Adaptation des micro-organismes halophiles et halotolérants au sel

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Eucaryotes halophiles

Dans le domaine des Eucarya, les organismes halophiles sont relativement rares. La plupart des eucaryotes halophiles sont des halophiles modérés ou halotolérants, mais quelques espèces halophiles extrêmes ont été identifiées (DasSarma et DasSarma, 2017), comme des champignons, des protistes et des algues qui nécessitent de fortes concentrations en sels pour vivre. Par exemple, Debaryomyces hansenii est une levure poussant en condition d’anaérobiose dans des salinités pouvant atteindre 263 g.L-1 NaCl (Gunde-Cimerman et al., 2009). C’est également le cas du champignon Trimmatostroma salinum et de la levure noire Hortaea werneckii (Gunde-Cimerman et al., 2000) qui nécessitent des concentrations en sel élevées pouvant aller presque jusqu’à la saturation (300 g.L-1 NaCl). La plupart des algues vertes halophiles sont des halophiles modérés ou halotolérants, comme Dunaliella viridis, Dunaliella parva ou Asteromonas gracilis. Seule Dunaliella salina est une espèce halophile extrême qui produit à des salinités élevées de grandes quantités d’un pigment d’intérêt, le β-carotène (DasSarma et DasSarma, 2017). De plus, cette algue planctonique peut se trouver, dans le Grand Lac Salé aux USA, à de très fortes concentrations pouvant aller jusqu’à 10000 cellules par mL (Oren, 2014). On retrouve également, dans les milieux hypersalins, des diatomées, telles que Amphora coffeaformis, généralement à des concentrations en sels aux environs de 120 g.L-1, mais elles sont rarement abondantes (DasSarma et DasSarma, 2017). Des eucaryotes pluricellulaires ont également été retrouvés dans des environnements hypersalins modérés tels que des crustacés (Artemia franciscana et Artemia salina), des poissons Tilapia, des mouches comme Ephydra hians et Ephydra gracilis, des rotifères (Bracionus angularis), des vers plats (Macrostomum spp.), des copépodes (Robertsonia salsa) et des ostracodes (Cyprideis torosa). Des plantes telles que Atriplex halimus (ficoïde glaciale) et Mesembryanthemum crystallinum (arroche maritime) et des espèces de palétuviers dans les mangroves du genre Laguncularia peuvent également survivre dans des sols présentant une concentration en sels modérée (DasSarma et DasSarma, 2017).

Bactéries halophiles

Des bactéries halophiles ont été retrouvées dans les phyla Bacteroïdetes, Cyanobacteria, Firmicutes et Proteobacteria (classes des Alphaproteobacteria et Gammaproteobacteria). Des cyanobactéries représentent une partie importante du biotope des milieux hypersalins tels que les marais salants et le Grand lac salé aux Etats-Unis. Ces cyanobactéries sont halotolérantes légères comme Agmenellum quadrupplicatum qui tolère 0 à 100 g.L-1 NaCl, cependant il existe des cyanobactéries halophiles extrêmes comme Aphanothece halophytica dont la croissance est possible entre 50 et 320 g.L-1 NaCl (DasSarma et DasSarma, 2017). Dans le phylum des Firmicutes, la famille des Bacillaceae comprend des espèces halophiles obligatoires dont Halobacillus halophilus qui a été l’espèce la plus étudiée surtout en raison de ses mécanismes d’osmorégulation (Saum et Müller, 2008). On retrouve également des halophiles dans la famille des Halobacteroidaceae (Halobacteroides halobius, Orenia marismortui et Sporohalobacter lortetii). Chez les Gammaproteobacteria, la famille des Halomonadaceae contient un grand nombre d’espèces halophiles modérées isolées de nombreux environnements hypersalins (genres Chromohalobacter et Halomonas) (DasSarma et DasSarma, 2017). Enfin, c’est dans le phylum des Bacteroïdetes que l’on trouve des halophiles extrêmes pigmentés ayant une croissance optimale de 200 à 300 g.L-1 NaCl. Il s’agit de Salisaeta longa (Vaisman et Oren, 2009), de Salinibacter ruber (Antón et al., 2002), Salinibacter iranicus et Salinibacter luteum (Makhdoumi-Kakhki et al., 2012). Les bactéries du genre Salinibacter sont celles qui présentent le plus de caractères communs avec les archées de la classe des Halobacteria (Oren, 2013).
Il est important de noter que certaines bactéries halophiles sont poly-extrêmophiles telles que la bactérie anaérobie Halothermotrix orenii isolée d’un lac salin en Tunisie qui est halophile (200 g.L-1 NaCl) et thermophile (68 °C) (Cayol et al., 1994), ou encore les bactéries Natranaerobius thermophilus, Natranaerobius trueperi et Natronovirga wadinatrunensis qui sont alcalophiles (pH 9.5 à 10.5) et halophiles (220 g.L-1 NaCl), isolées des lacs alcalins hypersalés Oudi Natroum en Egypte (Mesbah et al., 2007 ; Mesbah et Wiegel, 2009).

Archées halophiles

Les archées halophiles ont été identifiées dans le phylum des Euryarchaeota, dans les classes Halobacteria majoritairement et Methanomicrobia (méthanogènes) pour quelques espèces, et dans le superphylum DPANN parmi les Nanohaloarchaeota. Parmi les Euryarchaeota, la classe des Halobacteria est presque exclusivement composée d’archées halophiles extrêmes. En effet, ces organismes requièrent une concentration saline supérieure ou égale à 190 g.L-1 et ne peuvent croître en dessous de 100 g.L-1 NaCl (DasSarma et DasSarma, 2017). Jusqu’en 2010, la phylogénie des Halobacteria était uniquement basée sur l’analyse des séquences de l’ARNr 16S. En 2010, une phylogénie de ces archées se basant sur les séquences du gène codant la sous unité β’ de l’ARN polymérase a été réalisée (rpoB’) (Minegishi et al., 2010). Puis, en 2011, une phylogénie multi locus utilisant la séquence de gènes codant 5 protéines de références (atpB, ef2, radA, rpoB’ et secY) (Papke et al., 2011) a été introduite. Néanmoins la classe des Halobacteria ne comprenait toujours qu’un seul ordre les Halobacteriales et une seule famille les Halobacteriaceae. Dès 2015, L’augmentation des données issues du séquençage des génomes d’archées a permis l’analyse de 129 séquences de génomes et de l’identification de signatures protéiques conservées (CSPs) et de signatures d’insertions-délétions (Indel) conservées (CSIs). Ceci a permis de définir finalement trois ordres au sein de la classe Halobacteria : les Halobacteriales, les Haloferacales et les Natrialbales. L’ordre des Halobacteriales comprend trois familles : Haloarculaceae, Halobacteriaceae et Halococcaceae. L’ordre des Haloferacales présente deux familles, Haloferaceae et Halorubraceae, tandis que l’ordre des Natrialbales ne contient qu’une seule famille, celle des Natrialbaceae (Figure 9) (Gupta et al., 2015 ; Gupta et al., 2016a et 2016b). Les génomes des archées identifiées de la classe des Halobacteria ont une taille variant de 2,4 à 5,3 Mb et la plupart est porteur d’un ou plusieurs plasmides dont la taille peut aller jusqu’à 830 kb. Leur pourcentage en GC est toujours élevé variant de 47 à 71 % (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/#!/prokaryotes/ Halobacteria).
En octobre 2019, la classe des Halobacteria comptait 66 genres dont 5 décrits en 2019 (Figure 9) et 276 espèces dont 16 nouvelles pour l’année 2019 (J Peduzzi, communication personnelle). Dans la classe des Methanomicrobia, les archées méthanogènes halophiles sont retrouvées dans la famille des Methanocalculaceae avec le genre Methanocalculus dont 6 espèces halotolérantes (Oren 2014), Methanocalculus natronophilus (Sorokin et al., 2015) pouvant croitre jusqu’à 195 g.L-1 NaCl. Mais le plus grand nombre de représentants halophiles se retrouve dans la famille des Methanosarcinaceae (Oren, 2014), dans trois genres (sur sept) Methanohalobium, Methanohalophilus et Methanosalsum. L’archée méthanogène la plus halophile est Methanohalobium evestigatum Z-7303, isolée du lagon hypersalin Syvash en Ukraine, avec une croissance optimale à 250 g.L-1 NaCl. De telles découvertes nous informent que la réaction de méthanogenèse peut avoir lieu à de très fortes concentrations salines, proche de la concentration de saturation en NaCl.
En 2012, une étude métagénomique de la communauté microbienne du lac hypersalé Tyrrell en Australie (250 g.L-1 à > 330 g.L-1 de sels) (Emerson et al., 2012), a révélé un nouveau groupe d’archées : les Nanohaloarchaeota (anciennement nommé Nanohaloarchaea), intégré d’abord dans le phylum des Euryarchaeota (Ghai et al., 2011 : Narasingarao et al., 2012), puis dans le superphylum DPANN (Rinke et al., 2013). Trois genres candidats furent alors décrits
Candidatus Haloredivivus sp. G17, Candidatus Nanosalina et Candidatus Nanosalinarum. Depuis seuls 18 génomes ont été recensés dans plusieurs environnements hypersalins (www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse#!/prokaryotes/Nanohaloarchaea), et un nouveau genre a été décrit, Candidatus Nanopetramus sp. SG9 (Crits-Christoph et al., 2016). Par opposition aux génomes des archées de la classe des Halobacteria, le génome des Nanohaloarchaeota est petit (0,4 à 1,4 Mb) et a un plus faible pourcentage en GC (39 à 55 %). Leurs cellules sont de petites tailles (0,6 µm) et sont dénuées de vésicules gazeuses. Leur génome présente un opéron d’ARNr en copie unique et des voies atypiques pour le métabolisme des glucides (Narasingarao et al., 2012). Très récemment, il a été montré que deux souches de candidat Nanohaloarchaeum antarticus, isolées dans 2 lacs en Antarctique, nécessitent la présence d’Halorubrum lacusprofundi de la famille des Halorubraceae pour croître (Hamm et al., 2019). C’est le premier exemple qui montre que les Nanohaloarchaeota pourraient être des symbiontes (partenaires les plus petits d’une symbiose), de la même manière à ce que l’on observe chez les Nanoarchaeota et Pavarchaeota du superphylum DPANN (Hamm et al., 2019). La position phylogénétique des Nanohaloarcheota reste cependant souvent débattue (Petitjean 2015, Rayman et al., 2015 ; Castelle et al., 2015). Une étude récente a montré que les Halobacteria du phylum des Euryarcheota et les Nanohaloarchaeota du superphylun DPANN représentent 2 lignées indépendantes d’halophiles extrêmes qui dérivent de 2 lignées distinctes de méthanogènes de classe II, respectivement les Methanomicrobiales et les Methanocellales (Aouad et al., 2018) (Figure 10).
Les données analysées corres-pondent à 18 309 acides aminés provenant de 155 séquences. La barre d’échelle représente le nombre moyen de substitution par site. L’arbre consensus a été construit par une répétition de 100 échantillonnages et la proportion de boostrap est indiquée au-dessus des branches. La branche conduisant aux Nanohaloarchaeota a été raccourcie et sa longueur est indiquée par b.l. (Aouad et al, 2018).

Diversité microbienne dans les environnements hypersalins

Les milieux hypersalins sont colonisés par des espèces appartenant aux trois domaines du vivant, cependant les archées sont largement dominantes lorsque la concentration en NaCl augmente. En effet, un déplacement des communautés microbiennes des bactéries vers les archées se produit lorsque la concentration en NaCl dépasse 240 g.L-1 (Ghai et al., 2011). La Figure 11 illustre la modification des communautés microbiennes en fonction du gradient de salinité. Des études de pyroséquencage du gène codant l’ARNr 16S ont été réalisées dans différents environnements : DCM3 (Mer Méditerranée) et les bassins SS19 et SS37 de la saline Santa Pola à Alicante (Espagne). Cette comparaison montre une diminution de la diversité microbienne lorsque la salinité augmente (Fernández et al, 2014). Dans le milieu DCM3 avec une salinité de 38 g.L-1, il y existe une grande diversité et les bactéries du phylum des Proteobacteria domine largement (59 %), tandis qu’il existe très peu d’archées du phylum des Euryarcheota (5 %) (Ghai et., 2010). Dans le bassin SS19 de salinité intermédiaire (190 g.L-1), les halophiles extrêmes dominent avec 46% d’Euryarcheota et 15 % de bactéries du phylum des Bacteroïdetes. Ce phénomène est accentué dans le bassin de cristallisation SS37 présentant une salinité de 370 g.L-1. Ainsi dans ce bassin, les archées sont dominantes avec 88 % d’Euryarcheota, 2 % d’autres archées et 10 % de bactéries du phylum des Bacteroïdetes, principalement représentées par Salinibacter ruber (Ghai et al. 2011 ; Fernández et al, 2014).

Adaptation des micro-organismes halophiles et halotolérants au sel

Les organismes se développant dans des environnements hypersalins sont soumis à un fort stress osmotique. Pour obtenir un équilibre osmotique entre le cytoplasme et le milieu environnant qui contient de fortes concentrations en Na+, les organismes halophiles ont développé des stratégies conduisant à créer une forte pression osmotique intracellulaire tout en conservant une faible concentration en Na+ à l’intérieur du cytoplasme (Gunde-Cimerman et al., 2018). Les deux stratégies d’osmorégulation consistent en l’accumulation dans le cytoplasme soit de chlorure de potassium KCl soit de solutés organiques osmorégulateurs, tels que des acides aminés, des polyalcools ou des sucres (Oren, 2006a).

Accumulation de chlorure de potassium

Cette stratégie également nommée  » Salt-in « est énergétiquement la moins coûteuse (Oren, 2006a). Pourtant on ne la retrouve que chez les archées halophiles extrêmes de la classe des Halobacteria et quelques bactéries halophiles extrêmes de l’ordre des phyla Firmicutes (Oren, 2006b) ou Bacteroïdetes comme S. ruber (Oren et al., 2002a). Pour accumuler du chlorure de potassium dans le cytoplasme, plusieurs échanges membranaires sont nécessaires. Ils permettent l’accumulation de K+, l’efflux de Na+ et l’accumulation de Cl-. Chez Halobacterium salinarum, il a été mesuré une concentration intracellulaire en K+ de 340,7 g.L-1 (4,57 M) lorsque la croissance est réalisée dans un milieu contenant 233,8 g.L-1 (4 M) en Na+ (Christian et Waltho, 1962). La Figure 12 présente les différents transporteurs membranaires et la chaîne respiratoire chez Halobacterium sp. NRC-1 (Ng et al., 2000 ; DasSarma et DasSarma, 2017 ; Gunde-Cinerman et al., 2018). L’énergie nécessaire pour ces flux ioniques provient du gradient de protons généré par la chaine respiratoire (Figure 12, voie 1), par le transporteur (K+/H+) KdpABC nécessitant l’hydrolyse de l’ATP (Figure 12, voie 2) et par la bactériorhodopsine (Figure 12, voie 4) activée par la lumière et couplée à une ATPase (Figure 12, voie 5). En plus du transporteur KdpABC, l’accumulation intracellulaire de K+ est également réalisée grâce à un uniporteur TrkAH (figure 12, voie 7) dépendant du potentiel de membrane. Ce potentiel est de l’ordre de -125 mV avec une charge positive à l’extérieur et une charge négative à l’intérieur de la cellule (Michel et Oersterhelt, 1976) (Figure 12). L’exclusion de Na+ est réalisé par le transporteur (Na+/H+) NhaC (Figure 12, voie 3) qui dépend de l’hydrolyse de l’ATP et par un symporteur (co-transporteur) Na+/Cl- (Figure 12, voie 8) dépendant du potentiel de membrane. L’afflux de K+ dans le cytoplasme doit être compensé par une accumulation de Cl-. Cet import d’ion Cl- est réalisé par le symporteur Na+/Cl- et surtout par l’halorhodopsine (Figure 12, voie 6) qui est stimulée par l’énergie lumineuse (Kandori, 2015).

Accumulation de composés osmoprotecteurs

Cette stratégie d’adaptation osmotique, encore nommée  » Salt out  » ou « Low salt in  » est retrouvée parmi les organismes halophiles des trois domaines du vivant : bactéries halophiles modérées ou halotolérantes, archées méthanogènes et micro-organismes eucaryotes (Oren, 2008 ; DasSarma et DasSarma, 2017). La concentration en Na+ du milieu intracellulaire est maintenue à une plus faible concentration qu’à l’extérieur grâce aux transporteurs couplés Na+/H+. Ainsi lorsque la bactérie halophile Halomonas elongata est cultivée en présence de 198,7 g.L-1 Na+, sa concentration intracellulaire n’est que de 36,8 g.L-1 Na+(Oren, 2006a). Le maintien de l’équilibre osmotique à l’intérieur de la cellule est alors réalisé par l’import à partir du milieu extérieur de composés osmoprotecteurs, également nommés solutés compatibles, ou par synthèse endogène de ces composés (Ventosa et al., 1998). Cette stratégie est coûteuse en énergie et dépend de la nature du soluté. Elle nécessite une ou plusieurs voies de biosynthèse et des pompes d’import localisées dans la membrane cytoplasmique (Oren, 2001).
Ces solutés sont des molécules organiques polaires, très solubles dans l’eau, généralement neutres à pH 7 et de faible poids moléculaire. Ils sont dits compatibles car même accumulés en forte concentration, dans le cytoplasme ils n’affectent pas la structure tridimensionnelle des protéines ni les réactions enzymatiques (Oren, 2008). Contrairement à la stratégie d’accumulation de KCl, cette stratégie permet aux organismes de tolérer facilement des variations de concentration saline (Ventosa et al., 1998). Lors d’une baisse de la concentration saline, les organismes utilisant cette stratégie vont diminuer la synthèse de ces composés ou arrêter leur import du milieu extérieur.
Les solutés utilisés peuvent être des sucres (saccharose, tréhalose), des dérivés de sucres (sulfotréhalose, glucosylglycérol), des polyalcools (glycérol, arabitol, mannitol), ou des acides aminés (proline, acide glutamique, glutamine) et leurs dérivés (glycine bétaïne, ectoïne et ses dérivés (Roberts, 2005 ; Oren, 2006a) (Figure 13).
Les composés osmoprotecteurs les plus fréquemment rencontrés chez de nombreux micro-organismes halophiles et halotolérants sont la glycine bétaïne et l’ectoïne, tandis que certains eucaryotes halophiles comme les algues et les champignons accumulent préférentiellement du glycérol (Oren, 2008 ; DasSarma et DasSarma, 2017). Chez Dunaliella parva, on estime que la concentration en glycérol intracellulaire est de 2,1 M lorsque cette algue verte est cultivée en présence de 85 g.L-1 NaCl (Gunde-Cimerman et al., 2018).
La limite entre ces deux stratégies d’adaptation des organismes à la salinité, n’est pas toujours franche. Certains organismes combinent les 2 stratégies, ainsi chez certaines archées des ordres Halobacteriales et Natrialbales (Natrialba magadi, Natronobacterium gregoryi, Natronococcus occultus et Natronomonas pharaonis), il a été détecté en plus de l’accumulation de KCl, un composé osmoprotecteur, le 2-sulfotréhalose (Oren 2002b et 2006a).

Adaptations des protéines halophiles

La stratégie d’adaptation des micro-organismes halophiles extrêmes par accumulation de forte concentration intracellulaire de KCl (jusqu’ à 300 g.L-1) permet peu de flexibilité et d’adaptabilité aux changements environnementaux. En effet, les enzymes et protéines structurales, adaptées aux fortes concentrations en NaCl dans le milieu, vont devenir instables et inactives si la salinité diminue dans l’environnement. Pour s’adapter à de fortes concentrations intracellulaires en KCl, les halophiles ont un protéome acide et moins hydrophobe que les organismes retrouvés dans des environnements non hypersalins. La composition en acides aminés des protéines halophiles présente donc un enrichissement en acides aminés acides (acide aspartique et acide glutamique) et en thréonine tandis qu’il y a une diminution des résidus basiques (lysine et arginine) (Paul et al., 2008 ; Ortega et al., 2015). Il en résulte que les protéines halophiles présentent un point isoélectrique acide avec une moyenne entre 4 et 5,5 (Paul et al., 2008 ; Ghai et al., 2011) Les acides aminés acides interagissent avec les ions K+ et permettent ainsi l’accumulation de molécules d’eau et donc le repliement, la stabilité et la solubilité des protéines halophiles. Cette couche d’eau et de sels crée une enveloppe protectrice autour des protéines et empêche leur dénaturation (Madern et al. 2000 ; Mevarech et al. 2000).
La détermination de la structure cristallographique de protéines d’archées halophiles a permis de mieux appréhender les spécificités des protéines halophiles (Madern et al. 2000 ; DasSarma et DasSarma 2017). La figure 14 montre la comparaison entre la structure tridimensionnelle de la malate déshydrogénase de l’archée halophile extrême Haloarcula marismortui, avec celle de son homologue provenant d’une bactérie mésophile Bacillus anthracis (Pancsa et al., 2019). L’étude de la représentation de la surface de ces deux enzymes confirme une forte proportion d’acides aminés acides (en rouge) et une faible quantité d’acides aminés basiques (en bleu) chez l’enzyme de Har. marismortui. Par contre la structure tridimensionnelle de ces 2 enzymes est superposable.

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Table des matières

Liste des tableaux
INTRODUCTION
I. Les archées
1. Troisième domaine du vivant
2.Habitats
II. Milieux hypersalins et organismes halophiles
1. Milieux hypersalins
1.1. Environnements thalassohalins
1.2. Environnements athalassohalins
2. Organismes halophiles
2.1. Eucaryotes halophiles
2.2. Bactéries halophiles
2.3. Archées halophiles
2.4. Diversité microbienne dans les environnements hypersalins
3. Adaptation des micro-organismes halophiles et halotolérants au sel
3.1. Accumulation de chlorure de potassium
3.2. Accumulation de composés osmoprotecteurs
3.3. Adaptations des protéines halophiles
3.4. Exopolysaccharides et polyhydroalkanoates
3.5. Adaptations aux rayonnements UV
3.6. Adaptations à la dessication
4. Applications des organismes halophiles
III. Peptides antimicrobiens
1. Peptides antimicrobiens synthétisés par les eucaryotes
2. Peptides antimicrobiens synthétisés par les bactéries
2.2. Biosynthèse
2.3. Mécanismes d’action
3. Peptides antimicrobiens synthétisés par les archées : les archéocines
3.1. Sulfolobicines
3.2. Halocines
3.3. Interactions antimicrobiennes dans les environements hypersalins
IV. Projet de recherche
MATÉRIELS ET MÉTHODES
I. Méthodes de bactériologie
1. Souches archéennes et bactériennes
2. Milieux de culture
3. Cultures en milieu solide et en milieu liquide
4. Courbe de croissance
5. Tests antimicrobiens en milieu solide par diffusion sur gélose
5.1. Echantillons à tester
5.2. Gélose molle ensemencée
II. Méthodes de biologie moléculaire
1. Extraction cellulaire pour l’obtention d’ADNg
2. Amplification des fragments d’ADN par la réaction de polymérase en chaîne.37
3. Electrophorèse sur gel d’agarose
4. Clonage
4.1. Purification de l’ADN amplifié par PCR
4.2. Ligation
4.3. Préparation des cellules compétentes
4.4. Transformation des cellules d’E. coli DH5α
4.5. Extraction et purification de l’ADN plasmidique
4.6. Séquençage
5. Extraction d’ARN
6. Transcription inverse
7. RT-PCR quantitative ou RT-PCR en temps réel
1. Purification de l’halocine C8
1.1. Culture en milieu liquide
1.2. Culture en milieu solide
2. Purification de l’halocine H4
3. Dosage de protéines
4. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS
4.1. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS Tris-glycine
4.2. Coloration des gels
5. Spectrométrie de masse
5.1. MALDI-TOF
5.2. Chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse
IV. Méthodes de bio-informatique
1. Recherche et validation des amorces pour la PCR
2. Recherche in silico de similarités de séquences
3. Analyses des séquences protéiques
4. Alignements multiples
5. Arbre phylogénétique
CHAPITRE 1 HalC8 est un peptide antimicrobien fréquemment rencontré chez les archées halophiles
I. Recherche in silico de similarités de séquences du gène halC8 et du précurseur ProC8
II. Analyse par amplification PCR du gène halC8
III. Alignement multiple et analyse phylogénétique de ProC8
IV. Rôle putatif des protéines codées par les gènes entourant halC8
V. Organisation génétique du groupe de gènes impliqués dans la biosynthèse de HalC8
VI. Expression de HalC8 et activité antimicrobienne
VII. Purification de HalC8
IX. Discussion
CHAPITRE 2 HalH4 est une protéine antimicrobienne rencontrée chez quelques souches d’archées halophiles
I. Analyse de similarités de séquences in silico et manuelle de ProH4
II. Alignement multiple et analyse phylogénétique de ProH4
III. Recherche par PCR du gène halH4
IV. Spectre d’activité antimicrobienne du surnageant de culture de Hfx. mediterranei DSM1411
V. Recherche de l’activité antimicrobienne de HalH4
VI. Production, purification et caractérisation de HalH4 produite par Hfx. mediterranei DSM1411
VII. Discussion
CHAPITRE 3 Etude de l’expression des gènes halC8 et halH4 : mise au point des conditions de la RT-PCR quantitative
I. PCR quantitative de l’ADNc des gènes de références et de halC8 chez Nnm. altunense JCM12890
1. Gène de référence codant l’ARNr 16S chez Nnm. altunense JCM12890
2. Gène de référence codant la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (gapdh) chez Nnm. altunense JCM12890
3. Séquence de la région transcrite entre le gène codant l’ARNr 16S et le gène codant l’ARNr 23S (ITS1) chez Nnm. altunense JCM12890
4. Gène de référence codant la sous-unité β de l’ARN polymérase (rpoB) chez Nnm. altunense JCM12890
5. Gène de référence codant la protéine de réparation et de recombinaison de l’ADN RadA (radA) chez Nnm. altunense JCM12890
6. Gène de référence codant la protéine ribosomique L10 (rpl10) chez Nnm. altunense JCM12890
7. Gène d’intérêt halC8 codant le précurseur de l’halocine C8 chez Nnm. altunense JCM12890
II. PCR quantitative de l’ADNc des gènes de référence et de halH4 chez Hfx. mediterranei DSM1411
1. Gènes de référence gapdh, rpoB, radA et rpl10 et séquence ITS1 chez Hfx. mediterranei
DSM14
112. Gène d’intérêt halH4 codant le précurseur de l’halocine H4 chez Hfx. mediterranei DSM1411
III. Discussion
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
BIBLIOGRAPHIE

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