Soutenance mémoire
Adhésion Cellulaire
Les organismes multicellulaires sont construits à partir d’ensembles coopératifs, les tissus, dont deux des principaux composants sont les cellules et un réseau de polymères, la matrice extracellulaire, qui assure le soutien mécanique de l’ensemble. Chez les vertébrés, ces tissus peuvent être par exemple conjonctifs, musculaires, nerveux ou épithéliaux . Que l’on considère les situations physiologiques de l’organisme sain (fécondation, prolifération, différenciation, migration, activation) ou celles relatives à l’organisme malade (formation de métastases cancéreuses, invasion d’un tissu par un agent pathogène, thromboses, inflammation, réaction de l’organisme vis-à-vis des biomatériaux), le phénomène d’adhésion cellulaire apparaît comme un processus fondamental permettant un très haut degré d’organisation et de coordination à la fois spatiale et temporelle de ces tissus, nécessaires au bon fonctionnement de l’ensemble. Cette adhésion cellulaire est contrôlée par la présence et la modulation dynamique d’interactions spécifiques [18, 118] entre les membranes extérieures des cellules. La spécificité est induite par des molécules membranaires spécialisées qui peuvent s’associer entre elles par complémentarité géométrique et physico-chimique – On les appelle molécules d’adhésion, ou Cell Adhesion Molecules (CAMs)). De manière imagée, on se représente la complémentarité entre deux CAMS comme la complémentarité nécessaire à une clef vis-à-vis de sa serrure pour pouvoir actionner le mécanisme d’ouverture.
Adhésion et couples ligand-récepteur
Physico-Chimie de la reconnaissance spécifique
Les progrès technologiques – reposant en particulier sur des techniques de génie génétique et l’utilisation d’anticorps monoclonaux – ont permis d’isoler et de caractériser plusieurs dizaines de molécules d’adhésion que l’on peut classer en familles, à partir de similitudes structurales ou de fonctionnement. Bien que ces molécules adhésives puissent être des sucres [123] ou des peptides [135], la grande majorité d’entre elles sont des protéines, c’est-à-dire des macromolécules structurées composées d’un enchaînement primaire de plusieurs centaines d’acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques. Les acides aminés sont au nombre de 20, et peuvent être neutres ou chargés, polaires ou apolaires, et peuvent créer des liaisons hydrogène à partir de certains de leurs groupements chimiques (alcools, acides, amines). L’enchaînement primaire est créé à partir de l’expression génétique de certaines fragments d’ADN en ARN, puis par traduction de cet ARN en un polypeptide construit pas-à-pas dans le reticulum endoplasmique de la cellule.
La fonction d’une protéine lui est conférée par sa structure tridimensionnelle engendrée par le repliement précis de la chaîne linéaire. Ce repliement s’effectue tout d’abord à l’échelle de quelques acides aminés, en fonction des interactions répulsives (ioniques, stériques, effets de solvant) et attractives (liaisons hydrogène, ioniques, solvatation) qui existent entre ceux qui se situent à proximité. Puis à l’échelle de la protéine entière (structure tertiaire), voire à l’échelle de plusieurs protéines assemblées (structure quaternaire).
Ces repliements s’accompagnent de la constitution de poches qui permettent l’interaction spécifique avec d’autres espèces chimiques nommées ligands (ions, molécule, macromolécule) par l’intermédiaire de multiples liaisons faibles (essentiellement hydrogène) organisées spatialement (Fig. 1.1). Le mécanisme physico-chimique de la reconnaissance s’effectue en plusieurs étapes, aidées par le comportement dynamique de la chaîne polypeptidique : reconnaissance géométrique, puis reconnaissance chimique, avec consolidation par exclusion des molécules d’eau et réorientation de certains groupements chimiques à l’intérieur de la poche. La première conséquence de ce mécanisme est que de petites modifications dans la structure primaire peuvent sensiblement influer sur la conformation de la poche et donc sa fonction. La deuxième conséquence, dans le cas ou la protéine présente plusieurs sites de liaison, est que la présence du ligand dans un des sites peut induire des modifications de structure du reste de la protéine et donc permettre une régulation des capacité de liaison des autres sites [98].
Adhésion cellulaire : Trois cas concrets
Parmi les innombrables phénomènes associés à l’adhésion entre des cellules, nous avons choisi d’en présenter trois à propos desquels il est possible d’isoler formellement, si ce n’est une fonction, du moins une caractéristique générale de fonctionnement. Nous aborderons le rôle des CAMs dans la cohésion mécanique endothéliale, puis leur rôle dans l’adhésion dynamique des globules blancs dans les vaisseaux, et enfin la nécessité de leur structuration dans l’espace intercellulaire dans le cas de l’adhésion des lymphocytes.
Cohésion Endothéliale
L’endothélium vasculaire est une monocouche de cellules qui tapisse l’intérieur de tous les vaisseaux sanguins. C’est une membrane semi-perméable qui permet notamment les échanges gazeux ainsi que le trafic des globules blancs entre le sang et les organes. Entre deux cellules jointives, on peut isoler trois catégories d’assemblages intercellulaires : les jonctions étanches dont le rôle est d’empêcher la diffusion des molécules perpendiculairement à l’endothélium, les jonctions de communication qui assurent un couplage chimique et électrique entre cellules adjacentes et enfin les jonctions adhérentes qui permettent la tenue mécanique. Ces jonctions adhérentes sont formées à partir d’une famille de molécules dont il existe plusieurs dizaines de variantes et qui interviennent dans la cohésion mécanique de nombreux tissus : les cadhérines [98]. Ces protéines sont constituées de cinq domaines identiques pour la partie extracellulaire et d’une partie intracellulaire reliée au réseau d’actine. La cohésion entre les surfaces s’effectue par des interactions faibles homotypiques (cadhérine-cadhérine) dépendant fortement de la concentration en calcium. Pour exister, ces interactions nécessitent la mise en jeu de molécules appelées caténines qui stabilisent les complexes formés dans leur partie intracellulaire.
Leucocytes
Lorsqu’un tissu subit une agression telle qu’un traumatisme mécanique, une brûlure ou une infection, on observe très rapidement la mise en place d’une réaction inflammatoire, caractérisée par l’arrivée de différentes populations de leucocytes circulants, dont le rôle est d’éliminer les cellules mortes ou les débris tissulaires ainsi que d’éventuels microorganismes pathogènes [97] .
Les cellules endothéliales, activées par des facteurs tels que la présence de bactéries ou de produits de l’organisme, vont exprimer des molécules de sélectine à leur surface qui interagissent avec des molécules portées par la membrane des leucocytes circulant dans le flux sanguin ou lymphatique, ce qui a pour effet de les ralentir sans toutefois les arrêter. Les sélectines, individualisées il y a une dizaine d’année [12], se caractérisent par une interaction faible et extrêmement labile avec des ligands de la famille des sucres sialylés. Ralentis, les leucocytes s’activent alors en rendant fonctionnels des membres de la familles des intégrines (notament LFA-1) à leur surface en réponse à une signalisation chimiotactique des cellules endothéliales. Les intégrines se lient à leurs ligands sur la paroi, conduisant à une immobilisation des leucocytes. Enfin, ces derniers vont se diriger vers les jonctions intracellulaires afin de migrer à travers la barrière endothéliale et pénétrer les tissus inflammés plus profonds. La famille des intégrines compte une trentaine d’éléments et leur caractéristique commune est liée à une structure hétérodimérique constituée de deux chaînes polypeptidiques (α et β) différentes. L’activité des intégrines peut être modulée par des modifications de leur conformation ou de leur association au cytosquelette. Les intégrines peuvent engendrer des signaux intracellulaires qui interviennent dans les processus de survie ou de prolifération liés à l’attachement à un substrat.
Synapse immune
Dans de nombreux cas, la reconnaissance d’un récepteur avec un ligand de la cellule cible ne suffit pas à déclencher la production d’un signal intracellulaire et l’activation de la fonction biologique associée [41]. Par exemple, lorsqu’un lymphocyte T (Fig. 1.5) interagit avec une cellule cible, la réponse immunitaire complète ne survient que lorsque les complexes protéiques mobilisés par la reconnaissance s’organisent en une structure intercellulaire dont la taille caractéristique peut atteindre plusieurs microns, la synapse immune [73].
Les récepteurs TCR sont à la périphérie de la zone de contact au début de la formation, puis diffusent vers le centre, laissant les récepteurs LFA à la périphérie de manière à former la synapse dite mature. Bien qu’une modélisation ne tenant compte que de la diffusion passive ait permis de simuler la formation de ces structures [130], les coefficients de diffusion des protéines dans le modèle sont largement supérieurs à ceux associés uniquement à la diffusion brownienne bidimensionnelle, suggérant donc des mécanismes actifs [85]. Ces résultats ont été confirmés par des expériences montrant que des cellules n’ayant plus la capacité de former des filaments d’actine étaient incapables de former une synapse mature.
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Table des matières
Introduction
I Adhésion Cellulaire et Modélisations
1 Adhésion Cellulaire
1.1 Adhésion et couples ligand-récepteur
1.1.1 Physico-Chimie de la reconnaissance spécifique
1.1.2 Adhésion cellulaire : Trois cas concrets
1.1.2.1 Cohésion Endothéliale
1.1.2.2 Leucocytes
1.1.2.3 Synapse immune
1.2 Couples Ligand-Récepteur
1.2.1 Constante cinétiques et Énergie de liaison
1.2.2 Le couple Streptavidine-Biotine
1.3 Adhésion de surfaces par des liaisons ligand-récepteur
2 Mouillage non spécifique
2.1 Goutte posée sur un substrat
2.2 Émulsions et mouillage métastable
2.2.1 Description de l’interface des gouttes
2.2.2 Film de mouillage métastable
2.2.3 Microscopie de la ligne triple
2.2.4 Zone de transition et effets de ligne
2.3 Cellules et Membranes
2.3.1 Bicouches fluides : Liposomes et Polymersomes
2.3.2 Propriétés Élastiques des membranes
2.3.2.1 Tension de membrane
2.3.3 Adhésion de vésicules
2.3.3.1 Étude de l’adhésion par la technique des micropipettes
2.3.3.2 Étude de l’adhésion de membranes sur des substrats solides
3 Ajout de Ligands et Adhésion Spécifique
3.1 Adhésion de billes d’agarose
3.2 Adhésion Spécifique et Micropipettes
3.3 Vésicules sur substrats plans
3.4 Cinétique
II Matériaux et Caractérisation
1 Émulsions Fonctionnalisées
1.1 Réalisation d’émulsions monodisperses
1.2 Caractérisation des Gouttes d’Émulsion en FACS
1.2.1 Généralités sur la cytométrie en flux
1.2.1.1 Présentation du cytomètre en flux
1.2.1.2 Fluidique
1.2.1.3 Optique
1.2.1.4 Histogrammes et Diagrammes de Points
1.2.2 Caractérisation d’émulsions par cytométrie en flux
1.2.2.1 Introduction
1.2.2.2 Théorie de Mie et Montage Optique
1.2.3 Exploitation des courbes
1.2.3.1 Analyse granulométrique
1.2.3.2 Analyse de la fluorescence
1.2.3.3 Suivi du vieillissement de l’émulsion
1.3 Fonctionnalisation de la surface
1.3.1 Matériaux
1.3.2 Étape 1 – Liaison de la biotine : Étape d’activation
1.3.3 Étape 2 – Liaison de la biotine : Liaison Covalente
1.3.4 Étape 3 – Fixation de la streptavidine
1.3.5 Saturation de l’interface en streptavidine
1.3.6 Densité de streptavidine sur les gouttes en fonction de la taille
1.3.7 Effet des rinçages sur la densité de streptavidine
1.3.8 Désorption de la streptavidine au stockage
1.4 Courbe finale de concentrations
2 Lamelles de verre
2.1 Fonctionnalisation des Lamelles par de la biotine
2.1.1 Protocole de fonctionnalisation
2.1.1.1 Matériaux
2.1.1.2 Étape 1 : Dépôt de Poly-L-Lysine sur le verre
2.1.1.3 Étape 2 : Fixation des polyéthylène oxyde
2.1.2 Caractérisation de la quantité de biotine en surface
2.1.2.1 Protocole de dépôt de la streptavidine
2.1.2.2 Mesure en microscopie de fluorescence
2.1.2.3 Mesure au spectrofluorimètre
2.2 Courbe finale des concentrations
III Mouillage spécifique des gouttes d’émulsion
1 Configuration de l’expérience, Matériaux et Mesures
1.1 Présentation de l’expérience
1.1.1 Chambre de mesure
1.1.2 Angle de contact : Hypothèses et Mesure
1.2 Grandeurs Observables
1.2.1 Statistique sur le rayon
1.2.2 Précision de la mesure : Tension de ligne
2 Mouillage Non Spécifique
2.1 Définition de l’expérience témoin
2.2 Effet de la force ionique, du pH et du tensioactif
3 Mouillage Spécifique
3.1 Rappels des caractéristiques des matériaux
3.2 Effet de l’adhésion spécifique sur la tension de ligne
3.3 Mouillage Spécifique : Énergie et Intensité
3.4 Energie d’adhésion ε en fonction de Γ l biot
3.4.1 Recrutement des protéines dans la zone adhérée
3.4.2 Gélification des streptavidines dans la zone adhérée
3.5 Modèle descriptif et simulation numérique
3.6 Comparaison entre le modèle et les expériences
3.7 Cinétique de croissance du rayon de contact
3.8 Taux de couverture faible
3.8.1 Effet de la densité de PEG-3400-Biotine
3.8.2 Structure de la zone de contact en couronne
3.8.3 Cinétique de formation de la zone de contact
IV Conclusion
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