ABONDANCE DES BACTÉRIES CULTIVABLES

CONDITIONS EXPÉRIMENTALES

L’expérimentation s’est déroulée à la station aquicole de Pointe-au-Père (Québec) durant l’élevage larvaire de plie rouge. L’échantillonnage consistait au suivi microbiologique d’eau récoltée dans quatre bassins d’élevage de 55 litres (38 cm * 66 cm) lors de deux séries d’élevage larvaire de 26 jours. La première série a été effectuée durant les mois de mai et juin 2005 tandis que la seconde série a été réalisée à la même période en 2006. L’eau se trouvant dans les bassins provenait de l’estuaire du Saint- Laurent, et était filtrée à travers un lit de gravier avant l’introduction dans les bassins. Durant l’expérimentation, différents régimes alimentaires ont été fournis aux rotifères alimentant les larves, afin de tester l’effet du régime alimentaire sur la dynamique des communautés bactériennes et la croissance larvaire. En 2005, le premier régime alimentaire était une formulation sèche commerciale appelée Selco 3000 (INVE, Inc.) (<< Commercial ») tandis que le second régime alimentaire consistait en un mélange expérimental à biomasse égale de trois microalgues reconnues pour leur haute teneur en AG essentiel (c.à.d. Nannochloropsis sp., Chaetoceros muelleri et Isochrysis galbana) (<< Expérimental 1 »). En 2006, deux nouveaux régimes alimentaires ont été testés. Le premier consistait en une combinaison de la formulation sèche Easy Selco (INVE, Inc.) et des trois espèces de microalgues utilisées en 2005 à biomasse égale (<< Expérimental 2 »). Le deuxième consistait en cette même composition à laquelle un supplément artificiel d’acide arachidonique (AA) était ajouté (1 flg de AA pour 106 cellules de phytoplancton) (<< Expérimental 3 »). Chaque régime alimentaire était testé sur deux bassins contenant environ 14000 larves.

STRATÉGIE D’ÉCHANTILLONNAGE

Les échantillons d’eau ont été prélevés à des journées spécifiques, soit aux jours 4, 15 et 26 de la croissance larvaire. En 2006, un prélèvement d’eau additionnel a été fait au jour 0, correspondant à la signature de l’eau se trouvant dans les bassins avant l’introduction des larves. Ce prélèvement correspondait à notre témoin initial. Le jour 4, correspond à l’ouverture de la bouche des larves et au début de l’alimentation en rotifères, le jour 15, au milieu de la croissance larvaire et le jour 26, à l’arrêt de l’alimentation en rotifères et au passage à un régime alimentaire à base d ‘ artémies. Deux échantillons de contrôle ont été prélevés à chaque temps d’échantillonnage, l’eau de mer entrante dans les bassins ainsi que l’eau verte alimentant les bassins. L ‘ eau verte, constituée par un ajout de microalgues, permet d’accroître la turbidité dans les bassins et elle est essentielle à une bonne croissance larvaire en plus de faciliter la propension des larves à trouver les proies (Lee, 2003). En 2006, à la suite des résultats de 2005, le témoin d’eau verte a été supprimé, et remplacé par des prélèvements d ‘ eau des milieux de croissance des rotifères.

Le volume d’eau verte introduit dans les bassins d’élevage est négligeable (quelques mL) étant donné la forte concentration de cellules phytoplanctoniques de cette eau (6,82 X 108 cellule/L) comparativement à celui introduit via l’alimentation en rotifères qui équivaut à plusieurs litres (Cf. environ 5 individus/mL) (Laurence, 1977). De plus, les cultures de rotifères nécessitent la présence d’une communauté bactérienne dans leur milieu d’élevage pour obtenir une croissance optimale (Rombaut et al., 2001 ) et, sont susceptibles de véhiculer des communautés bactériennes différentes de celles introduites par l’eau de mer entrante et, ainsi être une contribution non négligeable pour le développement des bactéries dans les bassins. A chaque temps d’échantillonnage, deux échantillons de 500 mL ont été récoltés. Ces échantillons ont été par la suite analysés au laboratoire d’écologie microbienne (ISMER) dans un délai de 4 heures.

Diversité des bactéries cultivables Après une culture de 24 heures en bouillon marine broth, 1 mL de la culture clonale a été prélevé et transféré dans un tube stérile de 1,5 mL. Chacun des tubes a été centrifugé pendant 5 minutes à 12 000 rpm. Les culots obtenus ont été lavés avec 1 mL d ‘eau saline EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) à pH 8 (0,5 M de chlorure de sodium [NaCI] et 0,01 M EDT A), et centrifugés pendant 5 minutes à 12 000 rpm. 300 ILL d’une solution contenant 1 mg de lysozyme dans 1 mL d’eau saline EDTA ont été ajoutés aux culots, et incubés pendant 30 minutes à température ambiante. 200 ILL de SDS 10% (sulfate de sodium dodecyl) ont été ajoutés, et mis en agitation pendant 5 minutes avant l’ajout de 25 ILL de protéinase K (20 mg/mL). Afin d’obtenir une lyse optimale, les tubes ont été incubés pendant 2 heures à 37°C dans un bain-marie. L’ADN de chaque souche a été extrait par l’ajout d’un volume de phénolchloroforme- isoamyl alcool (25 :24: 1) suivi d’une centrifugation de 15 minutes à 12 000 rpm.

Cette opération a été réalisée deux fois au cours desquelles la phase aqueuse a été conservée. Un volume d’isopropanol 100% a été ajouté à la phase aqueuse, et agité jusqu’à l’obtention d’une pelote d’AGN, et les tubes ont été centrifugés pendant 10 minutes à 12 000 rpm. Le surnageant a été éliminé et le culot a été lavé avec 1 mL d’éthanol 70% suivi d’une centrifugation de 10 minutes à 12000 rpm. Les tubes ont été séchés à l’air pendant 10 minutes et le culot repris dans 100 Il,L d’eau stérile. Les tubes ont été congelés à -20°C jusqu’à l’amplification de l’ADN par PCR (Agogué et al., 2005 ; Dumestre et al. , 2001).

Le gène 16S de l’ADNr est un gène très conservé dans les espèces bactériennes et couramment utilisé pour analyser la diversité bactérienne d ‘échantillons environnementaux (Sugita et al., 2005 ; Gonzâlez et al., 2004 ; Sandaa et al., 2003 ; Nicolas et al., 1996). Un ensemble d’amorces universelles a été utilisé : (1) Sadir (5′- AGA-GTT-TGA-TCA-TGG-CTC-AGA-3′), (2) S17 Rev (5’-GTT-ACC-TTG-TTACGA- CTT -3 ‘) selon le protocole de Agogué et al. (2005). Le mélange réactionnel consistait en 5 ILL de tampon PCR 10X (QIAGen), 200 ILM d’un mélange de déoxynucléotide triphosphate (Biolabs Inc., New England), 50 pmol de chaque amorce, 1 U de Hotstar Taq polymérase (QIAGen), 1 Il,L d’ADN dans 50 ILL d’eau stérile. L’amplification a été réalisée à l’aide d’un thermocycleur de type MyiQTM thermal cycler (Bio-Rad) selon le schéma suivant: une dénaturation initiale à 94°C pendant 15 minutes, suivi par 30 cycles de 30 secondes de dénaturation à 94°C, 1 minute d’hybridation des amorces à 48°C et une minute d’élongation à n °c. L’ élongation finale a été réalisée à n oc pendant 10 minutes. Les amplicons résultants ont été révélés sur un gel d’ agarose 1 % à 90 volts pendant 75 minutes.

Après un marquage au bromure d’éthidium les gels ont été analysés sous rayonnement UV à l’aide de l’appareil Alphalmager® HP (Alphalnnotech). Par la suite, les ampli cons ont été purifiés à l’aide de colonne de purification MinElute® (QIAGen) selon les recommandations du manufacturier. Le dosage de chaque amplicon a été effectué à l’aide d’un spectrophotomètre DU®800 (Beckman-Coulter) à la longueur d’onde de 260 nm correspondant à la longueur d’onde d’absorption de l’ADN. Ainsi, la concentration d’amplicon dans chacun des échantillons a pu être calculée (Lem arch and et al., 2005). Les RFLP ont été réalisés par la digestion des amplicons par l’enzyme de restriction HinPlI selon le protocole de Agogué et al. (2005), dans le tampon Nebuffer2 (Biolabs, New England) à 3rC pendant 16 heures. Les empreintes génétiques des souches bactériennes ont été révélées par migration électrophorétique sur un gel d’agarose 1,5% dans les mêmes conditions que pour l’amplification d’ADN (e.g. paragraphe 2.3.4.1). Les produits de la digestion représentaient une empreinte génétique pour chaque souche bactérienne isolée. Les gels ont été comparés entre eux grâce au logiciel Alphalmager® HP (Alphalnnotech).

Diversité des bactéries totales

Entre 20 et 100 mL d’eau ont été filtrés en duplicata sur des filtres de polycarbonate (PC) blanc de 25 mm de diamètre et de porosité 0,2 /lm (ISOPORE TM), dépendamment de la turbidité des échantillons et du colmatage subséquent des filtres, ceux-ci ont été congelés à -20°C avant d’effectuer les extractions d’ADN nécessaires. Les filtres ont été coupés en petits morceaux à l’aide d’un scalpel stérile et transférés dans un tube stérile de 1,5 mL. Dans chacun des tubes, 840 JlL de tampon de lyse à pH 8 (40 mM EDTA, 50 mM T!UZMA base et 0,75 M de sucrose) et 50 JlL de lysozyme (20 mg/mL) ont été ajoutés, et les tubes ont été incubés à 37°C dans un bainmarie pendant 45 minutes selon le protocole développé à l’ observatoire océanologique de Banyuls sur mer par Jean-François Ghiglione (communication personnelle). Ensuite, 100 JlL de SDS 10% et 10 JlL de protéinase K (20 mg/mL) ont été ajoutés avant incubation pendant 1 heure à 55°C. L’ADN a été extrait par l’ajout de 900 JlL de phénol-chloroforme-isoamyl-alcool (25 :24: 1) suivi par une centrifugation de 10 minutes à 12 000 rpm. Cette opération a été réalisée deux fois en conservant la phase aqueuse. Ensuite, un volume de 800 JlL de chloroforme-isoamyl alcool (24: 1) a été ajouté suivi d’une centrifugation de 10 minutes à 12000 rpm en conservant la phase aqueuse. Après l’ ajout d ‘ un volume d’isopropanol 100%, les tubes ont été congelés à – 20°C pendant 2 heures pour permettre la précipitation de l’ADN. Les tubes ont été centrifugés pendant 30 minutes à 13 200 rpm. Après l’élimination du surnageant, 500 JlL d’éthanol 70% ont été ajoutés, et centrifugés pendant 20 minutes à 13 200 rpm. Le surnageant a été éliminé, et les tubes ont été placés dans un évaporateur Vacufuge ™ (Eppendorf) pendant 20 minutes pour éliminer l’éthanol. Finalement, 5 pL de RNase A (10 mg/mL) ont été ajouté pour digérer l’ARN présent dans les tubes.

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Table des matières

REMERCIEMENTS
RESUME
TABLE DES MATIERES
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES FIGURES
1. INTRODUCTION
2. MATÉRIEL ET MÉTHODES
2.1 CONDITIONS EXPÉRIMENTALES
2.2 STRATÉGIE D’ÉCHANTILLONNAGE
2.3 ANALYSES MICROBIOLOGIQUES
2.3.1 Dénombrement des bactéries cultivables
2.3.2 Dénombrement du pathogb e Vibrio sp
2.3.3 Dénombrement des bactéries totales par cytométrie en flux
2.3.4 Analyse de la diversité bactérienne
2.3.4.1 Diversité des bactéries cultivables
2.3.4.2 Diversité des bactéries totales
2.4 ANALYSES STATISTIQUES
3 RÉSULTATS
3.1 ABONDANCE ET STRUCTURE DES COMM UNAUTÉS BACTÉRIENN ES
3.2 ABONDANCE DES BACTÉRIES CULTIVABLES
3.3 ABONDANCE DU PATHOGÈNE V/BRiO SP
3.4 STRUCTURE GÉNÉRALE DES COMMUNAUTÉS BACTÉRIENNES
3.4.1 Diversité des bactéries cuItlvables
3.4.2 Diversité des bactéries totales
4 DISCUSSION
5 CONCLUSION
6 REFERENCES
7 ANNEXE 1