléculaires est représentée en Figure 15. Les corrélations significatives sont celles entre l’âge et les habitudes tabagiques (Pearson R: -0,7, p = <0,001), entre un haut grade et un stade tumoral pT1 (Pearson R: 0,7; p <0,001); un stade pT1 et la présence de CNV (Pearson R: 0,5; p = 0,002). A l’inverse, aucune association n’a été observée entre la présence de mutation FGFR3 et un stade tumoral pT1 ou un haut grade Figure 14. L’association entre chaque altération chromosomique cible et l’existence d’un haut grade tumoral est représentée sur la Figure 16. Les marqueurs les plus associés à la présence d’un haut grade tumoral (importance relative> 0,3) étaient les gains en 8q et 11q, ainsi que les délétions en 9q. A partir de cette cartographie, la valeur prédictive du modèle Bayésien donne respectivement une AUC de 0,92 et 0,93 pour le haut grade et le stade tumoral pT1.

Marqueur de proliferation : Ki67/MIB1

L’antigène Ki67 fut décrit par Gerdes en 1983 après immunisation de souris par injection de noyaux de cellules de lymphome provenant d’un lymphome de Hodgkin (clone 67, étude réalisée dans la ville de Kiel) (87). Ki67 est un marqueur de la prolifération, qui semble être fortement associé à la récidive et au grade histologique des cancers de vessie.
Cet antigène code pour une protéine nucléaire de 360 kDa. Il est présent au niveau du noyau des cellules prolifératives, en phase G1, S, G2 et M, mais absent dans les cellules au repos (phase G0). Sa fonction précise n’est pas connue. Une participation au maintien du pouvoir prolifératif ou au contrôle du cycle cellulaire est suggérée.
L’antigène Ki67 est détecté par l’anticorps Ki67 en immunohistochimie et immunofluorescence. En pratique, l’index de marquage par le Ki67 représente le pourcentage de noyaux colorés par l’anticorps Ki67.
Wang et al ont montré que l’expression de Ki67 était corrélée au grade et au stade des tumeurs de vessie (88). L’expression de Ki67 est corrélée dans les TVNIM avec le nombre de tumeurs, le grade, le stade, et la taille de la tumeur. Cette équipe a également suggéré que l’expression de TP53 et Ki67 pourrait être utilisée pour prédire le risque de récurrence post-opératoire dans les TVNIM (89). De même, Enache et al ont montré qu’il y avait une forte corrélation entre l’indice de prolifération Ki67, le stade de la tumeur et son grade (90). Ki67 a été fortement associé à la récidive et au grade histologique (91).

Marqueur lié à la stabilité de l’ADN: P53, STAG2, AURORA

P53

Le gène TP53, situé sur le bras court du chromosome 17, code pour une phosphoprotéine nucléaire de 393 acides aminés (53 kilodaltons). Cette protéine est un facteur de transcription qui se fixe de manière spécifique sur les régions régulatrices de gènes dont elle contrôle l’expression. Elle est impliquée dans la régulation du cycle cellulaire, la différentiation, l’apoptose, et permet le maintien de l’intégrité du génome (92). L’homme dispose d’un seul gène p53 fonctionnel. Pour être active, la protéine p53 doit agir sous forme de tétramère de sous-unités identiques. Chaque sous-unité est constituée d’un domaine N-terminal d’activation transcriptionnelle, d’un domaine central de liaison à l’ADN, d’un domaine d’oligomérisation et d’un domaine basique C-terminal de localisation nucléaire. Dans les cellules au repos, la protéine p53 est sous forme « latente ». Elle est relativement instable, en faible concentration et adopte une conformation qui l’empêche de se lier avec une haute affinité aux séquences d’ADN consensus localisées dans les régions régulatrices des gènes cibles. La protéine p53 est stabilisée et activée en réponse à de nombreux stress moléculaires parmi lesquels on peut noter des lésions de l’ADN, l’hypoxie, des infections virales ou l’activation d’oncogènes. Elle subit de nombreuses modifications post-traductionnelles qui vont permettre d’activer sa fonction de facteur de transcription. L’ensemble de ce programme peut avoir deux effets exclusifs sur les cellules :
1/ l’arrêt transitoire du cycle cellulaire au niveau des phases G1 ou G2 (93), et la réparation de l’ADN (94).
2/ l’apoptose si les dommages que la cellule a subi ne peuvent pas être réparés. L’apoptose empêche la prolifération de cellules génétiquement altérées prédisposées au cancer et ceci par deux voies distinctes : intrinsèque ou mitochondriale, et extrinsèque par l’intermédiaire des récepteurs de mort (95).
Le gène suppresseur de tumeur p53 muté semble être un facteur prédictif indépendant de progression du cancer de la vessie et, est associé à une diminution de la survie après cystectomie. L’importance de la mutation du gène p53 dans les cellules tumorales est indéniable (92). La protéine p53 de type sauvage médie les fonctions impératives telles que la régulation du cycle cellulaire et la mort cellulaire programmée. Une carence de la fonction de p53 par mutation ou l’inactivation abroge les points de contrôle et l’apoptose du cycle cellulaire normal, générant un milieu favorable pour l’instabilité génomique et la carcinogenèse. Une multitude d’études rétrospectives ont associé des mutations de p53 à des résultats défavorables dans les tumeurs de vessie. Dans le cancer de la vessie, une mutation de p53 est retrouvée dans 50 à 60% des tumeurs infiltrantes et à haut risque de malignité, c’est-à-dire les tumeurs classées pT2, certaines pT1 et les tumeurs de haut grade présentant un CIS associé. Pour certains auteurs, les mutations de p53 seraient responsables d’une augmentation du taux de récidive tumorale et d’une augmentation du risque d’infiltration du muscle vésical (96).
Les tumeurs qui sont mutées pour p53 ont une protéine plus stable, et on considère qu’il y a donc surexpression de p53 (ou expression positive) (54). Le taux d’expression de p53 est corrélé avec la progression et le grade histologique (91).

STAG2

Plusieurs études (68, 97, 98) ont montré que la perte de fonction STAG2 joue un rôle plus important dans les TVNIM que dans les TVIM. Une mutation inactivatrice de ce gène semble associée aux faibles stades (p=0.001) et aux bas grades (p=0.002). L’expression de la protéine STAG2 est absente, en immunohistochimie, dans la plupart des cas de mutations inactivatrices.

AURORA Kinase A

Le gène codant pour la protéine Aurora Kinase A, AURKA, est localisé en 20q13.2. AURORA, également connue sous le nom de sérine / thréonine-protéine kinase 6, est une enzyme membre d’une famille de sérine / thréonine kinases mitotiques. Elle est impliquée dans des processus importants au cours de la mitose et de la méiose, dont le bon fonctionnement est fondamentale pour la prolifération d’une cellule normale. Aurora A est activée par une ou plusieurs phosphorylations, et son pic d’activité se réalise au cours de la transition de la phase G2 à la phase M du cycle cellulaire.
La sur-expression de AURKA est associée à une aneuploïdie et à un profil basal avec un pronostic moins favorable (99).

Typologie luminale-basale : CK5/6, CK14, P63, FOXA1, GATA3

P63

Le gène TP63, situé en 3q27-28, code pour la protéine tumorale p63 qui est un membre de la famille p53. Il joue un rôle clé dans la régulation de la différenciation et de la prolifération de cellules épithéliales, plutôt que dans la suppression des tumeurs. Les stades avancés du carcinome de la vessie sont associés à des altérations et à la perte de l’expression de p63 (100, 101).
La protéine P63 agit en tant qu’activateur ou répresseur transcriptionnel en se liant de façon spécifique à l’ADN d’une séquence d’intérêt. Le gène TP63 encode différentes isoformes. Ces isoformes contiennent un ensemble variable de domaines inhibant l’activation transcriptionnelle et la régulation de cette activation transcriptionnelle, conférant ainsi une activité spécifique à chaque isoforme. Elle peut être requise conjointement avec TP73/p73 pour l’initiation de l’apoptose p53/TP53-dépendante en réponse à des agressions génotoxiques et la présence d’oncogènes activés.
L’étude de l’expression de p63 a permis de montrer une immunoréactivité nucléaire dans l’urothélium non néoplasique, à l’exception des cellules parapluies (100). P63 est régulée dans la carcinogenèse de la vessie et l’expression de p63 est perdue dans la plupart des cancers invasifs alors que les tumeurs papillaires superficielles en maintiennent l’expression (102).

Cytokératine 5/6 et cytokératine 14 : typologie basale

Radvanyi et al (103) ont montré qu’il existait un nouveau sous type de tumeur vésicale, les tumeurs « basal like ». « Basal » désigne les cellules présentes dans certains épithéliomas stratifiés et qui expriment les cytokératines 14,17 et 5. Les tumeurs « basal like » dans la vessie ont un profil d’expression génique qui s’est révélé très proche de celui d’un type particulier de tumeurs agressives du sein également dites « basal like » (qui ont une activation permanente de la voie EGFR). Ces tumeurs sont moins différenciées et plus agressives. L’expression de la cytokératine 5/6 (ou KRT5/6) a été utilisée pour distinguer, dans le cancer du sein, deux sous-types distincts, à savoir, un type uniforme positif («de base») et un type partiellement positif (“basoluminal”) à bon pronostique. L’utilisation de cet anticorps dans le cancer de la vessie pourrait permettre de distinguer les tumeurs « basal like » qui sont très agressives (48, 104). La Cytokératine 14 (ou KRT14) peut être considerée comme un marqueur de type basal (105).

FOXA1: typologie luminale

Le gène FOXA1 est situé sur le bras long du chromosome 14 (en 14q21.1) et code pour la protéine Forkhead Box Protein A1, qui est un activateur transcriptionnel de l’ADN (106). Ce facteur est impliqué dans la coactivation du récepteur des androgènes, et a montré un rôle dans l’expression de ce récepteur dans le cancer du sein et de la prostate (106-108).
FOXA1 est considéré comme un marqueur de tumeur de vessie de type luminal, comme GATA3 (105, 109). Les cellules urothéliales normales présentent une forte expression de FOXA1 (109).

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Table des matières

Sommaire
I. Préambule
II. Introduction générale sur les tumeurs urothéliales
II.1 Epidémiologie et facteurs de risque
II.2 Classification
II.3 Evaluation du risque de récidive ou progression des TVNIM
II.4 Traitements
II.5 Suivi des TVNIM
II.6 Traitement et suivi des TVIM
II.7 Tumeurs urothéliales de la voie excrétrice supérieure (TVES)
II.8 Nouvelle taxonomie des cancers urothéliaux : sous-types basal et luminal
II.9 Mutations géniques somatiques
II.9.1 TP53
II.9.2 FGFR3
II.9.3 STAG2
II.9.4 Profil mutationnel global des tumeurs de vessie selon le TCGA
II.10 Altérations chromosomiques du carcinome urothélial selon les données du TCGA
III. Analyse moléculaire des altérations chromosomiques et mutations du carcinome urothélial
III.1 Introduction
III.2 Analyse moléculaire des altérations chromosomiques par puce CGH BCA-Oligo sur tissu tumoral congelé
III.2.1 Patients et Méthodes
III.2.2 Extraction d’ADN à partir de tissus congelés
III.2.3 Test BCA-oligo
III.2.4 Résultats
III.3 Analyse moléculaire des altérations chromosomiques par puce CGH BCA-oligo et des mutations du gène FGFR3 à partir d’ADN urinaire de patients présentant un carcinome urothélial
III.3.1 Matériels et méthodes
III.3.2 Protocole de collection et analyse des urines
III.3.3 Résultats
III.3.4 Conclusion
IV. Analyse immunohistochimique des tumeurs urothéliales
IV.1 Introduction : Marqueurs pronostiques candidats pour des études en immunohistochimie
IV.1.1 Marqueur de proliferation : Ki67/MIB1
IV.1.2 Marqueur lié à la stabilité de l’ADN: P53, STAG2, AURORA
IV.1.2.1 P53
IV.1.2.2 STAG2
IV.1.2.3 AURORA Kinase A
IV.1.3 Typologie luminale-basale : CK5/6, CK14, P63, FOXA1, GATA3
IV.1.3.1 P63
IV.1.3.2 Cytokératine 5/6 et cytokératine 14 : typologie basale
IV.1.3.3 FOXA1: typologie luminale
IV.1.3.4 GATA3 : typologie luminale
IV.2 Présentation de l’étude
IV.3 Matériels et méthodes
IV.3.1 Population étudiée
IV.3.2 Choix des marqueurs et Immunohistochimie
IV.3.3 Statistiques
IV.3.4 Résultats
IV.3.5 Discussion
IV.3.5.1 Analyse en Composantes Principales des rapports entre tumeur primitive et métastase
V. Conclusion
VI. Annexes
VI.1 Annexe 1 – Article Publié
VI.2 Annexe 2 – Mots clés
VII. Glossaire
VIII. Table des illustrations
IX. Table des tableaux
X. Bibliographie

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