Soutenance mémoire
Présentation des HAP
Qu’est-ce que les HAP ?
D’une façon générale, les hydrocarbures sont des molécules formées uniquement d’atomes de carbone et d’hydrogène. Il existe trois séries distinctes d’hydrocarbures: les hydrocarbures aliphatiques, les hydrocarbures alicycliques et les hydrocarbures aromatiques. δes hydrocarbures aliphatiques sont constitués d’une ou plusieurs chaînes carbonées linéaires qui peuvent être saturées (alcanes) ou insaturées (alcènes, alcynes). Les hydrocarbures alicycliques sont des composés à la fois aliphatiques et cycliques. Ils peuvent également être saturés ou composés d’une ou plusieurs doubles liaisons (cycloalcanes, cycloalcènes, terpènes). Enfin, les hydrocarbures aromatiques sont composés d’un ou de plusieurs cycles aromatiques. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont une sous-famille des hydrocarbures aromatiques. Ces composés insaturés se caractérisent par la présence de plusieurs cycles aromatiques accolés de façon linéaire (anthracène) ou angulaire (phénanthrène).
Dans la littérature, les HAP sont habituellement classés en deux catégories : « les HAP légers », de faibles masses moléculaires, possédant entre deux et trois cycles benzéniques et les « HAP lourds », de plus grandes masses moléculaires, possédant plus de trois cycles [1]. Selon les travaux, les nombres de noyaux aromatiques caractéristiques de chaque catégorie peuvent différer. En effet, certains auteurs utilisent d’autres classifications. A l’institut des corps gras (ITERG), Florence Lacoste et al. stipulent que les HAP légers possèdent entre deux et quatre cycles tandis que les HAP lourds possèdent plus de quatre cycles [2]. Aussi, Yang et al. définissent trois classes : les HAP de faibles (2 à 3 cycles), moyens (4 cycles) et hauts poids moléculaires (plus de 5 cycles) [3]. D’une manière générale, plus les HAP sont lourds, plus ils sont stables et toxiques.
Les propriétés physico-chimiques des HAP
Une connaissance précise des propriétés physico-chimiques des HAP est nécessaire pour une bonne interprétation des phénomènes observés lors de l’optimisation d’une méthode analytique.
Les propriétés physico-chimiques des HAP ont déjà fait l’objet de différentes études [4-7]. Elles sont majoritairement gouvernées par leur taille (nombre d’atomes de carbone) et leur forme (symétrie de la structure, disposition spatiale des cycles, etc.). Les HAP sont donc principalement caractérisés par leur hydrophobie. Elle augmente en fonction du nombre de cycles aromatiques présents dans la molécule et est caractérisée par le coefficient de partage octanol-eau (Kow). En effet, ce coefficient de partage représente la répartition du composé entre l’octanol (phase lipophile) et l’eau (phase hydrophile). Plus un HAP aura un coefficient de partage Kow important, plus il aura d’affinité avec les milieux lipophiles (ex : les huiles), mais aussi plus il pénètrera facilement les membranes biologiques (bicouches lipidiques) et s’accumulera dans les organismes vivants. Les HAP ont des logKow, aussi appelés logP, élevés (compris entre 3 et 7) ce qui traduit leur caractère lipophile .
Une autre propriété physico-chimique à considérer, étroitement liée à l’hydrophobie, est la solubilité en phase aqueuse exprimée en mg/δ d’eau. Elle décroît avec la masse moléculaire et par conséquent avec l’hydrophobie. Ainsi, les HAP de hauts poids moléculaires ont des valeurs de solubilité dans l’eau modérées voire très faibles . Seul le naphtalène présente une solubilité relativement élevée dans l’eau : 31,8 mg/L.
Origines des HAP
Ces composés sont principalement formés au cours de procédés variés de combustion et de pyrolyse à partir de sources naturelles et anthropogéniques. Un nombre important de HAP est émis lors de la combustion incomplète de matières organiques comme le bois et les produits pétroliers ou encore le charbon [9, 10]. Par conséquent, les émissions industrielles, liées au chauffage domestique et au transport, sont les principales causes de pollution de l’atmosphère par les HAP. d’activité humaine n’est pas la seule source d’émission de HAP dans l’environnement puisque des quantités importantes de HAP sont détectées lors de feux de forêt ou d’éruptions volcaniques [11]. l’homme étant exposé aux HAP à travers l’air qu’il inspire, la présence de HAP dans l’environnement constitue un véritable problème de sécurité sanitaire. Néanmoins, l’une des principales sources d’exposition de l’homme aux HAP sont les produits alimentaires [12-14]. Les origines de la présence des HAP dans les aliments sont essentiellement environnementales et industrielles.
Toxicité et réglementation des HAP
Il y a bientôt trente ans que les HAP ont été désignés comme composés toxiques par le Centre International de Recherche sur le Cancer (CIRC) [19]. De nombreux travaux ont depuis confirmé le potentiel mutagène et cancérigène de ces substances [12, 19-21]. Les trois HAP les plus toxiques, à savoir le benzo(a)pyrène (BaP), le benzo(a)anthracène (BaA) et le dibenzo[a,h]anthracène (DBahA) ont été classés par le CIRC comme « cancérigène probable » (groupe 2A). Quatre autres HAP présentant un pouvoir cancérigène possible, le benzo(b)fluoranthène (BbF), le benzo(j)fluoranthène (BjF), le benzo(k)fluoranthène (BkF) et l’indéno[1,β,γ,cd]pyrène (IP), appartiennent au groupe βB. δes risques encourus avec les autres HAP de la liste n’ont pas été évalués [20].
En effet, une fois les molécules d’HAP ingérées par l’organisme, des dérivés époxydes et hydroxylés se trouvent synthétisés au cours de réactions enzymatiques. Ces métabolites, particulièrement réactifs avec l’ADN, l’ARN et les protéines cellulaires engendrent alors des mutations de l’ADN et donc la formation de tumeurs. Etant donnée leur toxicité prononcée, plusieurs organismes ont établit des listes de HAP qu’il est conseillé de surveiller dans les matrices environnementales et alimentaires. d’agence américaine pour la protection de l’environnement (US-EPA) a établi une liste de 16 HAP classés comme polluants prioritaires dans les échantillons environnementaux, nommée les « 16 HAP US-EPA » (Figure I-I-1) [22]. En 2002, le comité scientifique européen sur les aliments (SCF) (aujourd’hui remplacé par le groupe scientifique de l’agence européenne de sécurité sanitaire des aliments (EFSA)) a défini un groupe prioritaire de 1η HAP en matière d’évaluation des risques sanitaires à long terme consécutifs à une consommation alimentaire de HAP [12]. En effet, ces 15 HAP présentaient une mutagénicité/génotoxicité évidente dans les cellules somatiques chez les animaux de laboratoire in vivo. Ce même comité a recommandé d’utiliser le BaP comme marqueur de la présence et de l’effet toxique des HAP dans les aliments. le pouvoir carcinogène des HAP totaux était alors estimé à environ dix fois celui du BaP. Ensuite, en 2005, en prenant en compte les évaluations du SCF, le comité mixte (Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture/Organisation mondiale de la Santé) d’experts sur les additifs alimentaires (JECSA), a recommandé d’ajouter le BcFδR à la précédente liste [23]. Finalement, en 2008, le groupe scientifique sur les contaminants de la chaîne alimentaire (groupe CONTAε) de l’EFSA a officiellement inclus ce composé à la liste des 15 HAP prioritaires [13]. Ces 16 HAP sont communément appelés les « 15+1 HAP EU » afin de les différencier des 16 HAP US-EPA dont huit HAP sont communs (Figure I-I-1). Dans ce même texte, l’EFSA a également conclu que le BaP seul ne permettait pas d’évaluer de façon fiable la contamination des produits alimentaires par les HAP et qu’il était nécessaire d’étendre la surveillance à d’autres HAP. Cette conclusion s’est basée sur l’évaluation de près de 10 000 résultats de taux de HAP réunis par dix-huit Etats membres dans différentes matières premières alimentaires. Le BaP était détecté dans environ 50 % des échantillons. Cependant, dans environ 30 % de l’ensemble des échantillons, d’autres HAP cancérigènes et génotoxiques ont été détectés malgré des tests négatifs pour le BaP. δe groupe CONTAε de l’EFSA a donc proposé à la Commission européenne de nouveaux indicateurs plus appropriés pour évaluer l’occurrence des HAP dans l’alimentation en se basant sur les données alors disponibles de cancérogénicité par voie orale. Un groupe de 8 HAP (HAP8) et un groupe de 4 HAP (HAP4) ont ainsi été retenus (Figure I-I-1) [13]. Il est à noter que la liste HAP8 est constituée des 8 HAP communs aux listes environnementale (16 HAP US-EPA) et alimentaire (15+1 HAP EU) (Figure I-I-1). La Commission européenne a donc modifié sa réglementation fixant jusqu’alors la concentration maximale en BaP dans certaines denrées alimentaires (Règlement No 1881/2006, [24]). Depuis 2011, de nouvelles teneurs maximales ont été introduites pour le groupe HAP4 tout en maintenant un niveau maximum de BaP seul dans les aliments (Règlement No 835/2011 du 19 août 2011,[25]).
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Table des matières
INTRODUCTION GÉNÉRALE
PARTIE I – ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
CHAPITRE I : Analyse des HAP dans les huiles
1. Présentation des HAP
1.1 Qu’est-ce que les HAP ?
1.2 Les propriétés physico-chimiques des HAP
1.3 Origines des HAP
1.4 Toxicité et réglementation des HAP
2. Les HAP dans les huiles alimentaires
2.1 Origines des HAP dans les huiles
β.β δe raffinage comme outil d’élimination des HAP
2.3 Réglementation des HAP dans les huiles
β.ζ εéthodes normalisées pour l’analyse des HAP dans les corps gras
3. Analyse des HAP dans les huiles
γ.1 Préparation de l’échantillon
3.2 Techniques chromatographiques et systèmes de détection
CHAPITRE II : Analyse des HAP par électrophorèse en formats capillaire et microsystème (article)
1. Introduction
2. Analysis of PAHs by capillary electrophoresis
2.1 Micellar electrokinetic chromatography in the presence of an organic modifier
2.2 Micellar electrokinetic chromatography modified with cyclodextrins
2.3 Cyclodextrin-modified capillary zone electrophoresis
2.4 Capillary electrochromatography
3. Analysis of PAHs in electrophoretic microsystems
3.1 Microchip based electrochromatography
3.2 Microchip based cyclodextrin-modified capillary zone electrophoresis
4. Conclusion
CHAPITRE III : Analyse de matrices alimentaires sur microsystèmes électrophorétiques (article)
1. Introduction
2. CE-microchips in food analysis: review of applications
2.1 Food Quality and Food authenticity
2.2 Food Safety
3. Conclusion
CONCLUSION
PARTIE II – ANALYSE DES HAP PAR ÉLECTROPHORÈSE CAPILLAIRE
INTRODUCTION
CHAPITRE I : Développement d’une méthode de séparation des HAP par électrophorèse capillaire et application aux huiles alimentaires (article)
1. Introduction
2. Materials and methods
2.1 Chemicals
2.2 Apparatus and software
2.3 Electrophoretic procedures
2.4 Real samples preparation
3. Results and Discussion
3.1 Migration times
3.2 Peak area repeatability
3.3 Selectivity
3.4 Application to real samples
4. Conclusions
CHAPITRE II : Utilisation de stratégies multivariées pour l’optimisation de méthodes de séparation des HAP par électrophorèse capillaire
1. Utilisation d’un plan d’expériences pour l’optimisation d’une méthode de séparation de huit HAP par électrophorèse capillaire (article)
1. Introduction
2. Materials and methods
2.1 Standards and electrolytes
2.2 Instrumentation
2.3 Electrophoretic conditions
2.4 Electroosmotic flow time
2.5 Statistical analysis software
2.6 Real samples preparation
3. Experimental design
3.1 Choice of the factors and responses
3.2 Selection of the experimental design
3.3 Matrix of experiments
3.4 Factor levels
3.5 Desirability analysis
3.6 Robustness evaluation
4. Results and Discussion
4.1 Effects of factors on PAH migration
4.2 Optimization of PAH separation
4.3 Experimental validation and evaluation of resolution robustness
4.4 Application to a real sample
5. Conclusions
2. Utilisation d’une stratégie basée sur un plan d’expériences pour l’optimisation d’une méthode de séparation de dix-neuf HAP par électrophorèse capillaire (article)
1. Introduction
2. Materials and methods
2.1 Reagents, standard samples and electrolytes
2.2 Apparatus
2.3 Electrophoretic conditions
2.4 Experimental design
2.5 Real samples preparation
3. Results and Discussion
3.1 Choice of the factors, variation domains and responses
3.2 Central composite design: optimization design
3.3 Optimization of PAH separation
3.4 Experimental validation
3.5 Application to a real sample
4. Conclusions
CONCLUSION
PARTIE III – VERS UN TRANSFERT DES MÉTHODES DÉVELOPPÉES EN ÉLECTROPHORÈSE CAPILLAIRE AU FORMAT MICROSYSTÈME
CHAPITRE I : Les microsystèmes séparatifs
1. Introduction
2. Les microsystèmes séparatifs électrophorétiques
CHAPITRE II : Analyse des HAP sur microsystèmes
1. Optimisation de la séparation des HAP en capillaire en vue d’un transfert au format microsystème
1.1 Détermination de l’optimum par modélisation
1.β Validation expérimentale de l’optimum
2. Prise en main du dispositif expérimental dédié à l’analyse sur microsystèmes et problèmes rencontrés
2.1 Présence de bulles et de particules dans les micro-canaux
β.β Instabilités de l’écoulement électroosmotique
2.3 Ecoulements hydrodynamiques
3. Optimisation de l’injection
3.1 Etude du retrait
3.2 Etude du temps dynamique
4. Optimisation de la sensibilité de la détection
ζ.1 Optimisation de la valeur du temps d’exposition du capteur
4.2 Optimisation de la valeur du gain électronique
5. Transposition des conditions de séparation des HAP optimisées sur capillaire au format microsystème
5.1 Etude du retrait
η.β Etude de l’écoulement électroosmotique
5.3 Séparation et détection des HAP
CONCLUSION
PARTIE IV – DÉVELOPPEMENT D’UN MIP POUR L’EXTRACTION DES HAP DES HUILES ALIMENTAIRES
CHAPITRE I : Les polymères à empreintes moléculaires
1. Introduction
2. Synthèse des MIP
β.1 Principe de l’impression moléculaire
2.2 Choix des réactifs
2.3 Techniques de polymérisation
3. Evaluation de la sélectivité des MIP
3.1 Mesures chromatographiques
3.2 Tests de fixation
γ.γ Etude des profils d’élution en SPE
4. Applications des MIP en SPE
4.1 Principe
ζ.β Extraction sélective d’une famille de molécules
ζ.γ Développement d’une procédure SPE sélective
5. Applications des MIP aux HAP
CHAPITRE II : Synthèse et caractérisation d’un MIP pour l’extraction des HAP des huiles alimentaires (article)
1. Introduction
2. Experimental
2.1 Chemicals
2.2 Instruments and analytical conditions
2.3 Synthesis of the MIPs
2.4 Characterization of the imprinted sorbents
2.5 Clean-up of oil samples
3. Results and Discussion
3.1 Choice of the MIP synthesis conditions
3.2 Selectivity of the MIPs toward the eight PAHs
3.3 Extraction of PAHs from oil samples
4. Conclusions
CONCLUSION
CONCLUSION GÉNÉRALE
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