Amplification des EST chez les géniteurs

Amplification des EST chez les géniteurs

Extraction d ’ADNgénomique

L’extraction d’ADN génomique a été réalisée à partir de feuilles séchées suivant le protocole de Saghaï-Maroof et al. (1984). Pour chaque individu, 100 mg de feuilles séchées sont broyées en présence d’azote liquide. La poudre obtenue est incubée lh à 65°C en présence de 1,3 ml de tampon d’extraction stérile (Nacl 1,4M, Tris HCL 0,1M pH8, EDTA 0,02M, ATMAB 20g/L), 0,1 % de mercaptoéthanol et 1% de polyvinylpyrrolidone. Après refroidissement des tubes à l’air libre, 400 pl de dichlorémathane sont ajoutés. Les extraits sont mis en agitation douce pendant 10 min à 3000 g (6000T/min). Le surnageant est prélevé et cette étape est effectuée 2 fois. L’ADN génomique est alors précipité à froid par ajout de 500 ja.1 d’isopropanol glacé et de 7 pi de NaCl 5M

Caractéristiques des EST étudiées

Les séquences de gènes utilisées sont des EST (Expressed sequence tag) développées chez E. gunnii par le CNRS de Toulouse (Paux, 2004). Ces gènes surexprimés dans le xylème chez E. gunnii ont été isolés par les techniques d’hybridation soustractive suppressive (SHH). Les techniques de cDNA array et RT-PCR ont permis l’analyse de leurs niveaux d’expression. De cette étude 224 EST indépendantes ont été identifiées. Ces EST correspondent à différentes catégories fonctionnelles en fonction des standards MIPS (inconnu, métabolisme, énergie, croissance cellulaire et division, transcription, métabolisme, transport, biogénèse cellulaire, transduction du signal, stress).

Amplification des EST par PCR dirigée

Les paires d’amorces spécifiques de chaque EST ont été définies avec le logiciel OLIGO 4.0 (Rychlik et al., 1990). Pour chacune des EST, les séquences des amorces sont spécifiques à la séquence disponible d’E. gunnii et ont été préalablement testées sur E. globulus. Ces amorces ont une taille d’environ 20 nucléotides. Afin de faciliter la mise en évidence du polymorphisme, les amorces ont été définies de manière à amplifier des fragments d’au minimum 100 pb

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Table des matières

1) INTRODUCTION
2) MATERIEL et METHODES
2.1 – Matériel végétal
2.2 – Caractéristiques des EST étudiées
2.3 – Amplification des EST par PCR dirigée
2.4 – Mise en évidence du polymorphisme
2.4.1 – Séquençage
2.4.2 – Révélation du polymorphisme par PCR en temps réel
2.4.3 – Révélation du polymorphisme par la technique SSCP
2.4.3.1 – La SSCP sur LI-COR
2.4.3.2 – La SSCP sur séquençeur ABI
2.5 – Cartographie génétique des EST polymorphes
3) RESULTATS
3.1 – Amplification des EST chez les géniteurs 9.21 et 14.144
3.2 – Mise en évidence de la variabilité chez les parents
3.3 – Mise en évidence du polymorphisme chez les descendants
3.3.1 – La technique PCR en temps réel pour le génotypage haut débit
3.3.2 – Génotypage par SSCP sur LI-COR et SSCP sur ABI
3.3.2.1 – Premiers tests effectués pour la SSCP sur LI-COR et ABI
3.3.2.2 – Sélection des EST polymorphes par SSCP sur LI-COR
3.3.2.3 – Génotypage des EST polymorphes sur la descendance E. urophylla x E. grandis
3.4 – Localisation des EST polymorphes sur les cartes génétiques
4) DISCUSSION
-La conservation des séquences entre espèces
-La PCR en temps réel
-La SSCP sur LI-COR et ABI
-La cartographie d’EST
5) CONCLUSION ET PERSPECTIVES
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES