ANALYSE CYTOGENETIQUE DES AUTRES ESPECES DU GENRE VANILLA

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Formation des grains de pollen

Nous avons vu dans les études précédentes qu’une forte aneuploïdie existait dans les cellules des racines aériennes, rendant délicate l’évaluation du nombre chromosomique de base. Il est alors essentiel de réaliser des comptages au niveau haploïde, sur du pollen en formation. Dans le sac pollinique ou microsporange, une cellule mère (microsporocyte) contenant un noyau 2n va se diviser au cours de la méiose en quatre cellules filles (microspores) à un seul noyau n (Figure 3.7). Chaque microspore évolue au cours d’une première mitose et contient alors deux cellules haploïdes : une cellule végétative volumineuse qui formera le tube pollinique et une petite cellule génératrice. La cellule reproductrice va se diviser au cours d’une deuxième mitose en deux cellules spermatiques. La paroi du microspore s’épaissit et il devient alors un grain de pollen. La cellule végétative va permettre la germination du tube pollinique et le noyau va ensuite dégénérer. Quant aux deux cellules spermatiques, l’un des noyaux va féconder l’oosphère pour donner un zygote 2n et l’autre va fusionner avec les deux globules polaires n de l’ovule pour former l’albumen 3n (Pesson et Louveaux, 1984; Lüttge et al., 2002).

Mécanismes d’autostérilité

Pour expliquer l’autostérilité d’une plante, plusieurs mécanismes peuvent être invoqués : l’auto incompatibilité (gamétophytique et sporophytique), la stérilité mâle (génique, cytoplasmique et géno-cytoplasmique) et enfin la polyploïdie.
L’auto incompatibilité pollinique comprend deux systèmes (Brewbaker, 1957; Pesson et Louveaux, 1984). L’incompatibilité gamétophytique (GSI, Gametophytic Self-Incompatibility) est déterminée par la nature génétique haploïde du pollen (Kao et McCubbin, 1996) et concerne la plupart des espèces auto incompatibles (Brewbaker, 1957). Si le grain de pollen et le stigmate ont le même allèle du gène ‘SI’ en commun, la croissance du tube pollinique est inhibée par des RNases exprimées, codées par le gène ‘SI’ du stigmate (East et Mangelsdorf, 1926; Matton et al., 1994; Kao et McCubbin, 1996). Mais si une autre plante n’a pas d’allèle commun avec le grain de pollen, la croissance du tube pollinique sera complète. L’incompatibilité sporophytique (SSI, Sporophytic Self-Incompatibility) est déterminée par la nature génétique diploïde de la plante dont est issu le pollen (Matton et al., 1994; Kao et McCubbin, 1996). C’est au niveau de la paroi d’exine du grain de pollen que se déroulent les mécanismes d’incompatibilité sporophytique. Les protéines impliquées dans la reconnaissance sont un ligand présent dans l’exine et un récepteur, situé à la surface des cellules du stigmate (Matton et al., 1994). Si le stigmate sur lequel se pose le pollen possède un allèle commun avec la plante dont est issu le grain de pollen, il ne germera pas (même si le grain de pollen ne porte pas cet allèle) (East et Mangelsdorf, 1926).
La stérilité mâle ou androstérilité est un système génétique conduisant à un avortement des fleurs mâles. Elle peut être génique, cytoplasmique ou géno-cytoplasmique. L’androstérilité génique (NMS, Nuclear Male Sterility) est gouvernée par un gène de stérilité ‘ms’ récessif (Athwal et al., 1967; De Block et al., 1997; Klindworth et al., 2002). L’androstérilité cytoplasmique (CMS, Cytoplasmic Male Sterility) est gouvernée par un gène mitochondrial ‘S’, qui provoque l’absence de pollen fonctionnel (Duroc, 2004). Ce mécanisme est souvent utilisé par les sélectionneurs pour obtenir des semences hybrides par exemple chez le maïs (Rhoades, 1930), le blé (Kihara, 1967) et le tournesol (Leclercq, 1969). L’androstérilité géno-cytoplasmique est une combinaison de deux facteurs, un gène de stérilité (Cms) dans le cytoplasme et un gène de restauration de la fertilité (R) dans le noyau (Rutger et Jensen, 1967; Hermsen, 1968; Burnham et al., 1981; Vidakovic et al., 2002).
Enfin, un dernier phénomène pouvant expliquer l’autostérilité d’un individu est l’autopolyploïdie, surtout la triploïdie (Wilson, 1962; Johnson et al., 2003; Chen et Ni, 2006), provoquée soit par une non réduction des gamètes à la méiose (Bretagnolle et Thompson, 1995; Dvorak, 2004; Tate et al., 2005), soit par un croisement entre des individus diploïde et tétraploïde (De Wet, 1980; Dvorak, 2004). Dans tous les cas, de tels triploïdes sont alors très souvent incapables de produire des embryons viables du fait de méioses forcément irrégulières en raison du nombre impair de chromosomes homologues (Belling, 1921; Belling et Blakeslee, 1923; Sybenga, 1996). Dans le cas de V. planifolia, nous avons démontré que les phénotypes ‘Stérile’ étaient triploïdes. Ceci peut donc expliquer leur autostérilité. L’influence de cette triploïdie sur la viabilité pollinique peut être alors vérifiée.

Matériel et méthodes

Observation préliminaire des chromosomes dans le pollen

L’observation des chromosomes dans les cellules mères de grains de pollen a été réalisée au stade métaphase I de la méiose selon le protocole de Tanguy et Eber (1992) modifié. L’inflorescence entière est récoltée idéalement en début de matinée afin d’avoir des conditions de température fraîche et d’hygrométrie élevée. Les pollinies sont prélevées et fixées dans un mélange fraîchement préparé de 3:1 éthanol : acide acétique pendant 48 h – 72 h à température ambiante. Les pollinies sont dé-solidarisées et le pollen éparpillé dans une goutte de carmin acétique à 1%. Les observations des cellules mères de grains de pollen se font au microscope Letz DM RBE (Leica, Wetzlar, Allemagne) au grossissement x 1000. Les observations ont été réalisées chez des V. planifolia en plantation (types

Viabilité des grains de pollen

La viabilité des grains de pollen a été déterminée in vitro par coloration au bleu d’aniline à 1/1000e dans du lactophénol. La viabilité a été évaluée en dénombrant les grains de pollen anormaux chez V. planifolia sur deux fleurs d’un phénotype ‘Stérile’ PLst0630 et comparée à celle d’une accession du phénotype ‘Classique’ en plantation. Cinq comptages ont été réalisés par accession à raison de 100 grains de pollen par comptage. Les grains sont considérés normaux si la totalité du grain est colorée en bleue, sans déformation et anormaux si le cytoplasme est vide ou caractérisé par la présence de quelques petits organites non colorés. Les observations ont été réalisées au microscope Leica DM 2500.

Evaluation du pouvoir germinatif

Le pouvoir germinatif a été évalué in vitro. Les pollinies d’une fleur fraîchement ouverte ont été placées dans une solution de saccharose à 10% pendant 30 h pour faire germer le pollen puis fixées dans une solution de formaldéhyde:acide acétique glacial:éthanol (FAA, 1:1:8) (Borda et al., 1999). Le taux de germination a été évalué en dénombrant les grains de pollen germés par paquet de grains de pollen (les grains étant agglutinés) chez une accession ‘Stérile’ PLst0630 et une accession ‘Classique’ de V. planifolia en plantation. Un grain est considéré germé s’il présente un tube pollinique. Les observations ont été réalisées au microscope Leica DM 2500.

Analyse des données

Les données de viabilité et de germination ont été analysées avec le logiciel R pour Windows (version 2.5.1; (R Development Core Team, 2006), Vienne, Autriche). Un test de Chi² de Pearson a été réalisé sur ces mesures afin de déterminer si les proportions de grains germés et viables sont différentes entre les accessions ‘Stérile’ et ‘Classique’. La p-value est calculée par simulation selon un test de Monte Carlo avec 2000 répliquats (Hope, 1968).

Résultats

Observation préliminaire des chromosomes sur pollen

Les observations ont été réalisées chez V. planifolia (types ‘Classique’ et ‘Stérile’ en plantation), V. pompona PO0047, V. bahiana BA0062 et V. tahitensis TA0017. Afin de compter les chromosomes dans les cellules mères de grains de pollen (microsporocytes), il a été nécessaire de déterminer le meilleur stade des boutons floraux étudiés en suivant l’évolution de la formation du grain de pollen.
Le développement du grain de pollen est expliqué à partir des stades de l’inflorescence de V. planifolia ‘Classique’ (Figure 3.8) et récapitulé dans le Tableau 3.2. Les stades 1 à 3 montrent des cellules de la paroi du sac pollinique, en interphase, caractérisées par des gros amas d’hétérochromatine. Le stade 4 présente des sporocytes en division de méiose, qui donneront quatre cellules filles ou microspores, observées au stade 5. Les stades 6 à 11 montrent des microspores en interphase, de plus en plus nombreux. Au stade 12, les microspores rentrent en division de mitose, une seule cellule a pu être observée en métaphase, où les chromosomes peuvent potentiellement être comptés. Les microspores possèdent alors deux noyaux (stades 13 à 18), le gros noyau végétatif avec un nucléole bien apparent et le noyau reproducteur plus petit. La deuxième mitose n’a pu être observée pour V. planifolia, ni de grain de pollen à maturité.
Pour les autres accessions étudiées V. planifolia ‘Stérile’, V. pompona PO0047, V. bahiana BA0062 et V. tahitensis TA0017, les stades floraux et stades polliniques ont pu être également corrélés (Tableau 3.2, Figure 3.9 à 3.12).
Le stade recherché pour compter le nombre de chromosomes haploïdes est la première division de méiose des cellules mère de grains de pollen, mais il est possible de les observer sur les stades qui suivent tels que la première mitose. Dans le cas de l’accession de V. planifolia ‘Classique’ étudiée, la première division de méiose s’est produite au stade 4 et la première division de mitose entre les stades 12 et 13 (Tableau 3.2, Figure 3.8).
Nos manipulations ont permis de dénombrer n = 16 chromosomes pour V. planifolia ‘Classique’ au stade de la première division de méiose d’un microsporocyte à partir d’une seule observation (stade 4, Figure 3.8 ; Figure 3.13 a). Pour V. pompona PO0047, deux observations ont permis de dénombrer n = 32 chromosomes à partir de microspores au stade de la première mitose (Figure 3.13, b et c).

Viabilité des grains de pollen

La méthode au bleu d’aniline colore les calloses et permet donc de repérer les grains de pollen totalement développés par rapport à ceux ayant avorté pendant le développement (Kelly et al., 2002). La viabilité a été évaluée par cette méthode colorimétrique en dénombrant les grains de pollen anormaux chez deux accessions de V. planifolia ‘Stérile’ comparées à une accession de ‘Classique’. Le diamètre moyen des grains de pollen pour la ‘Classique’ ou les ‘Stérile’ est constant à environ 10 µm (Figure 3.14). Sur 500 grains de pollen, 35, 44 et 5 grains étaient anormaux pour les deux fleurs du ‘Stérile’ et la fleur du ‘Classique’, respectivement. Le taux de viabilité des accessions étudiées est donc de 93% et 91.2% pour les ‘Stérile’ et de 99% pour la ‘Classique’. Le test de Chi² montre que les proportions de grains de pollen anormaux chez les deux individus ‘Stérile’ sont différentes de celles de la ‘Classique’ (P < 0.001) et les proportions entre les deux ‘Stérile’ sont identiques (P = 0.343).

Evaluation du taux de germination

Après germination dans le saccharose, les grains de pollen étant agglutinés, le taux de germination a été évalué sur cinq paquets de grains, chez une accession de ‘Stérile’ et une accession de ‘Classique’ (Figure 3.13). Sur 149 et 157 grains de pollen totaux dénombrés respectivement pour la ‘Stérile’ et la ‘Classique’, 29 et 113 grains étaient germés. Le taux de germination est donc de 19.5% pour la ‘Stérile’ et 72% pour la ‘Classique’. Le test de Chi² montre que la proportion de grains germés chez l’accession ‘Stérile’ est différente de celle de la ‘Classique’ (P < 0.001).

Discussion

Observation des chromosomes dans le pollen

L’évaluation des nombres chromosomiques sur cellules mères de grain de pollen est une tâche délicate. Ces résultats préliminaires ont toutefois permis une première évaluation de la correspondance chez V. planifolia entre les stades de développement des boutons floraux et les stades de formation des grains de pollen, ainsi que chez V. pompona, V. bahiana et V. tahitensis. Il est en effet indispensable de connaître le stade des boutons floraux qui montrera la première division de méiose des microsporocytes. Nous n’avons jamais observé la deuxième division de mitose du noyau reproducteur. Chez la plupart des angiospermes, ce noyau ne se divise en effet que juste après la germination du grain de pollen (Steffen, 1963). Toutefois, lors d’observations sur V. planifolia, Ravindran (1979) note que même 96 heures après germination, aucune division chromosomique ne peut être observée dans les tubes polliniques. Il est donc fort probable que chez le vanillier, la dernière division se produise à un stade encore plus tardif, probablement seulement quand le tube pollinique pénètre dans l’ovule, comme c’est le cas chez les Euphorbiacées (D’Amato, 1947) dans (Ravindran, 1979), voire que cette dernière division ne se produise pas, comme c’est le cas chez certaines orchidées comme Spiranthes sinensis (Terasaka et al., 1979).
Ces manipulations ont aussi permis une première estimation n = 16 pour V. planifolia ‘Classique’ malheureusement à partir d’une seule observation et n = 32 pour V. pompona PO0047 à partir de deux observations. Dans les études précédentes, une forte aneuploïdie avait été rencontrée dans les cellules de racines aériennes aussi bien pour V. planifolia que pour V. pompona. Les V. planifolia du type ‘Classique’, appartenant au groupe diploïde 5.03 pg en cytométrie en flux, présentent un nombre chromosomique de 2n = 22 à 2n = 24 en désaccord avec certains auteurs indiquant simplement 2n = 32 (Hoffmann, 1929, 1930; Heim, 1954; Chardard, 1963; Martin, 1963) et en accord avec d’autres auteurs montrant plutôt une forte variation du nombre chromosomique (Hurel-Py, 1938; Nair et Ravindran, 1994). L’accession PO0047 de V. pompona appartenant au groupe B (phénotypique, génétique, cytogénétique), est caractérisée par un nombre chromosomique de 2n = 26 à 2n = 36 et une taille de génome 2C de 9.45 pg, en désaccord avec les auteurs indiquant simplement 2n = 32 (Heim, 1954; Martin, 1963). Le comptage des chromosomes au niveau haploïde est devenu alors indispensable pour déterminer le nombre chromosomique de base et le niveau de ploïdie de ces espèces. Nos comptages chromosomiques préliminaires sur pollen montreraient donc que V. planifolia ‘Classique’ est diploïde avec un nombre chromosomique de base n = 16 confirmant les données de Heim (1954) et Chardard (1963) et V. pompona PO0047 tétraploïde avec n = 32.
Ces manipulations ont été initiées en fin de période de floraison 2006, et compte tenu du calendrier de cette thèse, n’ont pas pu être répétées car la floraison est à peine démarrée en octobre 2007. Ces travaux vont être poursuivis sur la période novembre 2007-janvier 2008.

Influence de la triploïdie sur la viabilité pollinique

Pour la V. planifolia ‘Classique’, la viabilité des grains de pollen est très bonne (99%). Le taux de germination in vitro n’est toutefois que de 72%. Dans une précédente étude, Ravindran (1979) donne un taux de germination encore plus faible pour V. planifolia avec seulement 45%. Parmi les pollens non germés, il note le plus souvent n = 14 chromosomes (et parfois 16) et observe de nombreuses fusions chromosomiques, ceci l’ayant conduit à supposer que V. planifolia aurait une origine hybride. Ces observations vont dans le même sens que celles effectuées au niveau des mitoses (Nair et Ravindran, 1994). Ainsi, même chez les V. planifolia diploïdes, il semble exister un certain pourcentage de stérilité pollinique.
La viabilité des grains de pollen des types triploïdes ‘Stérile’ est seulement légèrement plus faible (91.2 et 93%) que celle du type ‘Classique’. Les triploïdes sont pourtant supposés être fortement infertiles du fait de la ségrégation irrégulière des chromosomes conduisant au développement de gamètes avortés (Sybenga, 1996; Olsen et al., 2006b). Olsen et al. (2006a) suggèrent que les méthodologies de coloration des grains de pollen surestiment souvent la viabilité, et que les manipulations de germination (et de pollinisation) sont les seuls vrais indicateurs de la viabilité pollinique. Ainsi alors que chez des Hypericum androsaemum triploïdes, le taux de viabilité du pollen était de 40.6% (Olsen et al., 2006b), les taux de fructification sont en réalité très faibles. De la même façon, chez des spécimens triploïdes du genre Pomaderis, jusqu’à 55% des pollens sont viables, mais parmi eux seulement 30% germent in vitro (Harvey et Rattenbury, 1985).
Ceci semble être aussi le cas dans notre étude. En effet, l’accession ‘Stérile’ testée germe beaucoup moins bien (19.5%) que la ‘Classique’ (72%), confirmant donc la très faible viabilité pollinique de l’accession triploïde. Les observations au champ montrent en général qu’une fleur de ‘Stérile’ autofécondée tombe au bout de quelques semaines. Dans des rares cas, nous avons aussi pu observer la production d’une gousse issue d’autofécondation qui s’est allongée pendant deux à trois mois avant de chuter. De plus, nous avons observé pour les accessions PLst0630 et PLst0645 la production de gousses issues d’allofécondation avec des individus ’Classique’. Ceci est en accord avec la suggestion de Bretagnolle (1995) qui indique que chez les triploïdes, les gamètes mâles sont généralement stériles, alors que les gamètes femelles montrent une certaine fertilité. Plus largement, la fertilité des triploïdes dépend de la production de gamètes euploïdes (n = x, 2x, ou 3x) mais aussi de la tolérance des gamètes ou du zygote vis-à-vis de l’aneuploïdie (Olsen et al., 2006b). Chez Hypericum androsaemum, la fécondation de plantes femelles triploïdes par du pollen 2x, 3x ou 4x parvient à produire quelques fruits, mais le nombre de graines est réduit et aucune n’est viable (Olsen et al., 2006b). A contrario chez les myrtilles (Vaccinium corymbosum) ou les bananiers triploïdes, une certaine fertilité peut être parfois observée associée à une production de gamètes euploïdes (de type 2n) (Vorsa et Ballington, 1991; Ortiz et Vuylsteke, 1995). Tel est aussi le cas chez les espèces du genre Pomaderis triploïdes (Harvey et Rattenbury, 1985).
Dans le cas des V. planifolia triploïdes, il est donc possible que les 19.5% de grains de pollens fertiles produits possèdent en fait un nombre euploïde de chromosomes.
Certains auteurs montrent que la taille des grains de pollen peut être utilisée pour détecter les gamètes euploïdes par rapport aux aneuploïdes (Harvey et Rattenbury, 1985; Kelly et al., 2002). Une telle approche pourrait être testée dans le cas des vanilliers triploïdes. Par ailleurs, la fertilité observée des croisements des V. planifolia 3x par 2x implique qu’il existe peut-être une meilleure tolérance à l’aneuploïdie du gamète femelle, ou une plus forte proportion de gamètes femelles euploïdes produits.
Dans tous les cas, ces résultats préliminaires méritent d’être approfondis. Ces manipulations ont été rendues difficiles par la localisation des accessions stériles en plantation à St-Philippe et la difficulté de prédire les dates et jours de floraison. Elles seront facilitées dès que les accessions stériles en collection fleuriront. Il s’agira alors de mettre en place des manipulations d’auto et d’allofécondation et de réaliser des mesures précises de viabilité pollinique, germination in vitro et in vivo, taux de fructification et viabilité des embryons, sur des accessions diploïdes (‘Classique’), triploïdes (‘Stérile’) mais aussi tétraploïdes (‘Grosse Vanille’). Associées à des comptages du nombre chromosomique de base n dans les grains de pollen de ces accessions, il sera alors possible de préciser l’impact de la polyploïdie sur leur fertilité.

Matériel végétal et extraction d’ADN

L’étude a été menée sur un sous-échantillon de 48 accessions (Tableau 4.1) de V. planifolia qui ont été précédemment analysées par AFLP (Bory et al., submitted-b) et dont la variabilité phénotypique n’était pas expliquée par une variation génétique. Ce sous-échantillon comprend 24 accessions collectées dans une ombrière de la coopérative Provanille (Bras-Panon, La Réunion) des phénotypes ‘Classique’ et ‘Mexique’. Ces 24 accessions sont en réalité huit plants répétés avec trois boutures pour chaque plant. L’idée est de vérifier que le polymorphisme de méthylation, s’il existe, est bien transmis via la multiplication végétative. Les 24 autres accessions, provenant de prospections à La Réunion et d’échanges avec des jardins botaniques, comprennent les phénotypes ‘Classique’, ‘Mexique’, ‘Grosse Vanille’, ‘Stérile’, ‘Variegata’ et enfin, un type particulier ‘Magic’ qui serait indéhiscent (B. Côme, com. pers.). Ces échantillons sont maintenus dans la collection des ressources génétiques du vanillier au CIRAD à La Réunion (Grisoni et al., 2007).
L’ADN a été extrait selon le protocole de Risterucci et al. (2000) et purifié sur des spin columns 100 (Sigma, St. Louis, Missouri). Les concentrations des extraits d’ADN ont été estimées visuellement par comparaison avec des dilutions d’échantillons d’ADN de maïs de concentration connue, après migration électrophorétique sur gels d’agarose.

Analyse MSAP

La méthode MSAP a été réalisée selon le protocole de Reyna-Lopez et al. (1997). L’ADN génomique total (500 ng) a été digéré une première fois dans 50 µL contenant 20 U d’endonucléase EcoRI insensible à la méthylation et 2 X de tampon Tango (MBI Fermentas, Vilnius, Lituanie) pendant 2 h à 37°C. Après inactivation de l’enzyme 15 min à 65°C, les produits de digestion ont été séparés en deux aliquots. Chaque aliquot a été digéré soit par 15 U d’endonucléase HpaII, sensible à la méthylation, soit par MspI, isoschizomère insensible à la méthylation (Fermentas) toute la nuit. Les enzymes ont été inactivées 15 min à 65°C. Des adaptateurs double-brin EcoRI et HpaII (10 µM) (Tableau 4.2) ont été ligués aux produits de digestion avec 10 U de T4 DNA ligase et 1 X de tampon de réaction ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) pendant 2 h à température ambiante dans un volume final de 100 µL. La préamplification a été réalisée dans un volume de 50 µL contenant 5 µL de produit de digestion-ligation dilué dans de l’eau HPLC au 1/10e, 1 X de tampon PCR (Red GoldStar, Eurogentec, Seraing, Belgique), 0.2 mM de dNTPs (NEB), 1.5 mM de MgCl2 (Red GoldStar), 0.2 µM d’amorces Eco-A et Hpa-A (Applied Biosystems, Foster City, California, Tableau 4.2) et 1 U de Taq polymerase (Red GoldStar). La réaction PCR a été réalisée sur un thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) selon les paramètres suivants : une étape initiale de 2 min à 72°C, un cycle de 2 min à 94°C, 25 cycles de 30 s à 94°C, 30 s à 56°C et 2 min à 72°C et une étape finale de 10 min à 72°C. L’amplification sélective a été réalisée dans un volume de 15 µL contenant 5 µL de produit de la préamplification dilué dans de l’eau HPLC au 1/20e, 1 X de tampon PCR, 0.2 mM de dNTPs, 1.5 mM de MgCl2, 0.1 µM d’amorce EcoRI marquée avec un fluorochrome, 0.2 µM d’amorce HpaII et 1.25 U de Taq polymerase. Huit couples d’amorces ont été utilisés (Tableau 4.2). La réaction PCR a été réalisée sur un thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 selon les paramètres suivants : une étape initiale de 5 min à 94°C, 13 cycles de 30 s à 94°C, 30 s à 65°C et 2 min à 72°C avec une diminution de la température d’hybridation de 0.7°C par cycle, puis 24 cycles de 30 s à 94°C, 30 s à 56°C et 2 min à 72°C et une étape finale de 10 min à 72°C. Les données ont été obtenues après migration d’un mélange de 1 µL de produit amplifié, 10.7 µL de Hi-Di Formamide (Applied Biosystems) et 0.3 µL de marqueur de taille interne GeneScanTM-5OO LIZ (Applied Biosystems) sur un séquenceur à 16 capillaires ABI PRISM 3100 Genetic Analyser (Applied Biosystems).

Analyse des données

Nous avons utilisé les enzymes MspI et HpaII, isoschizomères coupant le même site de restriction CCGG mais présentant une sensibilité différente à la méthylation :
– les deux enzymes reconnaissent le site CCGG et le coupent lorsqu’il est non méthylé,
– HpaII coupe aussi ce site s’il est hémi-méthylé sur la cytosine externe (un seul des deux brins est méthylé) (5hmCCGG),
– MspI coupe si la cytosine interne est méthylée (C5mCGG), mais HpaII ne la coupe pas
– MspI est bloqué par l’hémi-méthylation (5hmCCGG), la méthylation externe (5mCCGG) et la double méthylation (5mC5mCGG).
La comparaison des motifs issus de l’amplification de l’ADN digéré par EcoRI/HpaII et EcoRI/MspI fournit des informations sur le statut de méthylation de la cytosine interne de la séquence CCGG (Tableau 4.3). Une bande présente dans le profil MspI et absente dans le profil HpaII traduit la méthylation de la cytosine interne. La situation contraire (bande présente en HpaII et absente en MspI) indique la méthylation de la cytosine externe.
Un évènement de méthylation est considéré comme polymorphe lorsqu’au moins une accession diffère des autres dans son profil.
L’alignement des bandes a été réalisé avec le logiciel GelCompar II, version 3.5 (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium). Seules les bandes de 50 pb à 500 pb ont été codées (1 si présente, 0 si absente) et analysées.

Discussion et conclusion

Nos données montrent qu’il existe de la méthylation chez V. planifolia, 7.8% des fragments révélés grâce aux digestions avec EcoRI, MspI et HpaII étant méthylés. Cette valeur est en accord avec le taux révélé chez la banane (7.5%, (Noyer et al., 2005)) mais elles sont relativement faibles comparé à celles révélées chez d’autres plantes. Les proportions d’évènements de méthylation pour des plantes propagées de façon conventionnelle sont de 16.3% chez le riz (Xiong et al., 1999), 18.4% pour d’autres bananes (Peraza-Echeverria et al., 2001), 25% chez la pomme (Xu et al., 2000), 32% chez le coton allotétraploïde (Keyte et al., 2006) et 52 à 60% chez le chou-fleur (Salmon, 2007). Les proportions d’évènements de méthylation pour des plantes issues de micropropagation sont entre 11 et 17% chez le ginseng (Chakrabarty et al., 2003), entre 20.8 et 22% chez le palmier à huile (Jaligot et al., 2000) et 23% pour la banane (Peraza-Echeverria et al., 2001). Ces valeurs sont très variables en fonction de l’espèce étudiée. Les différences entre les taux de méthylation peuvent être expliquées par les propriétés de digestion des enzymes, en particulier HpaII, dépendantes du fournisseur, de la qualité de l’ADN et de l’environnement génomique (Baurens et al., 2003). L’état physiologique des plants peut également entraîner de fortes différences dans les niveaux de méthylation (Fraga et al., 2002). De plus, la micropropagation est connue pour induire une grande variété de changements génétiques et épigénétiques dans les régénérants appelée variation somaclonale (Kaeppler et al., 2000). Elle semble être responsable d’une hyperméthylation chez les régénérants pour la banane (Peraza-Echeverria et al., 2001) et le ginseng (Chakrabarty et al., 2003) mais également d’une hypométhylation pour le palmier à huile (Jaligot et al., 2000). Des séquences comme les rétrotransposons pourraient être activées par les processus de culture de tissus (Kaeppler et al., 2000; Peraza-Echeverria et al., 2001).
Dans cette étude, cinq accessions ont montré un léger polymorphisme de méthylation, et nous avons observé à la fois des hyperméthylations et des hypométhylations. Alors que l’hyperméthylation est en général responsable de l’inactivité ou ‘silencing’ des gènes (Jacobsen et al., 2000; Martienssen et Colot, 2001), l’hypométhylation provoque le développement anormal des plantes (Finnegan et al., 1996; Finnegan, 2001) en activant la transcription des gènes (Akimoto et al., 2007; Fang et Chao, 2007). L’hypométhylation a été trouvée plus fréquente que l’hyperméthylation chez le maïs (Kaeppler et al., 2000).
Trois accessions (Plst0645, Plm0632, PL0711) étaient hyperméthylées à quelques locus (disparition de bande en HpaII) par rapport au reste des 45 accessions.
Deux accessions PLc0340 et PLc0341 du type ‘Classique’ étaient hypométhylées (apparition de bande en HpaII) à un niveau de bande différent. Parmi les 48 accessions étudiées, nous disposions de ‘triplets’ pour huit plants (trois boutures par plant) afin de vérifier la transmission du polymorphisme de méthylation à travers la multiplication végétative. Les accessions PLc0340 et PLc0341 appartiennent au même ‘triplet’ et ont montré un polymorphisme de méthylation. Il est intéressant de noter que la troisième accession du triplet, PLc0342, n’a pas montré de déméthylation. Ainsi ces variations sont soit non transmissibles par voie végétative, soit se sont produites après le bouturage.
Certaines études ont montré que la variabilité morphologique dans des populations clonales pouvait s’expliquer par une combinaison de facteurs génétiques et épigénétiques (Imazio et al., 2002). L’objectif de cette étude épigénétique était donc de vérifier cette hypothèse, pour expliquer les variations phénotypiques des types réunionnais ‘Mexique’ et ‘Variegata’ par rapport au type ‘Classique’ le plus courant. Nous avons donc recherché l’existence d’un polymorphisme de méthylation au sein de ces accessions. Même si un faible polymorphisme de méthylation (1.4%) a été trouvé pour certaines accessions, aucun marqueur de méthylation n’a permis de distinguer spécifiquement les types ‘Mexique’ et ‘Variegata’ du type ‘Classique’. Une conclusion similaire a été obtenue au cours d’études réalisées chez la banane (Baurens et al., 2005; Noyer et al., 2005) et le chou-fleur (Salmon, 2007). Les bananiers Plantains montrent une grande diversité phénotypique dans leur zone de diversification secondaire au Congo mais les marqueurs moléculaires (AFLP, RAPD, RFLP, microsatellites) ont révélés une base génétique très étroite. L’étude du statut de méthylation des cytosines a montré un fort degré de polymorphisme qui ne reflétait cependant pas les variations phénotypiques observées (Baurens et al., 2005; Noyer et al., 2005). De même, pour tenter d’expliquer les abberrations de développement affectant la morphologie et la vigueur des plants chez le chou-fleur, la méthylation a été recherchée, mais aucun marqueur de méthylation permettant d’expliquer ces anomalies n’a été détecté (Salmon, 2007).
Notre stratégie de criblage à large échelle du polymorphisme génétique (AFLP) ou épigénétique (MSAP) n’a donc pas permis de mettre en évidence des variations génétiques ou épigénétiques pouvant expliquer de façon consistante les variations phénotypiques observées chez les types ‘Mexique’ ou ‘Variegata’.
La variégation des feuilles (plantes ‘panachées’) est souvent le résultat d’une mutation se produisant dans les gènes chloroplastiques entraînant un développement anormal du chloroplaste (Tilney-Bassett, 1978) et c’est donc peut-être au niveau du génome chloroplastique que ces variations devraient être recherchées. Toutefois, chez certaines espèces comme Hypericum androsaemum (Olsen et al., 2006b), il a été montré qu’il peut s’agir d’un caractère nucléaire récessif. Chez cette espèce, l’observation de réversions du caractère panaché a conduit les auteurs à émettre l’hypothèse que la mutation responsable de ce caractère peut être due à la présence d’un élément transposable (Olsen et al., 2006b). De plus, comme la vanille, tous les cultivars de clémentine dérivent d’un seul plant, sont propagées végétativement et présentent pourtant une grande variabilité morphologique non expliquée par une diversité génétique. Dans ce cas, des mutations dans les séquences des rétrotransposons ont été mises en évidence favorisant la diversification morphologique des clémentines (Bretó et al., 2001). Cela pourrait être une hypothèse à vérifier chez la vanille. Plus largement, le mouvement des éléments transposables étant largement contrôlés par des méthylations (Finnegan et al., 1998), une telle mutation est peut être aussi probablement le résultat indirect de phénomènes de méthylation et de déméthylation. De telles hypothèses sont en effet proposées pour expliquer la variégation des tiges de bambou Phyllostachys sp. (Gielis et al., 2004). Ces auteurs proposent de cibler spécifiquement des transposons du type de l’Activator Ac du maïs. Le type ‘Variegata’ est un type stable transmis par reproduction végétative, mais nous avons pu observer une réversion du phénotype panaché sur la liane d’une des accessions de ce type (PLv0035) (Figure 4.2), ce qui permet de supposer que nous pourrions être en présence chez V. planifolia d’un système similaire impliquant une combinaison transposon/méthylation. Une telle hypothèse pourrait être testée via une approche de type IRAP (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) ou REMAP (REtrotransposon-Microsatellite Amplified Polymorphism) (Kalendar et al., 1999) combinée à une analyse MSAP.
La variation phénotypique du type ‘Mexique’ est stable et héritable de façon végétative, puisque les spécificités morphologiques de ces accessions sont conservées après leur mise en collection ex situ (Figure 4.3). En ce qui concerne ce type ‘Mexique’, nous avons vraisemblablement affaire à une mutation dominante à effet pléiotropique, cette mutation pouvant avoir une origine génétique voire épigénétique. Les méthodes de criblage à haut débit utilisées ici (AFLP, MSAP) n’ont pas permis de détecter cette mutation. Afin de vérifier cette hypothèse, il serait intéressant de procéder à des autofécondations du type ‘Mexique’ ou à des croisements ’Mexique’ x ‘Classique’ pour observer la ségrégation du caractère ‘Mexique’ dans la descendance (avec des proportions attendues respectivement ¾ ‘Mexique’ : ¼ ‘Classique’ ou ½ ‘Mexique’ : ½ ‘Classique’). C’est en effet de cette façon, par exemple, qu’il a été possible de montrer chez Coffea arabica, que le phénotype ‘Bourbon Pointu’ est dû à une mutation simple, récessive, la mutation Laurina, à effet pléiotropique (Krug et Carvalho, 1951; Krug et al., 1954). Une telle mutation n’est pas détectable par AFLP (Lécolier, 2006).
Le cas particulier de la PLm0632, trouvée en plantation à La Réunion, mérite une attention particulière. Il s’agit en réalité d’un type décrit comme ‘petite Mexique’, qui présente une morphologie de type ‘Mexique’ mais avec de petites feuilles. Elle présente par ailleurs un pollen et des fleurs pâles, évoquant sur ce point une ressemblance avec V. bahiana. Cette accession a montré une certaine variabilité génétique dans l’étude AFLP (elle faisait partie du groupe des 19 accessions originales, Chapitre 2, Fig. 2 dans Bory et al. (submitted-b)). Elle présente aussi du polymorphisme de méthylation par rapport aux autres accessions testées. Cette accession (5.18 pg) est donc morphologiquement, génétiquement et épigénétiquement originale et devra dans l’avenir recevoir une attention particulière.

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Table des matières

 DES ABRÉVIATIONS
INTRODUCTION GÉNÉRALE
I. LA VANILLE : DONNEES AGRONOMIQUES
II. LA VANILLE : DONNEES ECONOMIQUES
III. LA VANILLE : INTERET DES RESSOURCES GENETIQUES
IV. PROBLEMATIQUE ET OBJECTIFS DE LA THESE
CHAPITRE 1 : INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
I. PREAMBULE
Article N°1 : Biodiversity and preservation of vanilla: present state of knowledge
Abstract
Introduction
Vanilla taxonomy and phylogeny
Vanilla within the Orchidaceae
Distribution
Taxonomy and phylogeny
The Vanilla genus
The genus organization
Phylogenetic relationships among Vanilla species
The origin of V. tahitensis
Reproductive biology
The reproduction of American vanilla in natural conditions
Inter-specific hybridization
V. planifolia in its area of origin
The history of V. planifolia in Mexico
Vanilla diversity in Mexico
V. planifolia in introduction areas
V. planifolia dissemination from its area of origin
V. planifolia diversity in introduction areas
Phenotypic diversity in Reunion Island
Possible origins of this phenotypic diversity
Preservation of vanilla genetic resources
Conclusions
References
II. CONCLUSIONS DE L’INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
CHAPITRE 2 : ANALYSE GÉNÉTIQUE
I. PREAMBULE
Article N°2 : Patterns of introduction and diversification of Vanilla planifolia (Orchidaceae) in Reunion Island (Indian Ocean)
A2.1. Abstract
A2.2. Introduction
A2.3. Materials and methods
A2.3.1. Plant material and DNA extraction
A2.3.2. AFLP assay
A2.3.3. Data analysis
A2.3.4. Reproducibility
A2.4. Results
A2.4.1. Interspecific AFLP diversity
A2.4.2. Intraspecific AFLP diversity
A2.5. Discussion
A2.5.1. Patterns of introduction of V. planifolia in Reunion Island
A2.5.2. V. pompona: another case of a limited introduction event in Reunion Island
A2.5.3. Patterns of diversification of V. planifolia in Reunion Island
A2.5.4. Perspectives for vanilla breeding
A2.5.5. Conclusions
Acknowledgements
Article N°3 : Development of microsatellite markers in cultivated vanilla: polymorphism and transferability to other Vanilla species
Abstract
1. Introduction
2. Materials and methods
3. Results
4. Discussion
Acknowledgements
References
II. APPORT COMPLEMENTAIRE DES MICROSATELLITES POUR L’ANALYSE GENETIQUE
II.1. Introduction
II.2. Matériel et méthodes
II.2.1. Matériel végétal
II.2.2. Analyse microsatellite
II.3. Résultats
II.3.1. Précisions des résultats de l’analyse AFLP : identification des échantillons inconnus (SP)
II.3.2. Intérêt du marqueur mVplCIR031 pour la phylogéographie
II.4. Discussion
II.4.1. Diversité intraspécifique
II.4.2. Hybrides artificiels
II.4.3. Mise en évidence du rôle de l’hybridation dans l’évolution du genre Vanilla
II.4.4. Accessions restantes non identifiées
II.4.5. Phylogéographie dans le genre Vanilla
III. CONCLUSIONS DE L’ANALYSE GENETIQUE
CHAPITRE 3 : ANALYSE CYTOGÉNÉTIQUE
I. PREAMBULE
Article N°4 : Natural polyploidy in Vanilla planifolia (Orchidaceae)
A4.1. Abstract
A4.2. Introduction
A4.3. Materials and methods
A4.3.1. Plant material
A4.3.2. Determination of DNA content by flow cytometry
A4.3.3. Determination of DNA content by Feulgen microdensitometry
A4.3.4. Determination of chromosome number
A4.3.5. Measurement of stomatal length
A4.3.6. Data analysis
A4.4. Results
A4.4.1. Flow cytometry
A4.4.2. Feulgen microdensitometry
A4.4.3. Determination of chromosome number
A4.4.4. Measure of stomatal length
A4.4.5. Relationship between DNA content, chromosome number and stomatal length
A4.5. Discussion
A4.5.1. V. planifolia 2C DNA content
A4.5.2. Endoreplication
A4.5.3. Somatic aneuploidy
A4.5.4. Polyploidy in V. planifolia
A4.5.5. Impact of polyploidy on morphology
A4.5.6. Origin of polyploidy in V. planifolia
A4.5.7. Conclusion and perspectives
Article N°5 : Vanilla pompona (Orchidaceae) is an ancient polyploid species
A5.1. Abstract
A5.2. Introduction
A5.3. Material and methods
A5.3.1. Plant material
A5.3.2. Cytogenetic analyses
A5.3.3. Morphological analysis
A5.3.4. Data analysis
A5.4. Results
A5.4.1. Flow cytometry
A5.4.2. Determination of chromosome number
A5.4.3. Measure of stomatal length
A5.4.4. Morphological analysis
A5.4.5. Hierarchical clustering of V. pompona accessions
A5.5. Discussion
A5.5.1. 2C DNA content in V. pompona
A5.5.2. Somatic aneuploidy and chromosome numbers in V. pompona
A5.5.3. V. pompona: a polyploid species
A5.5.4. Two groups (genetic, phenotypic, and cytogenetic) are revealed in V. pompona
A5.5.5. Different behaviour between V. planifolia and V. pompona
A5.5.6. Conclusion and perspectives
II. ANALYSE CYTOGENETIQUE DES AUTRES ESPECES DU GENRE VANILLA
II.1. Introduction
II.2. Matériel et méthodes
II.2.1. Matériel végétal
II.2.2. Analyses cytogénétiques
II.2.3. Analyse des données
II.3. Résultats
II.3.1. Cytométrie en flux
II.3.2. Détermination du nombre chromosomique
II.3.3. Relation entre nombre chromosomique et quantité d’ADN nucléaire
II.4. Discussion
II.4.1. Aneuploidïe somatique et nombre chromosomique dans le genre Vanilla
II.4.2. Quantité d’ADN nucléaire dans le genre Vanilla
II.4.3 Polyploïdie dans le genre Vanilla
III. RESULTATS COMPLEMENTAIRES PRELIMINAIRES DE L’ANALYSE CYTOGENETIQUE  COMPTAGES CHROMOSOMIQUES, VIABILITE ET GERMINATION AU NIVEAU DU POLLEN
III.1. Introduction
III.1.1. Formation des grains de pollen
III.1.2. Mécanismes d’autostérilité
III.2. Matériel et méthodes
III.2.1. Observation préliminaire des chromosomes dans le pollen
III.2.2. Viabilité des grains de pollen
III.2.3. Evaluation du pouvoir germinatif
III.2.4. Analyse des données
III.3. Résultats
III.3.1. Observation préliminaire des chromosomes sur pollen
III.3.2. Viabilité des grains de pollen
III.3.3. Evaluation du taux de germination
III.4. Discussion
III.4.1. Observation des chromosomes dans le pollen
III.4.2. Influence de la triploïdie sur la viabilité pollinique
IV. CONCLUSIONS DE L’ANALYSE CYTOGENETIQUE
CHAPITRE 4 : ANALYSE ÉPIGÉNÉTIQUE
I. INTRODUCTION
II. MATERIEL ET METHODES
II.1. Matériel végétal et extraction d’ADN
II.2. Analyse MSAP
II.3. Analyse des données
III. RESULTATS
IV. DISCUSSION ET CONCLUSION
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
I. CONCLUSIONS
II. PERSPECTIVES
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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