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Génétique, épigénétique et cancer
Des données épidémiologiques et expérimentales permettent d’estimer qu’une dizaine d’évènements géniques sont nécessaires aux développements des carcinomes (Nowell, 1976 & Sjoblom et al., 2006 in Stoppa-lyonnet et al., 2010). La coïncidence d’autant d’anomalies génétiques dans une même cellule est incompatible avec notre estimation du taux d’erreur dans le génome humain par mitose (Loeb, 2001). L’acquisition du phenotype tumoral est donc intimement liée à l’augmentation de l’instabilité genetique qu’elle soit d’origine extrinsèque par exposition à des agents physiques ou chimiques ou d’origine intrinsèque par anomalies des très nombreuses voies de métabolisme des mutagènes et de réparation du génome. Une grande partie de la recherche actuelle a pour objectif d’identifier dans les différents cancers les gènes mutés ou dont l’expression est modifiée. L’identification récente de centaines de milliers de variations génétiques nucléotidiques dispersées sur l’ensemble du génome (SNP : single nucleotide polymorphism) et de régions dont le nombre de répétitions est variable dans la population (CNV : copy number variation) associée au developpement de technologies d’analyse haut débit permettant l’étude de plus de 500000 SNPs et de CNV sur une puce d’un cm2 et la nouvelle génération de séquenceurs d’ADN (NGS) permettent d’avoir une vision exhaustive et sans hypothèses a priori de l’ensemble des modifications des cellules tumorales. L’une des difficultés de l’analyse de ces masses de données est cependant de repérer les mutations qui ont un impact sur le processus tumoral parmi les mutations dites « passager », simples témoins de l’exposition de la cellule aux agents mutagènes et aux erreurs de replication de l’ADN (Sjoblom et al., 2006). En 2010, plus de 400 gènes impliqués dans l’oncogenèse ont été recensés par le Sanger Center dans le cadre du projet Cancer Génome Project (Futreal et al., 2004 in Stoppa-lyonnet et al., 2010) (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census/). L’épigénétique est définie comme « l’étude des modifications de l’expression des gènes qui sont transmissibles lors de la mitose et/ou la méiose, mais ne découlent pas de modifications dans la séquence de l’ADN ». Si l’étude des causes génétiques du cancer (mutations, amplification ou perte de matériel chromosomique, translocations récurrentes) a longtemps occupé le devant de la scène, l’explosion récente des connaissances sur les acteurs moléculaires et les mécanismes sous-jacents qui, en modulant la structure de la chromatine, contrôlent l’expression des gènes a révélé le rôle prépondérant joué par des modifications èpigénètiques dans le déclenchement et la progression de nombreuses maladies, en particulier des cancers (Wollfe & Matzke, 1999 in Deltour et al.,2005). Un cancer se développe lorsqu’une cellule acquiert des avantages de croissance spécifiques grâce à l’accumulation progressive de changements héréditaires dans la fonction génique. Puisque plusieurs modifications sont habituellement exigées pour qu’un cancer se développe pleinement, le phénotype malin est déterminé par le statut composé des gènes suppresseurs de tumeur et des oncogènes. Les gènes du cancer peuvent être modifiés par plusieurs mécanismes, qui peuvent modifier le modèle de nucléotide codant la protéine, modifier le nombre de copies de gènes ou conduire à une transcription accrue des gènes. Les altérations èpigénètiques, qui, par définition, comprennent des changements mitotiques et méiotiques dans l’expression des gènes qui ne sont pas causés par des changements dans la séquence d’ADN primaire, sont de plus en plus reconnues pour leurs rôles dans la carcinogenèse. (Grønbæk et al., 2007). Notre compréhension du cancer humain et notre capacité à traiter et à l’empêcher, dépend de façon critique de la connaissance des mécanismes et les voies de l’évolution tumorale. Il est devenu évident que les changements génétiques et épigénétiques sous-tendent la tumeur (Jones & Baylin, 2002 in Bielas 2006).
EXEMPLE DU CANCER DU SEIN
Types de cancer du sein
La classification histopathologique des cancers du sein repose sur la diversité des caractéristiques morphologiques des tumeurs. Dans sa version actuelle qui a été approuvée par l’OMS en 2003 (Tavassoéli & Devilee, 2003), il comprend quelques 20 grands types de tumeurs et 18 sous types mineurs. Cette classification est adoptée dans le monde entier. La plupart des noms donnés dépendent de la région mammaire où les cellules cancéreuses ont débuté leur prolifération. Le carcinome canalaire est le type le plus fréquent et provient de cellules canalaires. Le carcinome lobulaire est un autre type qui prend naissance dans les lobules. Si le cancer reste dans la zone canalaire ou lobulaire, il est dit carcinome non-invasif ou in situ. A l’inverse, si la tumeur s’étend au tissu conjonctif en traversant la membrane basale, le carcinome est dit invasif ou bien infiltrant. Parmi tous les types invasifs, certains sont dits de bon pronostic : les carcinomes tubuleux, muscinaux, adénoïde kystiques et cribriformes infiltrants. Les types les plus fréquents sont les carcinomes infiltrants de type non spécifique (70 à 80%) et les carcinomes lobulaires infiltrants (5 à 15%). Les carcinomes médullaires, micropapillaires infiltrants, sécrétant juvéniles et apocrines infiltrants sont rares. Les types les plus rares sont les carcinomes à cellules claires riches en glycogène, les carcinomes à cellules riches en lipides, les carcinomes à cellules en bague à chaton, les tumeurs neuroendocrines, les carcinomes à cellules géantes ostéoclastiques et les carcinomes à cellules acineuses, à cellules oncocytaires, sébacé, avec aspects choriocarcinomateux ou mélanocytaires. Un inconvénient majeur de cette classification est que près de 70% à 80% des cancers du sein finissent par appartenir à l’une des deux principales catégories histopathologique, à savoir carcinomes canalaires invasifs (IDC) ou carcinome lobulaire invasif (ILC). (Amal et al., 2013)
Epidémiologie du cancer du sein
Sur le plan international, le cancer du sein est le cancer le plus fréquemment rencontré chez la femme. Il a été le premier cancer dans le monde jusqu’à 2008 les dernières statistiques l’ont classé en deuxième position avec un taux d’incidence de 23,8 par 100.000 personne et un taux de mortalité qui avoisine les 20,4 par 100.000 Le cancer du sein est rare chez les femmes de moins de 25 ans, et atteint sa fréquence maximale entre l’âge de 50 ans et 75 ans. On peut admettre qu’une femme sur 10 est susceptible d’être touchée par le cancer du sein au cours de sa vie. L’incidence du cancer mammaire a certes augmenté de 10 à 15 % depuis 25 ans. Néanmoins, l’étude des courbes de mortalité montre que si celle-ci augmente pour l’ensemble des femmes de 35 à 74 ans, au contraire une baisse de la mortalité pour les femmes de 35 à 49 ans depuis 1981 est remarquée. Deux explications en découlent, la première est le diagnostic qui est devenu de plus en plus précoce grâce au dépistage et à la sensibilisation de la population, ainsi qu’à l’évolution des thérapies anticancéreuses (Youlden et al., 2012).
Facteurs de risques
Le cancer du sein est le cancer le plus diagnostiqué dans le monde avec plus d’un million de cas recensés par an et la deuxième cause de mortalité chez les femmes. Âge, antécédents familiaux, ménarches précoce, ménopause tardive, nulliparité, l’âge avancé au premier âge complet de la grossesse et l’utilisation de remplacement hormonal (HRT) sont des facteurs de risque bien établis pour le développement cancer du sein (McPherson et al., 2000 in Turkoz 2013). Il a été suggéré que les facteurs de risque qui sont associés au récepteur d’œstrogène (ER) et de progestérone (PR) dans les tumeurs mammaires positives impliquent des mécanismes liés à l’exposition aux hormones endogènes, alors que l’étiologie de ER et de PR dans les cancers du sein négatifs peuvent être non hormonaux (Huang et al., 2000, Britton et al., 2002 & Kwan et al., 2009 in Turkoz 2013). Le cancer du sein se caractérise par son hétérogénéité. Certains auteurs suggèrent dans leur étude que les menstruations et l’activité génitale ne joueraient pas de rôle majeur dans la survenue des cancers familiaux du sein (Parazzini et al., 1992 in Dem 2008). Comme la plupart des cancers, le cancer du sein est une maladie multifactorielle et complexe. Des études scientifiques ont montré que certaines caractéristiques propres à la personne ainsi que des comportements individuels étaient plus souvent observés chez les femmes ayant eu un cancer du sein que chez les autres femmes. Les femmes présentant l’une des caractéristiques, appelés facteurs de risque, ont ainsi un risque plus élevé que les autres de développer un jour un cancer du sein. Les facteurs de risque établis pour le cancer du sein incluent: les facteurs endogènes, c’est-à-dire constitutifs des individus ou exogènes, liés à l’environnement et aux modes et conditions de vie (Amal et al., 2013).
Aspects morphologiques
Le sein est une glande exocrine qui se développe au cours de la vie de la femme. L’épithélium mammaire est organisé en bicouche et comprend une couche de cellules luminales sécrétoires et une couche de cellules basales myoépithéliales (Faraldo et al., 2006). Plusieurs types de cellules épithéliales peuvent être trouvés dans la glande mammaire. Tout au long de la puberté et de la grossesse, il semble y avoir des types de cellules uniques sans aucun doute liés aux fonctions mammaires à ces phases de développement. Les cellules du corps, en revanche, remplissent l’intérieur du bourgeon final. Les adipocytes remplis de graisse constituent une grande proportion de la graisse stromale dans la glande adulte et non allaitante. Les adipocytes servent également une fonction endocrinienne dans la glande : on pense qu’ils régulent la croissance épithéliale et la fonction d’épithélium mammaire, aussi bien que pour communiquer avec d’autres types de cellules dans la glande mammaire (Bartley et al., 1981 & Hovey et Aimo 2010 in Inman 2015). À titre d’exemple, les adipocytes sécrètent le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) et régulent probablement l’angiogenèse dans la glande mammaire (Hovey et al., 2001). Les fibroblastes stromaux sont incorporés dans le tampon de graisse et se trouvent souvent à proximité du côté basal de l’arbre épithélial de branchement (Muschler et Streuli, 2010 & Sakakura 1987 in Inman 2015). Les fibroblastes servent de nombreuses fonctions, dont la communication bidirectionnelle avec l’épithélium pendant la morphogenèse de branchement, fournissant l’instruction sous forme de facteurs de croissance, de protéases et d’autres éléments (Howard et Lu, 2014). En outre, les fibroblastes sont considérés comme les principaux intendants de l’ECM (Matrix Extra-Cellulaire) mammaire : ils synthétisent un certain nombre de composants tels que les collagènes, les protéoglycanes et la fibronectine. En tant que telle, ces cellules peuvent regrouper les dispositifs épithéliaux de cellules et le phénotype épithélial de cancer en modifiant la composition ou la densité d’ECM (Lühr et al., 2012 in Inman 2015).
a. Anatomie de la glande mammaire humaine.
b. Chaque canal est garni d’une couche de cellules épithéliales, responsables de la production du lait. Ceux-ci sont entourés d’une couche extérieure de cellules myoépithéliales avec des propriétés
contractiles. Les conduits glandulaires sont intégrés dans le stroma des fibroblastes. c. Cette structure se décompose dans le cancer du sein donnant naissance à une masse cellulaire épithéliale b et c. Le marquage immunohistochimique par des anticorps spécifiques au récepteur des œstrogènes (ER; noyaux taches brunes), montre que seule une petite proportion de cellules épithéliales sont ER positif dans le tissu normal du sein.
Cancer du sein : une maladie génétique et génomique hétérogène
Le cancer du sein est une maladie génétique et génomique hétérogène qui se développe le long d’un continuum. Il est unanimement considéré comme une maladie très hétérogène. En effet, différents types de ces néoplasmes présentent des caractéristiques histopathologiques et biologiques variables, des résultats cliniques différents et une réponse différente aux interventions systémiques. Basé sur un tel degré d’hétérogénéité, le cancer du sein ne peut être considéré comme une seule entité clinico-pathologique, mais il faut nécessairement le subdiviser en un certain nombre d’entités plus homogènes (Amal et al., 2013). On décrit actuellement deux types d’hétérogénéité tumorale dans le cancer du sein : intertumorale et intratumorale. La physiopathologie de l’hétérogénéité intratumorale n’est pas encore claire, cependant les études sur les cellules souches cancéreuses et sur les modèles d’évolution clonale semblent pouvoir contribuer à la compréhension des mécanismes à l’origine de cette hétérogénéité. De plus, le microenvironnement tumoral semble contribuer activement à cette hétérogénéité. Ainsi, l’intérêt d’étudier cette hétérogénéité est la réelle application clinique qui pourrait en découler. Alors que se développe une médecine de précision, il est important de s’approprier l’hétérogénéité spécifique de chaque tumeur. Ces nouvelles connaissances biologiques nous permettront d’anticiper cette hétérogénéité et personnaliser la prise en charge des cancers du sein (Roulot, 2016).
CANCER DU SEIN ET ANTECEDENTS FAMILIAUX
De nombreuses études épidémiologiques soulignent que les antécédents familiaux de cancer du sein est un facteur prédictif reproductible du risque de cancer du sein. L’existence de cancers du sein héréditaires a été mise en évidence par le fait qu’une fraction des cancers présente une certaine agrégation familiale (Palmer et al., 2009). Lorsque l’histoire familiale suggère une prédisposition héréditaire, les familles sont décrites comme ayant un cancer familial. Les rapports indiquent que les cancers du sein héréditaires sont responsables de 4-10% de carcinomes de sein (Tavassoéli et Devilee, 2003 & Sorlie et al., 2003, & Rouzier R, et al., 2005 in Amal 2013). Les gènes de prédisposition au cancer peuvent être classés en fonction de leur risque relatif pour un type particulier de cancer. Les gènes dits à haute pénétrance (BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN, STK11, CDH1) sont associés à un risque relatif de cancer supérieur à 5, alors que, les gènes de faible pénétrance (MAP3K1, FGFR2, LSP1, TNRC19, H19) sont associés avec un risque relatif d’environ 1,5, tandis que les gènes à pénétrance intermédiaire (CHEK2, PALB2, ATM, BRIP1, RAD51C, XRCC2, NBS1, RAD50, MRE11, BARD1, ABRAXAS, RAD21D) confèrent des risques relatifs de cancer de 1,5 à 5 (Amal et al., 2013). Cancer héréditaire du sein survenant chez les porteurs de mutations des gènes BRCA1 et BRCA2 diffèrent des gènes sporadiques cancer et des carcinomes du sein non-BRCA1/2.
La plupart des carcinomes BRCA1 ont le phénotype basal et sont de haute qualité, très proliférant, récepteur-négatif d’œstrogène et les carcinomes mammaires HER2-négatifs, caractérisés par l’expression de marqueurs basales tels que les kératines basales, P-cadherine et le récepteur du facteur de croissance épidermique. Carcinomes BRCA1 portent fréquemment des mutations p53. Le phénotype basal ne se trouve que de temps en temps dans les carcinomes BRCA2, qui ont tendance à être positifs aux récepteurs d’œstrogènes et de progestérone. (Palacios et al., 2008).
GENOME MITOCHONDRIAL ET CANCEROGENESE
Les mitochondries sont des organelles fonctionnant de manière semi-autonome, contenant leur propre génome dont elles sont capables d’assurer la réplication et la transcription (Anderson et al., 1981 & Taanman, 1999 in Lievre 2005). Elles sont responsables de plus de 90 % de la production d’ATP (Adénosine Triphosphate) cellulaire au travers du processus de phosphorylation oxydative. L’ADNmt est un ADN bicaténaire et circulaire de 16 569 paires de bases (pb), comprenant 37 gènes codant pour 13 polypeptides de la chaîne respiratoire mitochondriale (le complexe I de la NADH déshydrogénase constitué de 7 sous-unités ND1 à ND6 et ND4L, le complexe III du cytochrome b, le complexe IV du cytochrome c oxydase constitué de 3 sous-unités COI à COIII et le complexe V des ATP synthase 6 et 8), ainsi que pour 22 ARN de transfert (ARNt) et 2 ARN ribosomiaux (ARNr) nécessaires à la synthèse de ces polypeptides dans la mitochondrie. Il a la particularité de se répliquer en utilisant deux points d’origine de réplication différents pour chaque brin d’ADNmt (le brin lourd, riche en purines et le brin léger, riche en pyrimidines) (Clayton 1982 & Howell 1999 in Lievre 2005). Le génome mitochondrial est caractérisé par l’absence quasi-complète d’introns. En effet, la très grande majorité de ce génome est impliquée dans la synthèse des ARN messagers donnant lieu à la synthèse des protéines de la chaîne respiratoire, des ARNt et des ARNr. Seule une région contrôle de 1121 pb (position nucléotidique: 16024-576), la D-Loop (Displacement-Loop) est non codante (Lievre ,2005). Des mutations dans l’ADN mitochondrial (ADNmt) ont été trouvées dans plusieurs maladies, y compris les cancers. Des études sur les hybrides cytoplasmiques (cybrides) confirment que la mutation dirigée introduite dans l’ADNmt pourrait être une raison pour l’induction du cancer. Les mitochondries pourraient également être un facteur liant la transformation et la progression du cancer. L’importance des mitochondries dans le cancer confirme également leur implication dans la résistance au traitement. La résistance au traitement des cellules cancéreuses peut souvent être une raison pour l’accélération de la glycolyse. Cela pourrait s’expliquer par l’indice de prolifération élevé des cellules cancéreuses et la demande d’énergie élevée. La participation des mitochondries dans les perturbations métaboliques de plusieurs maladies métaboliques, y compris les cancers, a été rapportée. Ces relations multiples entre les altérations au niveau génétique se sont traduites par des perturbations dans le métabolisme cellulaire et leur relation potentielle avec le contrôle épigénétique de l’expression génique rendent la cancérogenèse plus compliquée et le succès des pronostics dans les études sur l’étiologie du cancer plus éloigné dans le temps (Malgorzata Rogalinska ,2016).
ETUDE GENETIQUE
Extraction d’ADN
Extraction
L’ADN total des tissus est extrait grâce à la méthode Standard Qiagen (Kit Qiagen Dneasy Tissue) et par la méthode du direct PCR.
Avec le Kit Qiagen, les tissus sont broyés dans 180 μl de tampon de digestion (ATL) contenant des détergents qui entraine une dissociation des tissus et une individualisation des cellules. 20 μl de protéinase K sont ajoutés pour dégrader toutes les protéines, après une incubation à 55°C pendant 3h. Les débris tissulaires sont éliminés après centrifugation rapide et récupération du surnagent. A cette solution, 200 μl de tampon de lyse cellulaire (AL) sont ajoutés puis un passage immédiat au vortex et incubation pendant 10 minutes à 70°C. La phase suivante consiste à ajouter 200μl d’éthanol absolu 96-100%, à vortexer et à transvaser le mélange obtenu sur une colonne que nous avons placé au préalable sur un tube collecteur de 2 ml (fourni dans le Kit), puis à centrifuger à 1361,35688 radian/seconde pendant une minute pour retenir l’ADN au niveau de la membrane de la colonne. En effet, l’ADN chargé négativement se fixe, par interactions ioniques, sur la membrane de silice chargée positivement. Par contre les protéines, les lipides et les polysaccharides sont éliminés. L’ADN fixé sur la colonne est ensuite purifié pour éliminer toutes traces de contaminant. Ce lavage est réalisé par ajout successif de 500 μl de chacun des 2 tampons (AW1 et AW2) qui passent à travers laBmembrane par centrifugation à 1361,35688 radian/seconde pendant respectivement 1 et 3 minutes. 200 μl de tampon AE au préalable incubé à 70°C pour augmenter le rendement de 15 à 20% est directement versé sur la membrane que nous avons placée sur un tube de 1,5 ml pour recueillir l’ADN. Juste après cette étape l’ADN est conservé à -20°C.
Avec le direct PCR, contrairement au Kit Qiagen les tissus sont broyés dans 200 μl de tampon direct PCR Lysis Reagent ; ensuite 20 μl de protéinase K sont ajoutés pour dégrader les protéines ; après une incubation à 55 °C pendant toute une nuit. Elle est suivie, d’une autre incubation à 85°C pendant 45 minutes. Il s’en suit une centrifugation à 1361,35688 radian/ seconde pendant 1 minute. A ce niveau l’ADN est prêt à l’emploi. Il est important de signaler, qu’avec le direct PCR, un enchainement de l’extraction, suivie d’une PCR permet d’avoir une amplification. Car, pendant le refroidissement il se produit d’autres réactions.
Migration électrophorétique : Préparation et dépôt des échantillons
L’électrophorèse consiste à séparer des fragments d’ADN en fonction de leur taille par migration dans une matrice solide appelée gel d’agarose soumis à un champ électrique. La molécule d’ADN ayant une charge négative va migrer sous l’effet du champ électrostatique vers l’anode. La distance parcourue, mesurée à partir des puits de dépôt, dépendra de la taille de chaque fragment. De ce fait, plus la taille du fragment est importante moins grande sera la distance parcourue et vice-versa. Les échantillons, 7μl d’extraits d’ADN + 3μl de bleu de bromophénol (bleu de charge), seront déposés sur un gel d’agarose de 1,5 % et migrés à 100 voltes pendant 30 à 35 minutes. L’ADN migré est révélé dans une chambre noire sous UV après passage dans un bain de Bromure d’Ethidium BET. La taille de l’ADN est évaluée approximativement à l’aide d’un marqueur de taille SmartLadder 200pb. Le gel est préparé avec 1,5 gramme d’agarose que l’on ajoute à 100 ml de solution TAE 0,5X.
Amplification en chaine par polymérase du Cytochrome b
La PCR est une méthode permettant l’amplification d’une courte séquence d’ADN appelée séquence cible, à partir d’une infime quantité d’ADN génomique. Elle consiste à une amplification sélective in vitro d’une séquence particulière d’ADN matrice par extension de deux amorces par une ADN polymérase, en présence de désoxyribonucléotides (dNTP) et d’ions Mg 2+. Nous avons amplifié le Cyt.B qui présente beaucoup d’intérêts. Le Cyt.B est une région de plus d’un millier de paires de bases du génome mitochondrial, situé en positions 14201 et 15341 dans la séquence humaine (Anderson, 1981), possède un taux de recombinaison faible (lié à son hérédité exclusivement maternelle) et présente une variabilité relativement élevée malgré qu’il s’agisse d’une séquence codante, ce qui justifie le choix de ce marqueur. L’amplification est réalisée dans un volume réactionnel de 50 μl contenant 28,9 μl d’eau MilliQ, 5 μl de Tampon (10X) qui contient des ions Mg2+ à une concentration initiale de 15 mM, 2 μl de dNTP, 5 μl de chaque amorce qui sont : H15915 (TCT-CCA-TTT-CTG-GTT-TAC-AAG-AC) et L14723 (ACC-AAT-GAC-ATG-AAA-AAT-CAT-GGT-T), 0,1μl de Taq polymérase et de 4 μl d’extrait d’ADN. L’amplification est effectuée par une répétition de cycles qui assure une multiplication par deux, de l’ADN cible à chaque cycle (240). La PCR a lieu dans un thermocycleur de type Eppendhorf dans les conditions suivantes : dénaturation préliminaire à 94°C(3 minutes), suivie d’une répétition de 40 cycles de dénaturation initiale à 92°C (45 secondes), d’hybridation à 50°C (1 minute) et d’élongation des brins d’ADN complémentaire à 72°C pendant (1 minute 30s) et est bouclée par une élongation finale (10 minutes).
Séquençage du Cytochrome b
Cette technique consiste à déterminer la séquence en nucléotides d’un fragment d’ADN. Elle permet en comparant les séquences d’un même gène chez différents individus de la même espèce ou d’espèces différentes, de mettre en évidence des mutations ponctuelles, mais également des insertions ou des délétions. La méthode utilisée aujourd’hui, proposée par F. Sanger en 1977, repose sur l’utilisation de nucléotides particuliers appelés didésoxyribonucléotides, qui bloquent la synthèse d’ADN par les ADN polymérases après leur incorporation. En d’autres termes, c’est une réaction de PCR particulière utilisant, en plus des composés habituels (ADN matrice, polymérase, amorces, dNTP, Mg2+), des nucléotides modifiés : les didésoxyribonucléotides (ddNTP). Ces ddNTPs ont la particularité d’être couplés à des fluorochromes : ddATP-vert, ddTTP-rouge, ddCTP-bleu et ddGTP-jaune (en noir sur l’électrophorègramme) (Figure 6). Ce blocage est dû à l’impossibilité qu’ont ces nucléotides de former une liaison phosphodiester avec un autre nucléotide en raison de l’absence du groupement hydroxyle sur le carbone 3’. Le séquençage a été réalisé dans la ville de Séoul en Corée du Sud par une société Américaine nommée Macrogen à partir de 30 μl du produit PCR et dans un seul sens.
ANALYSES MOLECULAIRES
Pour déterminer la présence d’une quelconque mutation ainsi que la position de cette dernière par rapport au gène Cyt.B, les données brutes du séquençage ont été soumises au logiciel BioEdit version 7.2.2 (Hall, 1999).
Les séquences obtenues ont été minutieusement vérifiées, nettoyées, et alignées pour déterminer les homologies des sites entre autres mais également pour pouvoir effectuer les autres analyses phylogénétiques dont la détermination des indices de variabilité et de diversité génétique, des paramètres de différenciation génétique, des taux de mutations ainsi que des tests démo-génétiques. Les mutations retrouvées chez nos patientes ont été comparées à celles retrouvées chez les patientes témoins pour voir s’il existe une quelconque expression différente du gène Cyt.B.
Les paramètres de la variabilité génétique correspondent en quelque sorte à la carte d’identité de notre jeu de données. Ces paramètres dont le nombre de sites polymorphes, le nombre total de mutations, le nombre moyen de différence nucléotidique, la nature des mutations (% de transitions et de transversions), le test de sélection, la composition en acides aminés ainsi que les diversités haplotypique et nucléotidique pour chacune de nos populations d’étude ont été obtenus grâce au logiciel DnaSP version 5.10 (Librado et Rozas, 2009) et MEGA version 6.06 (Tamura et al., 2013).
Le test de sélection ainsi que les fréquences en acides aminés ont été déterminés pour le Cyt.B car s’agissant d’une région codante. Le test Z de sélection a été évalué en choisissant comme hypothése de départ, le fait que la séquence codante soit sous sélection positive. Cette hypothése stipule que les mutations non synonymes sont supérieures aux mutations synonymes (dN > dS). Une valeur de P < 0,05 a été considérée comme significative.
Les fréquences en acides aminés quant à elles ont été obtenues en transformant les séquences nucléotidiques à partir du 1er nucléotide débutant la séquence du Cyt.B et en utilisant le meilleur cadre de lecture (cadre avec lequel on n’obtient pas ou moins de codons stops).
L’estimation de la différenciation génétique requiert en ce qui nous intéresse dans cette étude, deux indices : les distances génétiques de Nei, intra et inter-populations, obtenues avec le logiciel MEGA version 6.06 (Tamura et al., 2013) et les Fst (facteur de différenciation génétique) obtenus avec le programme Arlequin version 3.5.1.3 (Excoffier et al., 2010).
Dans cette étude, nous avons tenu en compte la grandeur de Fst qui donne les valeurs de degré de différenciation entre les TS et les TC. Une valeur de P < 0,05 a été considérée comme significative.
Nous avons également déterminé l’analyse de la disparité de distribution (Mismatch distribution), qui est la représentation graphique de la distribution de distances génétiques existant entre les individus d’une population. L’analyse de Mismatch s’accompagne de deux indices qui testent la qualité d’ajustement de la distribution. Ces indices sont la SSD (somme de carrées des déviations) et le Raggedness (indice d’irrégularité Rag). Le graphe pour la tumeur maligne du sein a été construit avec le logiciel DnaSP version 5.10 (Librado et Rozas, 2009) et les indices SSD et Rag ont été obtenus avec le programme Arlequin version 3.5.1.3 (Excoffier et al., 2010).
RESULTATS ET DISCUSSION
RESULTATS
L’objectif de cette étude est d’évaluer le profil génétique du cancer du sein, afin de déterminer la pénétrance du gène Cyt.B dans les tumeurs malignes du sein chez la femme Sénégalaise notamment ceux reçues à l’hôpital Aristide le Dantec. Nous avons ainsi analysé par PCR-Séquençage la variabilité du gène Cyt.B chez 70 individus dont 35 séquences provenant des prélèvements de tissus sains et 35 séquences provenant des prélèvements de tissus cancéreux. Les résultats sont comparés non pas en termes d’épidémiologie mais en termes d’évolution mutationnelle concernant témoins et tissus. Les facteurs à risque de cancer mammaire, qui comprenaient l’exposition antérieure à traitement hormonal, les antécédents familiaux, l’obésité, l’ethnie, l’âge n’ont pas été pris en compte lors de nos traitements de données.
MUTATIONS, FREQUENCE DES MUTATIONS, CODON CORRESPONDANT
L’analyse des séquences nucléotidiques révèle la présence de mutation du gène Cyt.B au niveau des tissus sains et des tissus cancéreux. Les mutations observées aux niveaux des tissus cancéreux révèlent des mutations avec des fréquences faibles et d’autres avec des fréquences assez importantes. Quelques-unes des mutations présentent au niveau des tissus cancéreux sont indiqués dans le tableau I ci-dessous.
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Table des matières
INTRODUCTION
CHAPITRE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I.1. HISTOIRE NATURELLE DES CANCERS
I.1.1. Description
I.1.2. Typologie
I.1.3. Génétique, épigénétique et cancer
I.2. EXEMPLE DU CANCER DU SEIN
I.2.1. Types de cancer du sein
I.2.2. Epidémiologie du cancer du sein
I.2.3.Facteurs de risques
I.2.2. Aspects morphologiques
I.2.3. Cancer du sein : une maladie génétique et génomique hétérogène
I.3. CANCER DU SEIN ET ANTECEDENTS FAMILIAUX
I.4. GENOME MITOCHONDRIAL ET CANCEROGENESE
CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES
II.1. POPULATION D’ETUDE
II.2. ETUDE GENETIQUE
II.2.1. Extraction d’ADN
II.2.2. Amplification en chaine par polymérase du Cytochrome b
II.2.3. Séquençage du Cytochrome b
II.3. ANALYSES MOLECULAIRES
CHAPITRE III : RESULTATS ET DISCUSSION
III.1.RESULTATS
III.1.1. MUTATIONS, FREQUENCE DES MUTATIONS, CODON CORRESPONDANT
III.1.2. INDICES DE VARIABILITE ET DE DIVERSITE GENETIQUE
III.1.3. STRUCTURE GENETIQUE
III.2. DISCUSSION
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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