Activités antimicrobiennes des métabolites et extraits d’holothuries

Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études

Glycosphingolipides

Les glycosphingolipides sont des glycolipides possédant un alcool aminé sphingosine. Ils regroupent les cérébrosides, les gangliosides et les globosides. Les glycosphingolipides des organismes marins ont fait l’objet de nombreuses études, notamment depuis la découverte de telles molécules chez les éponges présentant des activités antitumorales (Kikuchi et al., 2001). De nombreux cérébrosides et gangliosides ont été décrits chez plusieurs espèces d’holothuries : Cucumaria echinata, Cucumaria japonica, Holothuria leucospilota, Holothuria pervicax, Pentacta australis et Stichopus japonicus (Higuchi et al., 1994a et b ; Muralidhar et al., 2003 ; Figure 5). De nouveaux cérébrosides ont été récemment isolés de Cucumaria frondosa, leurs structures ont été élucidées (Xu et al., 2013 ; Figure 6).

Oligosaccharides et polysaccharides sulfatés

Les oligosaccharides sont des oligomères formés de plusieurs unités osidiques. Par convention les oligosaccharides sont constitués d’un nombre d’oses compris entre 2 et 10 unités. Les polysaccharides contiennent un nombre d’oses supérieur à 10 unités. En 1992, Findlay et al. ont permis d’identifier le Frondécaside à partir du Frondoside B isolé de l’espèce C. frondosa. Le Frondoside B est un hétéroside (condensation d’un sucre à une partie non glucidique ou aglycone) dont la partie glucidique comporte 5 sucres et 2 groupes sulfates. Le Frondécaside possède la même structure que la partie glucidique du Frondoside B avec un groupement sulfate supplémentaire (Figure 7).
En 1993, les travaux de Silchenko et al (2007) ont conduit à l’identification des cucumariosides A7-1, A7-2, A7-3 et A7-4 et l’isofrondoside C chez C. japonica.
Des 1,3-fucanes (polymères de fucose) sulfatés en position 3 ou 4 (Figure 8) ont été isolés du tégument de l’holothurie Ludwigothurea grisea (Vieira et al., 1991 ; Mourão et Pereira, 1999).
Les glycosaminoglycanes sont des polysaccharides sulfatés constitués par la répétition d’un diholoside de base (hexosamine et un autre ose). Des glycosaminoglycanes spécifiques ont été retrouvés exclusivement chez les holothuries, nommés chondroïtines sulfates fucosylés (FucCS). Ces FucCS (Figure 9) ont la particularité de posséder des groupements sulfates fucosylés, avec un degré de sulfatation variant selon les espèces (Pomin, 2014).

Stérols et triterpènes

Les stérols et les triterpènes sont des composés organiques dérivés des terpénoïdes. Les stérols sont des lipides caractérisés par un noyau polycyclique (stérane) dont un carbone porte un groupement hydroxyle. Les triterpènes sont des terpènes constitués de six unités isoprène et sont majoritairement polycycliques. Les fractions stéroliques des holothuries sont complexes et montrent la présence de stérols ∆0 (Stanols), ∆5, ∆7 et ∆9 (11) ainsi que des 4α-méthylstérols et des triterpènes de la série du lanostane (triterpène dérivé du lanostérol) (Figure 10). Des études montrent que comme pour Eupentacta fraudatrix, les compositions en stérols de nombreuses espèces d’holothuries sont très complexes, le nombre de structures identifiées variant de 70 à 80 (Stonik et al., 1999 ; Ponomarenko et al., 2001).

Glycosides triterpéniques

Il existe de nombreux points communs entre les métabolites des étoiles de mer (astérides) et ceux des holothuries, cependant la différence fondamentale entre ces 2 classes d’Echinodermes se retrouve au niveau des saponines. Les saponines (du latin sapo) dérivent leur nom de leur capacité à former des mousses stables en solution aqueuse à la manière des savons. Les saponines sont des hétérosides, elles résultent de la combinaison d’un sucre avec une partie non glucidique (aglycone) qui peut être un stéroïde, un alcaloïde ou un triterpène. Chez les astérides, les aglycones sont souvent des stérols. Pour les holothuries, les aglycones sont des triterpènes de la série du lanostane et lorsque la saponine est sulfatée, les groupes sulfates ne se trouvent que sur la partie osidique. Les aglycones triterpéniques (Figure 11 : exemple d’aglycone) ne présentent que peu de variations structurales avec cependant la présence de fonctions cétones (présence d’une fonction ester dans un cycle) pour certains et possèdent le squelette carboné de l’holostane.
La partie glycosidique est toujours reliée à l’hydroxyle en 3β, le nombre d’osides varie de 2 à 6 incluant le xylose, le quinovose, le glucose et le 3-O-méthylglucose et parfois le 3-O-méthylxylose, le 3-О-méthylquinovose, l’acide 3-О-méthylglucuronique et le 6-О-acétylglucose mais est en général égal à 4 ou à 5. Le nombre de groupe sulfate varie de 0 à 3 (Kalinin et al., 1996 ; Yayli et Findlay, 1999 ; Kornprobst, 2005).
Plusieurs glycosides triterpéniques ont été isolés de Cucumaria frondosa et nommés Frondosides en accord avec le nom de l’espèce (Figure 12). Cette classe chimique de molécules est très étudié chez les holothuries, un travail de synthèse des glycosides triterpéniques de Cucumaria frondosa déjà publiés dans la littérature a été réalisé et présenté dans le Tableau IV. Ce tableau a permis de mettre en évidence la présence d’une grande diversité de saponines au sein de cette espèce.

La ressource et la pêche d’holothuries

Situation de la pêche au niveau mondial

Au niveau mondial, les pêches d’holothuries sont principalement ciblées sur une soixantaine d’espèces sur plus de 1100 connues à travers 70 pays (FAO, 2012) et commercialisées depuis plusieurs centaines d’années. L’utilisation de ces holothuries dans l’alimentation humaine a débuté en Chine depuis 1000 ans. Face à la demande grandissante des marchés asiatiques, les holothuries ont commencé à être surexploitées à partir du 18ème et du 19ème siècle. En dépit de la forte proportion de ces animaux parmi les espèces benthiques, peu de documentation existe. Récemment, l’intérêt pour l’obtention de ces données a fortement augmenté pour différentes raisons :
– Une demande grandissante pour ces produits
– L’épuisement de certaines espèces
– L’extension des zones de pêches
– Le développement de la mariculture
– Un intérêt grandissant sur les ressources biologiques et leur gestion.
Les 5 zones de pêche majoritaires d’holothuries au niveau mondial sont : Papouasie Nouvelle Guinée (Océanie), Philippines (Asie); Seychelles (Afrique et Océan Indien), les Iles Galápagos (Amérique Latine et Caraïbes) et la pêche de Cucumaria frondosa centré sur le Canada (Zones tempérés de l’hémisphère Nord). Au travers de ces 5 zones, le nombre d’espèces exploitées varient beaucoup, avec le plus grand nombre retrouvé en Asie (52 espèces) et dans le Pacifique (36 espèces), dû majoritairement à la grande diversité d’espèces de ces zones. Ces pêches dans les zones tropicales indopacifiques sont donc majoritairement multi-spécifiques et généralement mono-spécifiques dans les zones tempérées (FAO, 2004). L’estimation de la quantité d’holothuries pêchées par région est présentée dans le Tableau V.

Situation de la pêche au Nouveau-Brunswick

Entre 1999 et 2006 au Nouveau-Brunswick, deux titulaires de permis de pêche ont été autorisés à pratiquer une pêche expérimentale de l’Holothurie de stade I dans la Zone de Pêche du Homard (ZPH 36) dans le Sud-Ouest du Nouveau-Brunswick (SONB) dans le but d’évaluer leur matériel et le potentiel commercial de l’espèce. Chaque année, la pêche expérimentale est pratiquée de janvier à mars. Depuis 1999, chaque titulaire de permis doit présenter un document de vérification à quai et un journal scientifique du Ministère des Pêches et des Océans (MPO) dans lequel est consigné l’emplacement des traits, les prises, les profondeurs et la hauteur des vagues.
En 2006, 5 zones ont été créées autour du secteur où était principalement déployé l’effort de pêche (Figure 16). Une de ces zones, celle du port de St. Andrews, a été interdite à la pêche en vue d’en faire un secteur de recherche possible. Un Total Autorisé de Captures (TAC) a été assigné à chacune des quatre autres zones pour une pêche expérimentale pendant la saison de 2006 (1010 t) dans Les Passages et 120 t dans chacune des trois autres zones: rivière Magaguadavic, sud de l’île Deer et fond de la baie Passamaquoddy, en fonction des débarquements annuels moyens des cinq années précédentes.
Avant la saison de pêche de 2007, le MPO a autorisé le passage du stade expérimental I au stade exploratoire II pour la pêche de l’Holothurie dans le SONB afin de connaître la durabilité de cette pêche et ses effets sur les écosystèmes. Les conditions de surveillance et de collecte de données scientifiques établies pour le stade I ont été maintenues en 2007-2008, de même que les TAC et les zones de pêche.
Depuis 1999, plus de 80 % des prises proviennent d’une seule zone de pêche appelée « Les Passages », où a été déployé 90 % de l’effort de pêche. Les débarquements ont augmenté jusqu’à atteindre un maximum d’environ 1 600 t en 2005. Depuis, ils se sont maintenus à environ 1 100 t, ce qui pourrait être attribuable aux zones de pêche définies et à l’établissement du TAC global de 1 370 t avant la saison de pêche de 2006. L’effort a culminé en 2005 pour se stabiliser à des taux inférieurs entre 2006 et 2008. Dans le fond de la baie Passamaquoddy, au sud de l’île Deer et dans la rivière Magaguadavic, l’effort a été très faible (8,87 et 19 h respectivement) en raison de la couverture de glace et des mauvaises conditions météorologiques (Rowe et al., 2009).

Marchés et produits

Alimentation humaine

Le produit issu du concombre de mer le plus commercialisé est la peau séchée sous le nom « bêche de mer, trépang ou hai-san » destiné à l’alimentation humaine et considéré comme un mets de grande qualité. Ces produits sont majoritairement destinés au marché asiatique. Une large majorité d’espèces sont récoltées pour le marché du trépang (ex : Actinopyga mauritania, Holothuria scabra, Thelenota ananas) et d’autres espèces sont également consommées cuites, marinées et crues (ex : Apostichopus japonicus, Parastichopus californicus, Cucumaria frondosa) (FAO, 2012).
Les produits principaux provenant de C. frondosa dans l’état du Maine (USA) sont : (i) les muscles subissant un conditionnement sous vide puis congelés et (ii) la peau cuite puis séchée (Figure 17). La peau cuite à la vapeur pendant 60 min avec une concentration en chlorure de sodium (NaCl) de 3% est ensuite séchée à température ambiante dans un premier temps puis à 60°C dans un second temps. (Hamel et Mercier, 2008a).
Au Nouveau Brunswick, les animaux sont pesés puis soumis à une chaleur de 40°C afin de relaxer les corps. Ils sont ensuite coupés dans le sens de la longueur et maintenus par un clip sur une planche à découper. Un racloir muni d’une lame en acier inoxydable est placé sur le haut du concombre de mer et descend de haut en bas afin de séparer les muscles de la peau. Les muscles sont alors empaquetés sous vide et congelés. Les peaux sont cuites durant 1 à 2 heures, puis séchées dans un séchoir à 60°C. A l’Est du Canada et plus particulièrement à Terre Neuve, plusieurs nouveaux produits issus de C. frondosa ont été testés incluant : (i) la peau cuite, salée et séchée avec la viande attachée ; (ii) les muscles et la peau (congelés frais) ; (iii) le bulbe aquapharyngé (autrement nommé fleur), les viscères, les gonades et le tronc respiratoire (congelés frais et conditionnés séparément) ; et, (iv) la peau et les muscles congelés frais et séparés. L’industrie teste ces produits depuis quelques années afin de s’adapter au marché asiatique (Hamel et Mercier, 2008a).
Les organes internes, le liquide cœlomique et le bulbe aquapharyngé restent considérés comme des sous-produits ou coproduits et représentent une masse de matière première peu ou pas valorisés générant des quantités importantes de rejets pour les industries de transformation. Au nouveau Brunswick, ces coproduits représentent environ 50% de la masse totale de la matière première. Comme, il a été vu précédemment, les concombres de mer possèdent une composition nutritionnelle intéressante due à une forte teneur en protéines et une grande chimiodiversité. Ces coproduits doivent donc être considérés comme un gisement de biomasse important et nécessitent d’être valorisés.

Médecine traditionnelle et produits nutraceutiques

Les concombres de mer sont utilisés depuis des centaines d’années en Chine comme aliments mais aussi en médecine traditionnelle (Fredalina et al., 1999). Dans certains pays, des produits cosmétiques sous forme de crème, shampoing ou dentifrice (FAO, 2008), et des produits nutraceutiques sont commercialisés comme l’huile de concombre de mer (Baine et Choo, 1999). Ces propriétés médicinales ont été confirmées par les travaux sur l’huile rouge en Malaisie (ou « Gamat » qui signifie en Malais tout produit issu du concombre de mer ayant des propriétés médicinales). Cette huile issue des viscères et des membranes de C. frondosa a été utilisée comme adjuvant, dans des études sur l’arthrite chez le rat, afin de tester ses propriétés anti-inflammatoires (Colin, 2002). Il est connu que C. frondosa contient des composés pouvant inhiber certaines prostaglandines impliquées dans la douleur et l’arthrite. Ces animaux sont également riches en chondroïtine, mucopolysaccharides, mais aussi en plusieurs vitamines et minéraux, nutriments nécessaires au bon fonctionnement de l’os et du cartilage chez l’homme.
En Amérique du Nord, les coproduits de C. frondosa sont fabriqués comme complément alimentaire sous forme de chondroïtine (Nutrisea®), vendus comme traitement contre l’arthrite chez l’homme (ArthriSea® et SeaCuMAX®) et chez les animaux (SeaJerky®) (Janakiram et al., 2010). Ce coproduit est également commercialisé comme compost dans le Maine. Il a été noté un accroissement de la demande de ces produits en Russie afin de produire à la fois dans l’alimentaire et dans le cosmétique (FAO, 2008). Les données concernant ces produits restent, cependant, très rares.

Activités antimicrobiennes des métabolites et extraits d’holothuries

Généralités

Les organismes marins représentent une source extraordinaire de métabolites possédant de multiples activités biologiques. Ceci est dû à l’immense diversité des espèces peuplant les océans (plus de 300 000 espèces d’animaux et de végétaux décrites), mais aussi par le développement de systèmes de défense pour faire face à la prédation, à la compétition pour leurs substrats et aux pressions écologiques (Donia et Hamann, 2003 ; Kalinin et al., 2008 ; Mayer et al., 2009 ; Yasuhara-Bell et Lu, 2010 ; Bordbar et al., 2011 ; de Jesus et al., 2013 ; Hayes, 2013). Parmi ces molécules, il est important de mentionner la notion de métabolites primaires et secondaires. Les métabolites primaires (acides aminés, vitamines, acides gras, sucres) sont les composés structurels des cellules ou des organes et interviennent dans les grandes fonctions vitales de l’organisme. Les métabolites secondaires sont dérivés des métabolites primaires. Ces substances, dites allélopathiques, ne sont pas essentielles aux mécanismes vitaux mais assurent des fonctions de communication (signaux ou médiateurs) et de protection (Hossaert-McKey et al., 2012). Dans le monde marin, les métabolites secondaires de protection passent par la simple émission de composés répulsifs dans le but de dissuader l’attaque (aposématisme) jusqu’à la production de toxines extrêmement délétères pour le prédateur.
Face à l’émergence de maladies infectieuses et au développement de phénomènes de résistance aux médicaments, les molécules marines issues des organismes marins et plus particulièrement des invertébrés marins représentent un réel enjeu de santé mais aussi un enjeu économique par le développement de nouveaux médicaments. A titre d’exemples, le Ziconotide isolé d’un cône (mollusque gastéropode) est préconisé lors de douleurs intenses, le Yondelis™ et l’Aplidin™ isolés d’une ascidie sont utilisés respectivement dans le traitement des cancers de l’ovaire et comme agent antitumoral (Pettit et al., 2000 ; Haefner, 2003).
A la base de leur système de défense, les holothuries peuvent entre autre émettre des molécules fortement toxiques en permanence et/ou en situation de stress (Caulier et al., 2011 ; Van Dyck et al., 2011). Un système de défense retrouvé chez les genres Holothuria et Mulleria constitué par les tubes de Cuvier (organes de défense) consiste à projeter sur son assaillant des filaments blanchâtres fortement adhésifs dans le but de l’engluer et par conséquent de le dissuader à attaquer (Kornprobst, 2005).
Nigrelli (1952) et Yamanouchi (1955) ont décrit le caractère toxique de substances issues des téguments d’holothuries en se basant sur d’anciens rapports. A Guam et dans d’autres régions Indopacifiques, les indigènes se servaient du jus de certaines espèces d’holothuries qu’ils versaient dans certains lagons coralliens afin de faciliter la pêche des poissons. Les poissons étaient ensuite bouillis plusieurs fois afin de perdre cette toxicité (Nigrelli, 1952). Le caractère toxique de ces substances isolées d’Holothuria vagabunda, nommées alors holothurines, a été évalué sur plusieurs modèles animaux (crustacés et mollusques, annélides, poissons, amphibiens, lapins et souris). Parallèlement, il a été démontré que l’holothurie placé dans un aquarium avec des poissons marins (Enedrias nebulosus, Girella punctata, Pomacentrus coelestis, Plotosus anguillaris et Thallosoma cupido) ou d’eau douce (Carasius auratus et Oryzias latipes) n’entraînait pas de modification du comportement des poissons. Cependant, lorsque le tégument de l’holothurie était « gratté » par la lame d’un couteau, un fluide brun/violet diffusait dans l’eau entraînant alors une modification rapide du comportement des poissons conduisant à la mort (Yamanouchi ; 1955). Van Dyck et al. (2011) ont vérifié cette ichtyotoxicité à partir de l’holothurie Holothuria forskali en la plaçant avec les poissons d’eau de mer Coris julis et Symphodus ocellatus. Les auteurs ont isolé ces molécules relarguées en situation de stress, et ont décrit 26 glycosides triterpéniques à partir des tubes de Cuvier et 12 à partir du tégument après avoir fait subir à l’animal un stress mécanique (coups réguliers sans blesser l’animal).
La partie suivante a pour objet de faire une synthèse des extraits et des composés actifs antimicrobiens isolés des holothuries actuellement décrits. Ce travail de synthèse est présenté dans le Tableau VI.

Activité antifongique

L’activité antimicrobienne la plus étudiée est l’activité antifongique (Tableau VI). Les extraits ayant démontrés des activités antifongiques sont des extraits éthanoliques, méthanoliques et aqueux de téguments, de fluide cœlomique et des tubes de Cuvier (Ridzwan et al., 1995 ; Jawahar et al., 2002 ; Ismail et al., 2008 ; Mokhlesi et al., 2012). Ces extraits n’ayant pas été purifiés, la nature des molécules responsables de l’activité ne peut être reliée de manière certaine, cependant de récentes études ont démontré que les tubes de Cuvier et le tégument de certaines holothuries étaient riches en saponines et plus spécifiquement des glycosides triterpéniques (Rodriguez et al., 1991 ; Van Dyck et al., 2010a et b ; Van Dyck et al., 2011). Cette hypothèse est renforcée par le fait que les molécules purifiées étant responsable de l’activité antifongique sont des glycosides triterpéniques, extraits par des solvants alcooliques. Plusieurs critères semblent être corrélés à l’activité antifongique, il apparaît que la présence de la fonction lactone dans la partie aglycone, la longueur et la composition de la chaîne glucidique et la présence et la position de groupements sulfates sont des éléments majeurs modulant l’activité (Kalinin et al, 2008). A titre d’exemple, le Bivittoside C (Figure 18) possède une activité antifongique à la différence du dérivé Bivittoside A (Figure 18) dépourvu de fonction lactone qui ne présente pas ce genre d’activité.

Activité antibactérienne

Les extraits démontrant une activité antibactérienne sont des extraits éthanoliques, aqueux et insaponifiable de tégument et de spécimen entier. Ces extraits n’ayant également pas été purifiés, la classe chimique des molécules actives n’a pu être reliée directement à l’activité. Cependant, comme pour l’activité antifongique, il est supposé que l’activité antibactérienne de ces extraits est liée à la présence de glycosides triterpéniques, et notamment à la fraction insaponifiable (fraction résiduelle soluble dans les solvants organiques après saponification) active de Holothuria atra (Jawahar et al., 2012).
Parmi les composés isolés d’holothuries possédant des activités antibactériennes, 3 concernent des peptides isolés et purifiés par filtration centrifuge ou chromatographie liquide en phase inverse (RP-HPLC) à partir des espèces Actinopyga lecanora (Ghanbari et al., 2012), Cucumaria frondosa (Beauregard et al., 2001) et Holothuria tubulosa (Schillaci et al., 2013), dont un hydrolysat enzymatique (Ghanbari et al., 2002). Ces peptides sont des molécules de faibles poids moléculaires connus pour posséder un spectre large d’activités antifongique, antivirale et antibactérienne. Ils sont chargés positivement et possèdent un caractère amphiphile (molécule possédant à la fois un caractère hydrophile et hydrophobe) permettant à ces molécules d’être solubles en environnement aqueux mais également de pouvoir pénétrer les membranes riches en lipides et ainsi détruire la cellule cible par différents mécanismes (Schilaci et al., 2013).

Activité antivirale

Les métabolites extraits des holothuries à activités antivirales appartiennent majoritairement à la famille des glycosides triterpéniques et ont été extraits à partir de l’animal entier, le tégument et les tubes de Cuvier par des solvants alcooliques. Les cucumarioside A2-2 et cucumarioside A4-2 isolés de Cucumaria japonica ont montré une inhibition de l’effet cytopathique du virus de la stomatite vésiculaire (VSV), du poliovirus et d’autres virus (Grishin et al., 1991). Les holothurinosides A, C et D isolés de Holothuria forskalii ont montré une inhibition de l’effet cytopathique sur le VSV (Rodriguez et al., 1991).
Enfin, les liouvillosides A et B (Figure 19) et les thyonosides A et B isolés de Staurocucumis liouvillei (Maier et al., 2001) et de Thyone aurea (Bonnard et Rinehart, 2004) ont montré respectivement un effet antiviral sur le Virus Herpes Simplex de type 1 (VHS-1). Un extrait brut isolé d’Holothuria sp. a montré une activité anti-VHS-1, et notamment un effet inhibiteur sur l’adsorption virale aux cellules ainsi qu’un effet au niveau de la réplication intracellulaire (Farshadpour et al., 2014). Le mécanisme antiviral des glycosides triterpéniques extraits des holothuries semblerait être relié à un phénomène de protection au niveau membranaire lors du contact entre la cellule et le virus (Kalinin et al., 2008). La cucumariaxanthine C est un caroténoïde isolé de Cucumaria japonica (Tsushima et al., 1996) ayant démontré une forte activité inhibitrice sur le virus Epstein-Barr. La chondroïtine sulfate fucosylée isolée de Thelenota ananas (Figure 20) a montré un effet inhibiteur sur la réplication de plusieurs souches de Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH) (Huang et al., 2013 ; Lian et al., 2013).

Le rapport de stage ou le pfe est un document d’analyse, de synthèse et d’évaluation de votre apprentissage, c’est pour cela rapport-gratuit.com propose le téléchargement des modèles complet de projet de fin d’étude, rapport de stage, mémoire, pfe, thèse, pour connaître la méthodologie à avoir et savoir comment construire les parties d’un projet de fin d’étude.

Table des matières

Etude bibliographique
1 Présentation de Cucumaria frondosa
1.1 Généralités
1.2 Biologie et reproduction
1.3 Ecologie
1.4 Composition chimique
1.4.1 Composition générale
1.4.2 Caroténoïdes
1.4.3 Glycosphingolipides
1.4.4 Oligosaccharides et polysaccharides sulfatés
1.4.5 Stérols et triterpènes
1.4.6 Glycosides triterpéniques
1.4.7 Dérivés azotés originaux de Cucumaria frondosa
1.4.8 Lectines
1.4.9 Peptides
1.5 La ressource et la pêche d’holothuries
1.5.1 Situation de la pêche au niveau mondial
1.5.2 Situation de la pêche au Nouveau-Brunswick
1.6 Marchés et produits
1.6.1 Alimentation humaine
1.6.2 Médecine traditionnelle et produits nutraceutiques
2 Activités antimicrobiennes des métabolites et extraits d’holothuries
2.1 Généralités
2.1.1 Activité antifongique
2.1.2 Activité antibactérienne
2.1.3 Activité antivirale
3 Procédés d’extraction
3.1 Généralités
3.2 Extraction par solvants
3.3 Hydrolyse enzymatique
3.4 Enzymes : définition et classification
3.5 Principe de l’hydrolyse enzymatique
3.6 Paramètres d’hydrolyse
Chapitre I : Recherche de molécules à activités antiherpétiques issues de coproduits de Cucumaria frondosa
4 Introduction
5 Matériels & Méthodes
5.1 Préparation des spécimens de Cucumaria frondosa
5.1.1 Collecte des spécimens et maintien en vie en bassin
5.1.2 Dissection des spécimens
5.2 Préparation des extraits
5.2.1 Extraction séquentielle solide-liquide par solvants organiques et aqueux
5.2.2 Hydrolyse enzymatique
5.2.2.1 Choix des enzymes
5.2.2.2 Conditions d’hydrolyse
5.3 Activités biologiques
5.3.1 Cellules Vero
5.3.1.1 Milieu de culture
5.3.1.2 Entretien des cellules Vero
5.3.1.3 Conservation des cellules Vero
5.3.1.4 Décongélation et mise en culture des cellules
5.3.2 Le Virus Herpes Simplex, VHS-1
5.3.2.1 Préparation du stock viral
5.3.2.2 Détermination du titre infectieux de la suspension virale stock
5.3.2.3 Titration selon la méthode de Reed et Muench (1938)
5.3.2.4 Titration par mesure de la viabilité cellulaire : coloration au rouge neutre
5.4 Evaluation des activités biologiques
5.4.1 Activité cytotoxique
5.4.1.1 Evaluation de l’activité par viabilité cellulaire (Rouge neutre)
5.4.1.2 Evaluation de la cytotoxicité par détermination de la Concentration Cytotoxique à 50%
5.4.2 Activité antivirale
5.4.2.1 Evaluation de l’activité par viabilité cellulaire (Rouge neutre)
5.4.2.2 Evaluation de l’activité anti-VHS-1 des extraits sur les cellules Vero par détermination de la concentration effective à 50% (CE50)
5.4.2.3 Acyclovir : substance antiherpétique de référence
5.5 Méthodes de caractérisation biochimique
5.6 Méthodes de fractionnement par poids moléculaire
6 Résultats & discussion
6.1 Librairie d’extraits
6.2 Evaluation de l’activité antivirale de la librairie d’extraits
6.2.1 Evaluation de la cytotoxicité
6.2.2 Evaluation de l’activité antivirale
6.3 Compositions biochimiques des extraits efficaces
6.4 Cinétique d’activités antivirales des extraits efficaces
6.5 Fractionnement bioguidé par poids moléculaire de l’extrait hydrolysé par la papaïne
Chapitre II : Etude des métabolites secondaires de Cucumaria frondosa
7 Introduction
8 Matériels & Méthodes
8.1 Matériel biologique
8.1.1 L’holothurie Cucumaria frondosa
8.1.1.1 Collecte des spécimens et maintien en vie en bassin
8.1.1.2 Production de métabolites secondaires
8.1.1.3 Extraction et fractionnement par chromatographie échangeuse d’ions de l’EMSR
8.1.2 Omble chevalier Salvelinus alpinus
8.1.3 Truite arc-en-ciel Oncorhynchus mykiss
8.1.4 Huître américaine Crassostrea virginica
8.2 Evaluations écotoxicologiques
8.2.1 Analyses histopathologiques et nécropsies
8.2.2 Etude de létalité aigüe sur la truite arc-en-ciel (CL50-96h)
8.2.2.1 Conditions d’acclimatation
8.2.2.2 Conditions d’essais
8.2.2.3 Concentrations testées
8.2.3 Evaluation de l’effet de l’EMSR de C. frondosa sur un modèle de toxicité aigüe: L’huître américaine Crassostrea virginica
8.2.3.1 Conditions de cultures
8.2.3.2 Concentrations d’EMSR de C. frondosa testées
8.2.3.3 Mesures des paramètres
8.2.3.4 Prélèvements et dissections
8.2.3.5 Dosage de l’ammoniac
8.2.4 Dosages des biomarqueurs
8.2.4.1 Dosage des protéines par la méthode de Bradford
8.2.4.2 Dosage de la Glutathion-S-transférase
8.2.4.3 Dosage du MalonDiAldéhyde
8.2.4.4 Dosage de la catalase
8.2.4.5 Dosage de l’acétylcholine estérase
8.2.4.6 Etudes statistiques
8.3 Evaluation cytotoxique
8.4 Méthodes de purification et d’analyse chimiques
8.4.1 Analyse et fractionnement par chromatographie liquide haute performance
8.4.2 Spectrométrie de masse
9 Résultats et discussion
9.1 Production d’EMSR de Cucumaria frondosa en situation de stress
9.2 Détermination de l’effet de l’EMSR sur l’Omble chevalier au niveau physiologique
9.3 Détermination de la CL50-96h de l’EMSR sur la truite arc-en-ciel
9.4 Détermination de l’effet de l’EMSR sur C. virginica
9.4.1 Préambule
9.4.2 Mesures des paramètres environnementaux
9.4.3 Mesure de l’ammoniac
9.4.4 Caractéristiques des échantillons de Crassostrea virginica
9.4.5 Éthologie et mortalités cumulées
9.4.6 Dosages des biomarqueurs
9.4.6.1 Effet de l’EMSR sur la quantité de GST dans la glande digestive
9.4.6.2 Effet de l’EMSR sur la quantité de MDA dans la glande digestive
9.4.6.3 Effet de l’EMSR sur la quantité de CAT dans la glande digestive
9.4.6.4 Effet de l’EMSR sur la quantité d’AchE dans la glande digestive
9.5 Fractionnement bioguidé des métabolites secondaires toxiques de C. frondosa
9.5.1 Analyse des EMSR par LC-PAD
9.5.2 Fractionnement bioguidé par LC-PAD
9.5.3 Evaluation de la cytotoxicité des fractions isolées par HPLC semi-préparative
9.6 Caractérisation de l’EMSR par spectrométrie de masse (LC Q-TOF HRMS)
9.6.1 Spectrométrie de masse en mode positif de l’EMSR
9.6.2 Spectrométrie de masse en mode négatif de l’EMSR
Conclusion générale & perspectives
Références bibliographiques

Télécharger le rapport complet

Télécharger aussi :

Laisser un commentaire

Votre adresse e-mail ne sera pas publiée. Les champs obligatoires sont indiqués avec *