Soutenance mémoire
Adaptation des Légumineuses au Stress Hydrique
Variabilité Génétique des Plantes:
L’origine de la diversité génétique:
La diversité génétique est une composante essentielle de la biodiversité. Elle décrit la variabilité des gènes entre ou à l’intérieur des espèces et de leurs populations. L’intérêt actuel porté à la biodiversité montre à quel point il est nécessaire de veiller au maintien d’une ressource génétique suffisamment large pour garantir l’adaptation des organismes face aux changements environnementaux directs (les exploitations forestières et les changements d’usage des terres par exemple) et indirects sur le long terme (changements climatiques globaux). En effet, cette diversité génétique est très importante car elle représente le support de base sur lequel peut agir la sélection. Il est admis que plus la diversité est grande dans un groupe d’individus (souspopulation, population, espèce) plus il sera facile pour certains individus de s’adapter à de nouvelles conditions environnementales. En plus de permettre une plus grande adaptabilité des individus, elle permettra également de réduire la dépression de consanguinité et diminuera ainsi le risque d’extinction (Frankham, 2003). L’étude de la diversité génétique à différents niveaux hiérarchiques d’organisation peut apporter une aide précieuse à la biologie des populations et à la biologie évolutive ; deux disciplines importantes pour la biologie de la conservation. La diversité génétique est alors devenue un outil primordial pour définir des buts, des méthodes et des priorités dans des programmes de conservation (Stockwell et al. 2003). Le polymorphisme génétique est à la base de la diversité génétique, il correspond à des variations de séquences d’ADN au sein d’un groupe d’individus. Ces variations naturelles sont dues à des mutations successives au cours de l’évolution qui permettent de caractériser la diversité génétique entre individus et populations. En général, la majorité des polymorphismes sont neutres (Kimura 1968, 1983), mais une partie de ces variations peut influencer les différences phénotypiques observées entre individus qui pourront leur permettre d’avoir une meilleure fitness dans leur environnement. Le polymorphisme peut nous renseigner sur les différents processus qui façonnent la variabilité génétique. Ils peuvent être de nature démographique (taille des populations, migrations) et sélectif (lié à l’environnement). L’étude de l’importance relative de ces différentes composantes façonnant le polymorphisme permet de mieux comprendre l’histoire évolutive des populations et des espèces. Le niveau de diversité génétique des populations et des variations de fréquences alléliques dépend de l’action respective de quatre forces évolutives pouvant interagir les unes avec les autres : la mutation, la sélection, la migration et la dérive. Elles sont à l’origine de la structure de la diversité génétique et de son évolution.
Détermination de la diversité génétique:
Au cours des dernières décennies, une intensification générale des pratiques agricoles a fortement réduit la diversité planifiée parmi les espèces végétales et animales. Ainsi, en Allemagne ou en Finlande par exemple, presque toutes les variétés locales de céréales cultivées autrefois ont disparu (Hammer et Diederichsen 2009) ; en Hollande, le nombre des races locales de bovidés a diminué de quelque 90 % au cours des 30 dernières années (Buiteveld et al. 2009). Bien que des études isolées documentent ces pertes, il manque des méthodes fiables et simples qui permettent de suivre l’évolution de la diversité génétique dans l’agriculture. Pour cette étude, a été mis au point et utilisé un questionnaire qui permet une évaluation grossière de la diversité génétique de variétés de plantes et de races d’animaux. En plus, il a été déterminé l’influence du mode d’exploitation et celle de facteurs environnementaux sur la diversité génétique du dactyle (Dactylis glomerata), une espèce que l’on rencontre fréquemment dans les prairies et les pâturages, au moyen de marqueurs génétiques moléculaires. herbagères différentes. La diversité génétique de 60 populations provenant des trois études de cas régionales a été déterminée au moyen de 29 marqueurs SSR (simple sequence repeat) (Last et al. 2013). Les profils des marqueurs SSR de chaque plante ont été comparés entre eux et la diversité génétique a été définie à l’intérieur des populations, entre les populations et entre les régions étudiées.
Notion de vulnérabilité et érosion génétique:
La vulnérabilité génétique a été définie comme «la situation que l’on observe lorsqu’une plante de grande culture est constamment sensible aux attaques des ravageurs, d’un agent pathogène ou au risque écologique du fait de sa constitution génétique, ce qui crée des possibilités de pertes importantes de cultures». L’érosion génétique, d’autre part, a été définie comme «la perte de gènes individuels et de combinaisons de gènes (par exemple, de groupes de gènes) telles qu’on les retrouve dans les variétés adaptées aux conditions locales. Le terme ‘érosion génétique’ est parfois utilisé stricto sensu, c’est-à dire la perte de gènes ou d’allèles, et parfois lato sensu pour indiquer la perte de variétés en général». Ainsi, bien que l’érosion génétique n’implique pas nécessairement l’extinction d’une espèce ou d’une sous-population, elle signifie par contre la perte de variabilité et, par conséquent, la perte de flexibilité (Heywood et Dulloo, 2005). Ces définitions prennent en compte les deux aspects de la question de la diversité, c’est-à-dire la richesse et l’homogénéité. La richesse concerne le nombre total d’allèles et l’homogénéité, la fréquence relative des différents allèles.
Approches de la diversité moléculaire:
Marqueurs moléculaires pour l`étude de la diversité génétique
La valeur phénotypique d’un individu dépend du génotype (facteurs génétiques) mais aussi des conditions environnementales. La génétique quantitative a permis de modéliser la transmission génétique de caractères ayant une distribution quantitative. L’utilisation de marqueurs moléculaires liés aux facteurs génétiques contrôlant l’expression de caractères d’intérêt agronomique, et le développement de cartes génétiques à haute densité permettent d’accéder à des informations précises : le nombre et l’effet des gènes intervenant dans l’expression d’un caractère, leur localisation sur les chromosomes et leur mode d’action. Un marqueur moléculaire est un locus génétique qui renseigne sur le génotype de l’individu (utilisation en génétique des populations) ou sur le génotype des locus voisins (utilisation en sélection assistée par marqueurs). Il existe plusieurs types de marqueurs, que l’on peut classer en fonction du polymorphisme qu’ils détectent. Certaines techniques ont l’avantage de révéler de nombreux fragments simultanément, ce sont des techniques de révélation « en masse » de polymorphisme. Il existe aussi des stratégies permettant de détecter du polymorphisme de façon individuelle. L`étude de la diversité ou polymorphisme génétique est liée au développement de la biologie qui a permis le développement de plusieurs marqueurs à savoir les marqueurs morphologiques, les marqueurs biochimiques et les marqueurs moléculaires. Les marqueurs morphologiques et biochimiques ont largement contribué aux études de la diversité chez les plantes. Ces marqueurs présentent des limites majeures en comparaison avec les marqueurs moléculaires. Les marqueurs morphologiques étant polymorphes, peuvent interférer avec d`autres caractères et sont parfois influencés par le milieu. Les marqueurs biochimiques quant à eux présentent l’inconvénient d’être faiblement polymorphes. Les marqueurs moléculaires dont le nombre ne cesse de croître avec le développement des techniques de biologie moléculaire (depuis les RFLP, RAPD, AFLP, SSR, ISSR jusqu’aux SNP) ont fait un large consensus en matière de génétique selon leurs avantages respectifs. L`utilisation de ces marqueurs est basée sur la notion du bon marqueur moléculaire qui doit être: Polymorphe, codominant, non épistatique et indépendant du milieu. Le choix d`un bon marqueur par le chercheur est aussi basé sur la technicité et le coût de l`expérience qui doivent être abordables en vue d`une manipulation à grande échelle. Les marqueurs moléculaires ont été largement utilisés chez les animaux et les plantes pour des études de base ainsi qu`appliquées. L`une des utilisations majeurs des marqueurs moléculaires étant l`élaboration physique et génétique des cartes chromosomiques. Ces marqueurs ont contribué aux travaux d`amélioration des plantes (Lefort-Buson et al. 1990 a et 1990 b) en assurant une sélection indirecte moyennant des marqueurs moléculaires liés à des caractères d`intérêt ou quantitative traits loci (QTL).
Aspect Génomique de Medicago truncatula Gaertn:
Outils génétiques et génomiques disponibles:
M. truncatula, avec un petit génome approximativement de 500 Mbp, a été largement acceptée comme plante modèle pour des aspects multiples de la génétique de légumineuse et de génomique (Cook, 1999). Plusieurs projets à grande échelle sur la génomique de M. truncatula ont été lancés par la communauté internationale et des outils essentiels sont développés pour la génomique structurale et fonctionnelle suite au développement des ressources bioinformatiques (Frugoli et Harris 2001). L’analyse génétique d’un organisme exige la mise en œuvre de méthodes et techniques diverses qui vont permettre d’ordonner les gènes, de les localiser sur le génome et enfin de les cloner. La création de cartes génétiques et génomiques est donc indispensable. En outre, l’analyse comparative de ces cartes d’organismes différents permet d’étudier l’évolution de leurs génomes (Zhu et al. 2005). Parmi les marqueurs possibles disponibles, les microsatellites sont généralement utilisés pour de nombreux projets génétiques en raison de leur grande reproductibilité et de la facilité d’identifier des allèles. Les microsatellites sont des séquences d’ADN répétées en tandem dont l’unité de répétitions varie d’une à six pb. Dans la littérature, on les appelle aussi: simple séquence repeats (SSR), short tandem repeats (STR), ou variable number tandem repeats (VNTR). Les principales contraintes des SSRs, en tant que marqueurs moléculaires, sont l’effort et le coût exigé pour leur développement. Pour cette raison leur utilisation a été limitée à quelques espèces importantes sur le plan agricole. La recherche des SSRs a été récemment centrée sur les EST (Expressed Sequence Tag) – SSRs, qui sont relativement peu coûteux comparés au développement de SSRs génomiques (Gupta et al. 2003) puisqu’ils sont identifiés dans des séquences nucléotidiques. Ces marqueurs sont plus transmissibles aux genres étroitement liés puisqu’ils sont ancrés dans des régions conservées transcrites (Decroocq et al. 2003).
Analyse de la Tolérance au Stress Salin de Medicago truncatula Gaertn. en relation avec le Poids et la Teneur en Protéines de Réserves des Graines:
La salinité est l’un des stress abiotiques qui affecte de manière significative la croissance des plantes et la qualité des graines. Les légumineuses sont des plantes très importantes sur le plan écologique et agricole car ils sont capables d’interagir en symbiose avec des rhizobiums pour la fixation biologique de l’azote (Spaink, 2000 ; Perret et al. 2000), ce qui évite l’utilisation d’engrais chimiques, qui affectaient la rhizosphère et polluent les nappes phréatiques. Parmi les espèces annuelles du genre Medicago, l’espèce Medicago truncatula est largement utilisé comme plante légumineuse modèle pour comprendre la tolérance aux stress abiotiques (Young et Udvardi, 2009). Ce type de légumineuses ont un grand intérêt pour l’agriculture durable. La croissance des plantules au stade précoce de nombreuses plantes cultivées est très sensibles aux stress environnementaux (Penmetsa et Cook, 1997). La longueur de la racine et de la tige fournissent des indications importantes de la réponse de la plante au stress salin (Jamil et Rha, 2004). Chez certaines plantes, la radicule peut être plus longue que la tigelle et, par conséquent, ce rapport peut être inférieure par rapport à d’autres plantes (Snapp et Shenman, 1992). La compréhension de la relation entre le développement des jeunes plants, les conditions environnementales et la qualité des graines au niveau physiologique et agronomique sont des objectifs fondamentaux de la science des semences (Bláha et Pazderů, 2013). Les protéines qui s’accumulent dans les plantes dans des conditions salines peuvent fournir une forme de stockage de l’azote qui est réutilisée plus tard (Singh et al. 1987), et peuvent être nouvellement (de novo) synthétisés en réponse au stress salin. Elles sont présentes de manière constitutive à faible concentration (Pareek et al. 1997). Il serait très intéressant de trouver une association entre la teneur en protéines de réserves graines et la tolérance au stress salin.
Matériel
Nous avons utilisé des graines récoltées en (2010) provenant de génotypes de M. truncatula, fournies par différents instituts. Jemalong, qui est le génotype de référence, Tru 131 de IDGC de Sidi Belabbès, Tru 26 (35° 23’ 17’’ N ; 1° 19’ 22.16’’ E) qui provient de l’ENSA El Harrach (Alger), respectivement, et le génotype Tru 673 qui est représenté par des graines âgées d’une ancienne collection (24/06/1977) de l’ICARDA à Alep (Syrie).
Méthodes
Les quatre génotypes ont été utilisés à quatre niveaux de traitement par NaCl (Eau distillée comme témoin 0, 68, 102 et 137 mM) de chlorure de sodium (Amouri et Fyad Lamèche, 2012). Le génotype Tru 673, caractérisé par une faible vigueur des graines (Fig 10), a été utilisé pour étudier l’impact des graines âgées sur la réponse de la radicule et la tigelle à la salinité. Les graines ont été scarifiées et stérilisées pendant 10 minutes dans l’hypochlorite de sodium (6%) puis rincées trois fois à l’eau distillée pendant deux minutes. Dix graines ont été semées dans des boîtes de Pétri et mises à germer sur du papier-filtre imbibé dans l’eau distillée et dans les différentes solutions de chlorure de sodium. Les graines des différents génotypes de M. truncatula ont été mises à germer dans des boîtes de Pétri (50 mm) sur deux couches de papier filtre dans un incubateur maintenu à l’obscurité à 25 ± 2 °C. Les papiers filtres ont été changés après 48 heures, afin d’éviter l’accumulation du sel (Rahman et al. 1996). Pour évaluer l’effet des différents niveaux de concentrations de NaCl sur les différents génotypes, le dispositif expérimental est un dispositif bloc randomisé avec quatre répétitions, l’émergence de la radicule est le critère de la germination.
Détermination de la teneur en protéines de réserves des graines:
La teneur en protéines de réserves des graines (SPC) a été déterminée par la méthode décrite par Bradford (1976) en utilisant de l’albumine du sérum bovin comme témoin. Quatre graines pour chaque génotype, ont été mélangées avec un tampon d’extraction (50 mM Tris -HCl (pH: 6,8 ), 2 % de SDS, 2 ,5 % de bêta -mercaptoéthanol, 10 % glycérol). Après broyage, les échantillons ont été centrifugés à 14000 rpm pendant 15 minutes et le surnageant a été isolé et utilisé pour le dosage des protéines. L’intensité de la couleur bleue développée a été enregistrée à 595 nm à l’aide d’un spectrophotomètre à UV visibles et la concentration en protéine a été mesurée en utilisant de l’albumine du sérum bovin comme témoin. La teneur des graines en protéines de réserves (SPC: mg g- 1 ) a été calculée en fonction du poids des graines sèches (SDW : mg ) pour chaque génotype .
Analyse statistique:
Tous les tests statistiques ont été réalisées en utilisant le logiciel Statistica version 6.1. L’analyse statistique a été effectuée en utilisant l’ANOVA à deux facteurs ( P < 0.01 et P < 0,05). Basé sur les résultats d’analyse de variance, la comparaison multiple de moyennes a été réalisée selon la méthode de Duncan, pour un intervalle de confiance de 95 %, afin de déterminer les variations significatives entre les différents traitements (Duncan, 1955). , les différentes lettres après les valeurs à l’intérieur de la même colonne et pour chaque caractère, représentent les différences significatives existantes. Les Traits étudiés (rapport tige et racine : PL / RL) et la teneur en protéines de réserves (SPC) ont été soumis respectivement à l’analyse de classification hiérarchique utilisant la procédure de « Wards minimum variance » comme un algorithme de clustering. « Wards méthode minimum » est une procédure de classification hiérarchique dans lequel la similitude est utilisé pour rejoindre des groupes et est calculé comme la somme des carrés entre les deux groupes sommés sur toutes les variables (Hair et al. 1998). Le regroupement des génotypes donne des informations sur leur similitude et différence dans les réponses aux stress salin qui facilitent le choix des génotypes utilisés dans les programmes de sélection.
Analyse de la Diversité Génétique de Différents Ecotypes de Medicago truncatula Gaertn. par les Marqueurs Moléculaires :
Récemment, les méthodes moléculaires, fondées sur l’amplification enzymatique in vitro de fragments d’ADN spécifiques par la technique PCR, ont été appliquées chez les « Medics ». L’analyse du polymorphisme génétique par les techniques de la biologie moléculaire s’adresse à l’ensemble du génome, qu’il soit ou non traduit en protéines, et est indépendante des conditions de l’environnement. En outre, le nombre de marqueurs observables est théoriquement illimité et le génotype d’une plante peut être déterminé à un stade très précoce, aussitôt que le matériel est disponible pour l’extraction de l’ADN (Najimi et al. 2003). En ce qui concerne l’intérêt des microsatellites en génétique, ils sont connus, en plus de leur haut degré de polymorphisme, pour être des marqueurs neutres, co-dominants et avantageusement bien distribués sur l’ensemble du génome (Powell et al. 1996, Santoni et al. 2000). Un bon marqueur doit être à hérédité simple, multiallélique et co-dominant (Najimi et al. 2003). Les SSR ou « Single sequence repeat » répondent bien à ces critères et présentent ,en plus de leur reproductibilité, une méthode d’étude facile et une définition bien supérieure à d’autres marqueurs (Manifesto et al. 1999). Ces marqueurs sont très polymorphes et hypervariables et constituent donc des outils intéressants pour l’étude de la diversité génétique. Dans le présent travail, nous avons utilisé les étiquettes de séquences exprimées de microsatellites appelées (EST-SSR) qui sont des ressources importantes pour l’investigation de la diversité génétique car ces marqueurs montrent une variation seulement dans la partie exprimée (gènes exprimés) dans le génome et qui offrent une opportunité d’exploiter des motifs conservés présents en simple ou peu de copies pour le développement de microsatellites (SSR). L’objectif de notre travail est l’analyse moléculaire révélée par les marqueurs EST-SSR de la diversité génétique chez les différentes accessions de l’espèce Medicago truncatula Gaertn., afin de déterminer les différences et les similitudes qui existent entre elles et, également de faire le choix le plus adéquat des accessions génétiquement éloignées et complémentaires pour la réalisation des croisements de départ, dans les programmes d’amélioration variétale sous stress salin. Dans cette étude, nous avons essayé de caractériser les marqueurs « EST-SSR », sur de nouvelles accessions de M. truncatula, en provenance du pourtour méditerranéen et du proche orient dans le but d’obtenir des informations sur leur diversité génétique en les comparant aux deux génotypes contrastés au stress salin afin de déterminer celles qui sont associées au génotype jugé tolérant. Ceci nécessite une analyse phénotypique sur le comportement de l’ensemble de ces écotypes sous l’effet du stress salin afin d’affiner les associations marqueurs EST-SSR phénotype pour la tolérance au stress salin.
Extraction d’ADN et amplification par PCR:
L’ADN génomique est extrait pour chaque génotype, à partir de jeunes plants (plantules) obtenus après 7 jours de germination (10 graines par génotype). L’ADN est isolé en utilisant la méthode (CTAB) adapté par Udupa et al. (1999). Les trois loci EST-SSR (MTIC 044, MTIC 077 et MTIC 124) sont localisés sur le chromosome 3 (LG 3) et MTIC 335 sur le chromosome 7 (LG7) (Tab13). Ils ont été choisis, à partir d’une série de microsatellites, développée par Journet et al (2001), chez Medicago truncatula (2n=16) via la base de donnée « GenBankEST » disponible sur le web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/. L’amplification de l’ADN génomique a été faite, selon la technique adoptée par Udupa et al. (1999) dans une réaction PCR (miniprep) de 10 ul contenant 50 ng d’échantillon d’ADN, tampon PCR 1x, 0.2 mM dNTPs, 10 pmole pour chaque amorce et 1 unité de la Taq polymérase. Le programme d’amplification comprend une période initiale de la dénaturation de l’ADN et l’activation de la Taq polymérase à 94°C pendant 2mn, suivie de 35 cycles avec 3 phases : 94 °C durant 30 s, 55°C durant 30 s, et 72°C durant 45 s. L’extension finale est faite à 72°C durant 7 mn. Les produits PCR sont analysés en gel continu de polyacrylamide 6 % dénaturant. Après électrophorèse, les bandes d’ADN sont colorées avec le bromure d’éthidium (BET) et visualisées sous UV. Pour chaque locus, la composition des allèles SSR est déterminé pour chaque génotype. Les valeurs du contenu d’information sur le polymorphisme (PIC) ou « polymorphism Information Content » est calculé selon la formule suivante (Anderson et al. 1993): PIC = 1 – Σ P 2 ij : [Pij est la fréquence de l’allèle i révélée utilisant l’amorce j]. La diversité génétique pour chaque locus est calculé comme suit : Hi = 1 – Σ P 2 i, avec Hi (l’index de la variation génétique) et Pi (la fréquence d’allèle à chaque locus) (Nei, 1973).
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES:
L’étude de la salinité sur la croissance des jeunes plants chez quatre génotypes différents de M. truncatula, a permis de sélectionner les génotypes tolérants et sensibles basé sur la résistance racinaire par rapport à la tige et afin d’utiliser des génotypes contrastés pour l’étude biochimique et moléculaire. Les résultats ont montré que le génotype T131 est tolérant, avec une quantité élevée en protéines de réserves par rapport à Jemalong (sensible) qui est le génotype de référence. Cette étude a montré aussi l’influence de des graines âgées du génotype (Tru 673) sur le développement de la racine.
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE 1. BIOLOGIE DE L’ADAPTATION A LA SALINITE DE MEDICAGO TRUNCATULA Gaertner :
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
Les légumineuses, Le Modèle Medicago truncatula Gaertner, Adaptation des Légumineuses au Stress Hydrique
et salin, Variabilité Génétique des Plantes, Aspect Génomique de Medicago truncatula
CHAPITRE 2. ANALYSE DE LA TOLERANCE AU STRESS SALIN DE MEDICAGO TRUNCATULA Gaertn. EN RELATION AVEC LE POIDS ET LA TENEUR EN PROTEINES DE RESERVES DES GRAINES
Matériel et méthodes :
Traitement par NaCl, Calcul du poids et dosage des protéines de réserves de graines, Analyse statistique
Résultats et interprétation : Comparaison entre les différents paramètres étudiés
Discussion
Conclusion
CHAPITRE 3. ANALYSE DE LA DIVERSITE GENETIQUE DES PROTEINES DE RESERVES PAR ELECTROPHORESE
Matériel et méthodes : Extraction des protéines solubles et SDS-PAGE)
Résultats et interprétation : Analyse du polymorphisme génétique
Discussion
Conclusion.
CHAPITRE 4. ÉTUDE DU COMPORTEMENT DE DEUX GENOTYPES CONTRASTES
DE MEDICAGO TRUNCATULA Gaertn. VIS-A-VIS DU STRESS SALIN
Matériel et méthodes : Cinétique de germination, Dosage des protéines solubles, Analyse statistique
Résultats et interprétation : Variabilité phénotypique et biochimique de la tolérance au stress salin
Discussion
Conclusion
CHAPITRE 5. CARACTERISATION PHYSIOLOGIQUE ET BIOCHIMIQUE DE LA RACINE DE DEUX GENOTYPES CONTRASTES DE MEDICAGO TRUNCATULA Gaertn. SOUS STRESS SALIN
Matériel et méthodes :
Calcul de paramètres physiologiques, Activité enzymatique, Extraction et analyse des antioxydants,
Dosage des protéines solubles
Résultats et interprétation : Effet du stress salin sur la synthèse des protéines, Enzymes et antioxydants
racinaires
Discussion
Conclusion
CHAPITRE 6. ANALYSE DE LA DIVERSITE GENETIQUE DE DIFFERENTS ECOTYPES DE MEDICAGO TRUNCATULA Gaertn. PAR LES MARQUEURS MOLECULAIRES
Matériel et méthodes : Extraction d’ADN, Amplification par PCR et Analyse par des marqueurs EST-SSR
Résultats et interprétation : Analyse phylogénétique et Recherches de similarités.
Discussion
Conclusion
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
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